Vloeistofchromatografie (HPLC)

Vloeistofchromatografie (HPLC)

• Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) is een vorm van vloeistofchromatografie.
• Het wordt gebruikt voor stoffen die lastiger vluchtig te maken zijn.
• Bekijk de HPLC filmpjes voor meer inzicht via de volgende links:
  • https://www.youtube.com/watch?v=IUwRWn9pEdg
  • https://www.youtube.com/watch?v=Qf6060arkqM
• Zie de werking van de HPLC kolom (normale en reverse fase) via:
  • https://www.youtube.com/watch?v=MLoitPJQH3g
  • https://www.youtube.com/watch?v=I-CdTU5X4HA

HPLC vs Gaschromatografie (GC)

• HPLC lijkt op gaschromatografie (GC), maar gebruikt vloeistoffen in plaats van gassen.
• HPLC heeft meer scheidingsprincipes dan GC/GLC namelijk:
  • Adsorptie: Moleculen worden geadsorbeerd aan een oppervlak.
  • Verdeling: Moleculen lossen op in een stationaire fase, met een dynamisch evenwicht.
  • Uitsluiting: Kleine moleculen worden vastgehouden in de holtes van de stationaire fase.
  • Ionenwisseling: Scheiding op basis van lading; tegenovergestelde ladingen trekken elkaar aan.
  • Affiniteit: Moleculen passen precies op andere moleculen.

HPLC

• Leer de eenvoudige uiteg over HPLC techniek via deze link: https://www.youtube.com/watch?v=kz_egMtdnL4
• Leer de opbouw van een HPLC via deze link: https://www.youtube.com/watch?v=rXQmy1h9dn8
• Bekende componenten die gebruikt kunnen worden in HPLC zijn onder andere:
  • Anorganische ionen
  • Organische kleurstoffen
  • Aminozuren
  • Eiwitten
  • Suikers
  • Vetzuren

Gepakte Kolommen

• Voor gepakte kolommen zijn kleinere deeltjes, hogere efficiëntie en hogere druk nodig.
• Zie pagina 669 in het boek voor meer info hierover.

Schotelgetal en kolom efficiëntie

• Smallere pieken duiden op een groter schotelgetal en een efficiëntere kolom.
• Het aantal schotels (N) is gelijk aan 16(tr²/w²).
• Dus hoe groter het schotelgetal (N), hoe smaller de pieken bij dezelfde retentietijd.

Piekverbreding en Deemter Vergelijking

• Piekverbreding is het resultaat van verschillende fysische processen.
• De Van Deemter Vergelijking is H = A + B/u + C*u.
  • u is de flowsnelheid.
  • Hoe kleiner H, hoe groter het schotelgetal N.
  • N is kolomlengte gedeeld door H.

HPLC: Schotelhoogte en factoren

• De schotelhoogte bestaat uit 3 bijdragen.
• Met behulp van de Deemter-vergelijking is aan te tonen welke invloed de snelheid van de mobiele fase en de kolom hebben op de hoogte.
• Een efficiënte kolom geeft een lage H waarde.
• A = Eddy diffusie: Moleculen leggen verschillende afstanden af.
  • Dispersie stroming is moeilijker te realiseren in een gepakte kolom dan in een capillaire kolom.
  • Het is een karakteristiek van een bepaalde kolom.
  • Diameter en vorm van de korrel, onderling verschil in diameter, en wijze van stapeling zijn allemaal van invloed op de minimale H waarde.
• B = Moleculaire diffusie: Transport stof is niet alleen afhankelijk van bewegingsrichting m-fase.
  • Diffusie van molecuul in m-fase draagt bij aan de verbreding van de zone.
  • Grotere flow, smallere pieken, want hoe korter verblijftijd, des te minder verbreding.
  • Piekverbreding door diffusie speelt vooral een rol in GC en minder bij LC.
• C = Stofoverdracht: transportweerstand is de weerstand die moleculen ondervinden tijdens de overgang van mobiele naar stationaire fase en andersom.
  • Grotere flow levert bredere pieken.

