Visão Geral da Técnica HPLC

Uma técnica analítica usada para separar, identificar e quantificar componentes em uma mistura.

O sistema de HPLC consiste em um conjunto de componentes que trabalham em conjunto para realizar a análise.

O gradiente é alterado durante a eluição, mudando a força da fase móvel.

Uma bomba de HPLC produz uma corrente de líquido com força suficiente para empurrar a fase móvel pela coluna.

Um reservatório de fase móvel com múltiplos solventes que podem ser combinados e misturados.

Um sistema de alta pressão que mistura solventes em uma proporção específica para formar a fase móvel.

Um sistema com duas bombas para um controle preciso da composição da fase móvel.

A coluna é um tubo de vidro ou aço inoxidável contendo material de enchimento (fase estacionária) que separa os componentes da amostra.

A propriedade de uma coluna cromatográfica que descreve sua capacidade de separar os componentes de uma mistura. Um HETP baixo indica uma maior eficiência, resultando em picos mais estreitos e melhor resolução.

A velocidade do fluxo do eluente através da coluna cromatográfica. É expressa em unidades de cm/s.

A capacidade de uma coluna chromatográfica de separar os componentes de uma mistura. É medida pela largura dos picos de eluição.

Um tipo de fase estacionária em HPLC que utiliza partículas de sílica com grupos de hidrocarbonetos ligados à superfície. Essas fases são amplamente utilizadas em separações reversas de fase.

Um tipo de fase estacionária em HPLC que possui um núcleo inerte revestido com uma fina camada de sílica funcionalizada. Isso permite que os analitos sejam separados com alta eficiência.

Um tipo de fase estacionária em HPLC que é composta por polímeros reticulados que formam uma estrutura porosa. Essas fases são frequentemente usadas em separações por exclusão de tamanho.

Um tipo de fase estacionária em HPLC que é composta por polímeros reticulados com um alto grau de reticulação. Essas fases são altamente estáveis em uma ampla gama de pH.

As diferentes categorias de fases estacionárias para HPLC, que representam diferentes tipos de interações entre a fase estacionária e os analitos.

A técnica de cromatografia gasosa (GC) utiliza uma fase móvel gasosa para transportar a amostra através de uma coluna com uma fase estacionária. A separação é baseada na volatilidade e afinidade dos analitos para a fase estacionária.

Na cromatografia gasosa, a amostra precisa ter uma pressão de vapor suficientemente alta para ser volatilizada na temperatura da coluna. Geralmente, a amostra é introduzida na coluna usando um micro-seringa, com um volume típico de 1 a 5 microlitros.

O solvente usado na GC deve ser volátil e ter um ponto de ebulição mais baixo do que os analitos, para garantir que a amostra seja vaporizada e transportada pela fase móvel.

A escolha do detector em GC depende do tipo de analito a ser detectado. Um detector comum é o FID (detector de ionização de chama), que é sensível a compostos orgânicos. Outros detectores incluem TCD (detector de condutividade térmica) e ECD (detector de captura de elétrons).

Em GC, a separação é baseada na volatilidade dos analitos, ou seja, sua facilidade em evaporar. Analitos mais voláteis viajam mais rápido pela coluna e eluem primeiro. A temperatura da coluna pode ser controlada para otimizar a separação dos componentes da amostra.

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica poderosa para separar e quantificar componentes em misturas complexas. Ela funciona forçando um eluente (fase móvel) através de uma coluna contendo um material de embalagem (fase estacionária) que retarda componentes seletivamente. O eluente, contendo os componentes separados, é então detectado por um detector.

A fase normal (NP) ou cromatografia líquido-sólido (LSC) é um tipo de HPLC onde a fase estacionária é polar (por exemplo, sílica) e a fase móvel é menos polar (por exemplo, hexano). As substâncias que mais interagem com a superfície polar da fase estacionária são retidas mais tempo na coluna.

