Vectores de ADN y plásmidos

Vectores y Plásmidos

• Un vector es una molécula de ADN que se utiliza para transportar un segmento de ADN particular a una célula huésped.
• Los vectores ayudan a replicar y/o expresar la secuencia de ADN insertada dentro de la célula huésped.

Características de los Plásmidos

• Un plásmido es una molécula de ADN pequeña, circular y de doble cadena.
• Los plásmidos bacterianos a menudo contienen genes que codifican enzimas que pueden beneficiar a la célula huésped.
• Los plásmidos de laboratorio se denominan comúnmente “vectores” o “construcciones”.

Componentes de un Plásmido

• Origen de replicación (ORI): permite el inicio de la replicación dentro de un plásmido mediante el reclutamiento de proteínas de la maquinaria transcripcional.
• Resistencia a los antibióticos: permite la selección de bacterias que contienen plásmidos.
• Sitio de clonación múltiple (MCS): segmento corto de ADN que contiene varios sitios de restricción que permiten la fácil inserción del ADN.
• Región promotora: impulsa la transcripción del gen diana y determina en qué tipos de células se expresa el gen y la cantidad de proteína recombinante producida.
• Marcador seleccionable: el gen de resistencia a los antibióticos permite la selección en bacterias.
• Sitio de unión del cebador: una secuencia corta de ADN monocatenario utilizada como punto de inicio para la amplificación o secuenciación por PCR.

Factores que Afectan las Copias

• Condiciones de crecimiento: aireación, temperatura, volumen de cultivo, antibiótico y medio.
• Inóculo de cultivo: las bacterias recién rayadas tienen un mayor número de copias.
• Incubación durante 12 a 16 horas: tiende a dar números de copias más altos (las bacterias acaban de alcanzar la fase estacionaria).

Enzimas de Restricción

• Endonucleasas: enzimas bacterianas que escinden el ADN de doble cadena.
• Tipo I: importante en la función bacteriana, pero no escinde el ADN en secuencias específicas.
• Tipo II: sitios altamente específicos para la escisión del ADN (clonación).

Clonación Molecular

• Aislamiento del ADN objetivo (insertar).
• Ligación del inserto en un plásmido apropiado.
• Transformación de plásmido recombinante.
• Selección y cribado.