Studoku : Tech Micro

Fonctions de l'oculaire

• Agrandit l'image projetée par l'objectif.
• Mesure la taille des cellules avec un réticule gradué et standardisé.
• Nécessite un ajustement.

Types d'oculaires

• Il en existe divers, y compris ceux à "grand champ", qui augmentent la surface visible de l'image.

Réglage de la dioptrie (deux oculaires)

• Réglez les commandes sur zéro.
• Gardez les deux yeux ouverts et mettez au point sur la lame.
• Corrigez la dioptrie en fermant un œil, puis l'autre.

Réglage de la dioptrie (un seul oculaire)

• Fermez l'œil opposé à un oculaire avec réglage dioptrique et mettez au point sur la lame.
• Fermez l'autre œil et ajustez la dioptrie jusqu'à ce que l'image soit nette.

Fonctions de l'objectif

• Responsable de la résolution de l'objectif.
• Plus l'ouverture est élevée, plus la quantité de lumière entrant dans l'objectif est élevée.

Résolution de l'objectif

• Capacité à séparer deux points rapprochés.
• La limite de résolution est definie par la formue suivante: = 0.5 λ / Ο.Ν

Importance de l'épaisseur de la lamelle

• L'épaisseur de la lamelle est indiquée sur l'objectif par un trait de couleur avec le symbole de l'infini.

Importance de la lamelle

• La lamelle appropriée est fonction de l'objectif.
• Une épaisseur incorrecte diminue la qualité de l'image.

Rôle de l'huile à immersion

• Permet de conserver le même indice de réfraction que le verre.

Fonctions du condenseur

• Éclaire uniformément le champ du microscope.
• Seule partie mobile et réglable du trajet de la lumière.
• Doit être à la bonne hauteur.

Positions du condenseur

• Position A : sur fond clair
• Position Ph : sur contraste de phase

Éclairage de Köhler

• Répartit uniformément la lumière sur la surface observée.
• Élimine les rayons marginaux (parasites) et la lumière diffuse.
• Exploite au maximum l'objectif.
• Utilise deux diaphragmes (de champ et d'ouverture).

Conditions pour l'obtention de l'éclairage de Köhler

• La lumière doit être centrée.
• Condenseur ajusté à la bonne hauteur.
• Diaphragme du condenseur ouvert à 70-75 %.
• Diaphragme de champ correctement ouvert.

Étapes importantes pour l'ajustement du microscope

• Mettez au point avec les vis macro/micrométriques.
• Fermez les deux diaphragmes.
• Remontez le condenseur à sa position supérieure.
• Centrez la lumière (ouvrez le diaphragme de champ si nécessaire).
• Ajustez la hauteur du condenseur.
• Ajustez le diaphragme de champ.
• Règlez le diaphragme d'ouverture.
• Ajustez la luminosité.

Centrage de la lumière

• Observez après avoir retiré les oculaires.
• La lentille arrière doit être remplie de 70 à 75 % de lumière.
• À faire pour chaque objectif.

Composantes du microscope pour le calibrage

• Oculaire gradué (graduation arbitraire).
• Lame micrométrique (graduation précise).
• La valeur d'une unité arbitraire varie d'un microscope à l'autre.
• À déterminer pour chaque grossissement.

Méthode aseptique

• S'emploie pour empêcher l'entrée de microorganismes contaminants dans un échantillon.
• Les contaminants incluent : nous, l'air et le matériel non stérile.
• Respectez le champ stérile (30 cm autour de la flamme).

Méthode aseptique : règles à suivre après un prélèvement

• Culture liquide : remuez, puis prélevez avec une micropipette ou un fil à boucle.
• Flambez le fil, puis le goulot du tube.
• Prélevez l'inoculum sans créer d'aérosols.
• Flambez à nouveau le goulot et refermez le tube.

Avantages du microscope à contraste de phase

• Observation des microorganismes vivants.
• Volume et dimensions réelles.
• Observation des structures internes (spores) ou externes (capsule).
• Les rayons lumineux sont déviés et déphasés.