A cromatografia em fase reversa (RPC) é um tipo de HPLC onde a fase estacionária é não polar (por exemplo, C18) e a fase móvel é polar (por exemplo, água/metanol). As substâncias que mais interagem com a fase estacionária não polar são retidas mais tempo na coluna.

A cromatografia de troca iônica (IEC) é um tipo de HPLC onde a fase estacionária possui grupos iônicos (ânions ou cátions). As substâncias que apresentam carga oposta à fase estacionária são retidas na coluna.

A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) ou permeação em gel (GPC) é um tipo de HPLC onde a fase estacionária consiste em partículas porosas que permitem a separação de moléculas com base em seus tamanhos. As moléculas maiores passam mais rapidamente pela coluna, enquanto as moléculas menores são retidas mais tempo.

As colunas C18 são as mais comuns em cromatografia em fase reversa (RPC). Elas possuem uma superfície de sílica modificada com cadeias de carbono de 18 átomos de comprimento. Essa superfície não polar proporciona uma retenção eficiente de compostos não polares.

A fase móvel é o solvente que carrega a amostra através da coluna de HPLC. A escolha da fase móvel é crucial, pois ela determina a seletividade da separação. É preciso escolher uma fase móvel que dissolva os componentes da amostra e que seja compatível com o detector.

O detector é a parte do sistema de HPLC que detecta os componentes separados ao saírem da coluna. Existem vários tipos de detectores disponíveis, cada um com um princípio de funcionamento específico.

A gradiente é uma técnica utilizada em HPLC para melhorar a separação de componentes. Ela consiste em variar a composição da fase móvel durante a corrida. Por exemplo, pode-se aumentar a concentração de solvente mais polar (água) ao longo do tempo para eluir componentes mais retidos.

A técnica de cromatografia que utiliza uma fase móvel menos polar e uma fase estacionária mais polar. As substâncias mais polares são retidas por mais tempo na coluna, enquanto as substâncias menos polares são eluídas primeiro.

O sistema de HPLC que utiliza uma fase móvel menos polar e uma fase estacionária mais polar, geralmente sílica.

Sílica é um material usado como fase estacionária em NPLC.

As interações entre a fase estacionária e a amostra em NPLC podem ser do tipo: dipolo-dipolo induzido, dipolo-dipolo, pontes de hidrogênio e interações π.

A ordem de eluição dos compostos em NPLC é determinada pela força das interações com a fase estacionária. Compostos mais polares são retidos por mais tempo.

Em NPLC, a força das interações depende da estrutura do composto, incluindo a presença de grupos funcionais e efeitos estéricos. Isto permite a separação de isômeros.

O composto mais polar em uma amostra é o que vai interagir mais fortemente com a fase estacionária e, consequentemente, será eluído por último.

A NPLC é usada para separar compostos baseando-se em suas polaridades. A fase estacionária é mais polar que a fase móvel, e as interações entre a fase estacionária e os analitos de interesse são polarizadas.

Tipo de cromatografia que utiliza uma fase estacionária não polar e uma fase móvel polar. A separação dos compostos ocorre com base na sua afinidade por cada fase. Os compostos mais polares são eluídos primeiro.

As interações entre os compostos e a fase estacionária são baseadas na polaridade. O composto mais polar será eluído primeiro, enquanto o composto menos polar será eluído por último.

A força da fase estacionária em reter os compostos. Quanto maior o carbono, maior a retenção.

O tamanho dos poros na fase estacionária influencia o tamanho das moléculas que podem passar. Poros menores permitem melhor retenção de compostos menores.

A introdução de grupos polares na fase estacionária melhora a estabilidade mesmo em condições aquosas.

As moléculas com maior cadeia de carbono tendem a ter maior retenção na fase estacionária, pois são mais apolares.

A CLFR é sensível à polaridade dos compostos. Os compostos polares são eluídos primeiro, enquanto os compostos apolares são eluídos por último.

Um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizado em CLFR. Consiste em diversos componentes que trabalham em conjunto para separar e analisar as amostras.