Van Deemter term

• A-term: Eddy diffusie
• B-term: Longitudinale diffusie. Snellere flow geeft smallere pieken.
• C-term: Evenwichtsinstellingstijd. Snellere flow geeft bredere pieken.
• Bij minimale H geldt: √(B/C) = u(Hmin)

Gepakte kolommen: recentelijke ontwikkelingen

• Gepakte kolommen hebben kleinere deeltjes, hogere efficiëntie en een hogere druk nodig.
• Recentelijk is er 'ultra high pressure equipment' (UPLC) ontwikkeld dat sneller werkt, maar ook kwetsbaarder is
• Een tabel geeft de prestaties weer als functie van de deeltjesdiameter:
  • 5,0 micrometer heeft retentietijd van 30 min, een schotelgetal van 25000 en benodigde druk van 19 bar.
  • 3,0 micrometer heeft retentietijd van 18 min, een schotelgetal van 42000 en benodigde druk van 87 bar.
  • 1,5 micrometer heeft retentietijd van 9 min, een schotelgetal van 83000 en benodigde druk van 700 bar.
  • 1,0 micrometer heeft retentietijd van 6 min, een schotelgetal van 125000 en benodigde druk van 2300 bar.

Stationaire fase bij HPLC

• Normale fase: polaire stationaire fase, meer polair oplosmiddel geeft grotere elutiesterkte.
• Reversed-phase (RP): apolaire stationaire fase, minder polair oplosmiddel geeft grotere elutiesterkte.
• Algemeen: Elutiesterkte neemt toe als de polariteit van de mobiele fase meer overeenkomt met de polariteit van de stationaire fase.
• Covalent gebonden statuionaire fase hierbij is covalent gebonden aan het silica oppervlak waaraan vaak een C18 kolom is gebonden..
  • In dit geval is R een keten van 18 C-atomen.

Kolommen en hun beveiliging

• Kolommen zijn duur.
• Gebruik een guard kolom om de dure kolom te beschermen.

Injectie systeem

• Het injectiesysteem dient reproduceerbaar te zijn
• Een filmpje over injectie HPLC is te vinden via: http://www.restek.com/images/animations/hplcsixport/6_Port_Injector_content.html

Mobiele Fase

• Bij HPLC is dit een vloeistof, het eluens
• Zowel de oplosmiddelen als het eluens dienen zeer zuiver te zijn en tevens ontgast en gefiltreerd.
• Voorbeelden van veelgebruikte kleurloze oplosmiddelen als eluens bij HPLC:
  • Acetonitril
  • Methanol
  • Tetrahydrofuraan
  • Water, vaak een waterige buffer met een bepaalde pH

Isocratische en Gradiënt Elutie

• Isocratische elutie is het elueren met een constant gehouden elutiesterkte.
• Gradiënt elutie is het elueren met een variable elutiesterkte.
• Isocratische elutie van een complex mengsel heeft als nadeel dat of de vroege pieken of de late pieken goed gescheiden zijn, maar niet vroege en late pieken.
• De oplossing hiervoor is gradiënt elutie.
• Hierbij wordt de elutiesterkte van het eluens geprogrammeerd vergroot, zodat de late pieken vlugger van de kolom afkomen.

Detectoren bij HPLC

• Detectoren:
  • UV-VIS (meest gebruikt)
  • Diode-array, werkt als de uv-detector, een groter deel van het spectrum wordt belicht.
  • Brekingsindex, weinig gevoelig, bij gradiënt elutie niet bruikbaar.
  • Fluorescentie, zeer gevoelig voor specifieke analyten.
  • MS Massaspectrometer.
• Een cel met een lichtweg van 1,00 cm heeft bijv. een volume van 8 microliter!
• Wet van Lambert-Beer: A = ε.c.l
• Kies λ met grote ε
• Zie de tabel voor Eluotropic series and ultraviolet cutoff wavelengths of solvents for adsorption chromatography on silica. -Hierin staan een aantal solvents met hun Eluent strength (ε°) en Ultraviolet cutoff (nm)

Mixing solvents

• Meestal worden organic solvents en water gebaseerde solvents gemixt
• Mobile phase : 90% buffer and 10% acetonitril
• Zie https://www.an.shimadzu.co.jp/hplc/support/lib/lctalk/40/40lab.htm
• Zie https://www.shimadzu.com/an/service-support/faq/liquid-chromatography/5-1/index.html voor mee rinfo over column pressure