Microscope à contraste de phase

• Transforme les différences d'indice de réfraction en niveaux de contraste.
• Permet de visualiser les structures transparentes.

Types de coloration

• Simple (CV).
• Négative (encre de Chine).
• Différentielle (Gram, Ziehl-Neelsen).
• Spécifique (capsule, spore, flagelle).
• Les colorations sont moins utilisées depuis l'avènement du contraste de phase car des produits dangereux sont employés.

La coloration différentielle de Gram

• Mise au point par Christian Gram en 1884.
• Permet de différencier les Streptococcus pneumoniae et Klebsielle pneumoniae.
• Sépare les bactéries en deux groupes : Gram-négatif et Gram-positif.
• Implique le peptidoglycane et les lipides.
• Se déroule en quatre étapes.

Comparaison colorations de Gram+ et Gram-

• La coloration de Gram+ met en évidence la paroi cellulaire, la membrane cellulaire et la membrane externe.

Importance de l'éthanol dans la coloration de Gram

• Gram+ : la paroi se déshydrate, la perméabilité diminue et le complexe cristal violet-iode ne peut pas sortir.
• Gram- : la membrane externe est endommagée et la paroi mince ne peut pas retenir le complexe cristal violet-iode.

Étapes impliquées dans la coloration de Gram

• Cristal violet
• Iode (mordant)
• Éthanol
• Safranine
• Ne pas oublier de rincer à l'eau entre chaque étape.

Principales raisons des résultats variables de la coloration de Gram

• Relatif à l'âge de la culture.
• Les manipulations faites par l'utilisateur peuvent décolorer excessivement, et les frottis peuvent contenir trop de cellules.

Identification des bactéries Gram + ou Gram - via le test KOH

• Test KOH positif : des filaments se forment en moins d'une minute (Gram - ).
• Test KOH négatif : aucun filament ne se forme après une minute (Gram +).

Filaments test KOH

• Les filaments sont dus à la libération d'ADN lors de la rupture de la paroi cellulaire.

Différents microorganismes observés et leurs caractéristiques

• Bacillus thuringiensis : Bacille Gram positif, produit une endotoxine insecticide (cristal).
• Escherichia coli : Bacille Gram négatif.
• Micrococcus luteus : Coque Gram positif, colonies jaunes.
• Saccharomyces cerevisiae : Levure.
• Schizosaccharomyces octoporus : Levure.
• Streptococcus mutans : Coque Gram positif.
• Novosphingobium capsulatum : Bacille Gram négatif avec une capsule qui empêche la fixation des colorants.

Test de KOH

• Le test de KOH tire parti des parois cellulaires dans des conditions alcalines (KOH), ce qui entraîne la libération d'ADN.
• Les bactéries Gram- résistent aux conditions alcalines.
• Il faut une culture solide.

Boîtes de Pétri

• Généralement gardée à 4 °C.
• Incuber toujours à l'envers pour éviter la condensation.
• Identifier la boîte en dessous de celle-ci.

But de la striation en trois étapes

• Permettre l'isolement de colonies.

Identification de E. coli

• Gram négatif
• Appartient à la flore intestinale des mammifères.
• Divers sérotypes (+700), ex. O (+185), H (+50) et K (+70).

Problèmes rencontrés lors de la coloration de Gram

• Sont dus à trop de cellules, mauvaise dispersion ou trop de chauffage.
• Les Gram+ paraissent mauves ou bleutées, les Gram- sont rosées.

Étapes de la striation en trois étapes

• Dessiner un T sous la boîte de Pétri.
• Strier dans la partie 1, puis stériliser le fil.
• Prendre de la culture dans la partie 1 et strier dans la partie 2.
• Répéter pour la partie 3.

Introduction aseptique d'un milieu gélosé liquide

• Le milieu doit être liquéfié et maintenu entre 45 et 50 °C et content un agent solidifiant (agar).
• Travaillez en tout temps dans un champ stérile et ouvrez les boîtes le moins longtemps possible.
• Laissez solidifier (20 min).

Conservation des boîtes de Pétri gélosées

• Conserver à 4 °C, incubation à l'envers.

Étapes de l'utilisation de la micropipette

• Ajuster le volume, attacher un embout, prélever et relâcher délicatement.
• Distribuer en appuyant sur le piston jusqu'au premier arrêt, attendre, puis appuyer jusqu'au fond.
• Les décimales et les centièmes sont affichées.

Description des colonies : élévation

• Plate, surélevée, convexe basse, convexe (dôme), ombiliquée et convexe à surface papillaire.

Description des colonies

• Ronde ou irrégulière.

Description des colonies : contour

• Fusiforme, filamenteuse, rhizoïde, régulier, ondulé, lobé, crénelé, érodé, striation radiale, fimbrié.

Métabolisme de E. coli

• Certaines souches sont virulentes, caractérisées par leur antigène H (flagelle), K (capsule) et O (LPS).
• Produit des toxines dommageable.

Aérobie vs anaérobie

• Aérobie : besoin d'oxygène.
• Anaérobie : pousse en absence d'oxygène, lequel peut être létal.

Façon de générer de l'oxygène sur la planète

• Via photosynthèse : Plus de 50 % des océans synthétisent l'oxygène.
• Détoxification des radicaux libres, respiration du chlorate et oxydation du méthane.

Effet de l'oxygène

• Positif : respiration cellulaire et ATP.
• Négatif : les radicaux libres oxydent les constituants cellulaires.

Production d'ATP en présence de O2

• Respiration aérobie : oxydation de molécules organiques avec O2 comme accepteur final.
• Besoin de 38 molécules d'ATP.

Production d'ATP en absence de O2

• Respiration anaérobie : accepteur final est une molécule inorganique.
• Produit de 2 à 38 molécules d'ATP par molécule de glucose.

Un des effets négatifs : les radicaux libres

• Molécules organiques servent de donneur et d'accepteur d'électrons.
• 2 molécules d'ATP par molécule de glucose.

La détoxification

• Superoxyde dismutase convertit les radicaux superoxydes en peroxyde d'hydrogène.
• La catalase décompose le peroxyde d'hydrogène en eau et en oxygène.

Aérobie vs anaérobie

• Anaérobie strict : absence d'enzymes donc mort en présence d'O2 à cause des radicaux libres.
• Aérobie strict : O2 obligatoire car respiration/ATP (Micrococcus).
• Microaérophiles : O2 obligatoire, mais en faible quantité (Helicobacter pylori).
• Anaérobie facultatif : multiplication avec ou sans O2 (Escherichia coli).
• Anaérobie strictement létal envers certaines espèces.

Schéma de l'oxygène et la croissance bactérienne

• Illustre les besoins en oxygène des différents types de bactéries et leur contenu enzymatique.

La croissance microbienne en aérobiose (liquide)

• Le O2 est peu soluble dans l'eau et son remplacement par diffusion est lent.
• L'agitation et d'ajouter de l'air filtré sont importante.

La croissance microbienne en anaérobiose

• Nécessite un milieu contenant des agents réducteurs.
• Milieu liquide : le O2 est remplacé par du CO2 ou N2.
• Environnement clos de type Jarre et chambre.

Mesure de l'anaérobiose

• Via potentiel d'oxydoréduction (mV) ou des indicateurs colorés (bleus de méthylène, résazurine).

Bifidobacterium longum

• Gram positif, bâtonnet de forme variable.
• Non-motile, non sporulant.
• Anaérobie, 37°C.
• Membre de la microflore intestinale (animaux et humains).
• Utilisé dans les yogourts et comme probiotiques.

Dilution-agitation

• Dilution en milieux gélosés liquides maintenus à 45°C où du CO2 est injecté.
• Les microorganismes croissent dans une gélose moins oxygénée.

Milieu Veillonella

• Contient de la tryptone, de l'extrait de levure, du lactate de sodium, du thioglycollate et du Tween 80.
• La stérilisation se faire par filtration.

Test vaspar

• Sert à empêcher l'entrée de l'oxygène dans les milieux liquides (environ 1 cm d'épaisseur).

Veillonella

• Diplocoque Gram négatif, non motile, anaérobique strict.
• Fermentation de l'acide lactique en CO2.

Besoins des microorganismes pour croître

• Source d'énergie (ATP).
• Source de carbone, d'azote, de soufre, de phosphore, d'ions et facteurs de croissance.

Types trophiques

• Les phototrophes utilisent la lumière comme source d'énergie.
• Les chimiotrophes utilisent des substrats organiques/inorganiques.

Sources de carbone

• Hétérotrophes : carbone organique (glucose).
• Autotrophes : carbone inorganique (CO2).

Sources d'azote

• Sels inorganiques (ammonium ou nitrate).
• Fixatrices d'azote : N2.

Importance des milieux de culture

• Pour obtenir des cultures pures à l'étude.
• Maladies infectieuses et identifier les contaminants microbiens.

Importance des milieux de culture

• Identifier les contaminants microbiens.
• Vérifier le respect des normes (UFC/mL), exploitation en biotechnologies, étude de la diversité et des besoins nutritifs.
• Vérifier les conditions de croissance appropriées (T°, O2).
• Facilite la distinction entre cultures pures et communautés bactériennes.

Culturomique et métagénomique

• Approches permettant de caractériser les gènes et leur altération.

Faire croître une culture pure d'une bactérie connue

• Consulter le Bergey's Manual et d'autres manuels.

Développer un milieu de culture pour isoler une nouvelle bactérie

• Consulter la littérature scientifique et reproduire le milieu naturel de l'espèce.

Milieux de culture : formes et formats

• Liquide.
• Semi-solide (0,75 % d'agar)
• Solide (1,5 % agar).

Liquide vs Solide

• Liquide : diffusion rapide, effet sur l'ensemble de la microflore.
• Solide : motilité réduite, concentration du métabolisme.

Agent solidifiant

• Une cellule viable → une colonie.
• Culture pure.

Étapes de l'ajustement d'un microscope optique

• Mettez au point avec les vis macro/micrométriques.
• Fermer les deux diaphragmes.
• Remontez le condenseur.
• Centrez la lumière, ajustez la hauteur, les diaphragmes et la luminosité.
• Rappel: Le seul objectif qu'on peut mettre l'huile à immersion est le 100X.

Caractéristiques de certains microorganismes

• Bacilles Gram+ : Bacillus thuringiensis.
• Bacilles Gram- : Escherichia coli.
• Coques Gram+ : Micrococcus luteus et Streptococcus mutans.
• Levures : Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces octosporus.

Composition des microorganismes

• Les bactéries sont des procaryotes.
• Les levures sont des eucaryotes.

Ordre des réactifs utilisés pour la coloration de Gram

• Cristal violet, iode, éthanol et safranine.
• Bien rincer à l'eau entre chaque composé.

Rôle de l'iode

• Le composé appelé le "mordant" : l'iode, qui forme un complexe avec le cristal violet, qui permet aux bactéries Gram+ de retenir ce cristal violet.

Observation des microorganismes au microscope à contraste de phase

• Observation de la forme et des dimensions, des microorganismes vivants et de la préparation entre lame et lamelle.
• Observation de spores, s'il y en a.
• Attention si l'objectif 100X à immersion touche la lamelle, assurez-vous d'avoir fait la mise au point avec l'objectif 40X.

Caractéristiques de certains microorganismes

• Novosphingobium capsulatum: Capsule.
• Rhodospirillum rubrum: Spirale motile à G.
• Bacillus thuringiensis: Spores + cristal.
• Micrococcus luteus: Coque à G+.

Les tests de KOH

• La formation de filaments observés est due à la libération de l'ADN lors de la bris de la paroi cellulaire du microorganisme.
• Une grande quantité de bactéries est nécessaire.
• Dans les bactéries Gram -, les filaments se forment avant 1 minute : test KOH positif.
• Dans les bactéries Gram +, les filaments se forment après 1 minute : test KOH négatif.