Repaso temas 6-7

Técnicas de Hibridación

• La secuencia diana se hibrida de forma bicatenaria con la sonda es incorrecto.
• Para que ocurra la hibridación, debe haber complementariedad de bases entre la sonda y la secuencia diana.
• Es necesario lavar el exceso de sonda y el ADN diana que han creado un dúplex.
• Es irrelevante la longitud y concentración de la sonda a la hora de realizar la hibridación es incorrecto.
• La velocidad de hibridación es inversamente proporcional al tamaño y complejidad de la sonda.
• Dimetilsulfóxido y la formamida influyen en la estabilización de la secuencia diana y la sonda.
• Fluorocromos como rodamina es un marcador empleado en el marcaje directo no radiactivo.
• En la técnica de hibridación es necesario usar xilol para desparafinar

Etapas de Clonación

• Es necesario transformar bacterias o células eucariotas con el vector creado que lo repliquen.
• Las enzimas cortan el ADN diana de doble cadena para introducir el fragmento de ADN de interés después.
• La ADN ligasa une el ADN de interés al fragmento previamente cortado en la fase de ligación.
• El vector o plásmido se introduce en la bacteria o célula que lo incorpora en la fase de selección.

Fase de Selección con Antibióticos en Clonación

• La bacteria que puede crecer en el medio con dos antibióticos ha sido transformada con el vector recombinante.

Estrategia Cromogénica de Clonación

• Las bacterias transformadas recombinantes tienen el LacZ no funcional.

Tasa de Transformación

• Se expresa como el número de células transformadas por µg de vector.

Aplicaciones de Clonación

• Se pueden estudiar y encontrar genes homólogos que codifican proteínas defectuosas.
• Es posible el diseño de fármacos.
• Se pueden analizar dianas terapéuticas para saber cómo actúan los fármacos contra diferentes moléculas.

Elementos en la Secuenciación de Sanger

• La hebra molde de ADN, ADN Polimerasa y desoxinucleótidos trifosfato terminadores de cadena son elementos utilizados.
• Cloruro de magnesio NO es un elemento usado en la técnica de secuenciación de Sanger

Diferencia entre Secuenciación manual Sanger y Automatizada

• La principal diferencia radica en el número de tubos y de reacciones de PCR.

Secuenciación

• La secuencia de ADN que proporciona el secuenciador es directamente la de la hebra molde es incorrecto.
• El secuenciador permite conocer el orden y tipo de nucleótidos añadidos mediante el cromatograma.
• Se necesita amplificar el ADN diana por PCR.
• Se necesitan leer los nucleótidos fabricados a través de un gel de electroforesis.

Técnicas de Secuenciación

• La pirosecuenciación utiliza enzimas como la ATP sulfurilasa o la luciferasa.

Secuenciación Masiva

• Permite secuenciar todo el genoma de un organismo en un único proceso, ofreciendo resultados eficientes en poco tiempo.

Vectores con Secuencias COS

• Cósmido es un tipo de vector que tiene secuencias COS para el empaquetamiento del ADN y su circularización, además de un gen de resistencia a antibióticos.

Vectores de Almacenamiento de Fragmentos ADN

• Los vectores que hoy en día pueden almacenar fragmentos de ADN inserto de gran tamaño son los YAC.

Nick Translation (Marcaje de Sonda)

• La desnaturalización obligatoria previa de la sonda bicatenaria es necesaria.
• Una ADN Polimerasa I elimina los nucleótidos contiguos a la zona de corte y los reemplaza por nucleótidos marcados.
• El método usa para sondas de gran tamaño de doble cadena obtenidas por clonación.
• Para Nick Translation Consiste en hacer un corte o mella en una de las dos hebras del ADN bicatenario de la sonda es FALSA

Métodos de Marcaje Terminal Directo de Sondas

• El método de la polinucleótido quinasa marca el extremo 5' de la sonda, reemplazando grupos fosfato marcados.

Hibridación para Analizar Expresión Génica

• Microarrays permiten analizar la expresión múltiple de muchos genes simultáneamente, conociendo su estado de actividad.

Fases Generales de la Técnica de Hibridación

• La Tm y la cantidad de cationes monovalentes se deben tener en cuenta en la fase de pre-hibridación.
• En la fase de lavado post-hibridación se eliminan el exceso de sonda que no se ha unido al ADN diana y los híbridos imperfectos.
• Se utilizan digestiones enzimáticas del ADN y el bloque de uniones específicas al ADN extraído en pre-hibridación es INCCORRECTA

Southern Blot

• No es necesario realizar una electroforesis previa de los fragmentos a hibridar. Es incorrecto.
• Se requiere una membrana de nitrocelulosa para transferir los fragmentos de ADN.
• La detección de los híbridos se realiza por autorradiografía o colorimetría.
• NaOH se utiliza para desnaturalizar el ADN extraído.

Técnicas de Hibridación

• Dot-blot separa solamente moléculas de ARN y no necesita electroforesis previamente.

Hibridación con Xilol

• CISH requiere usar xilol para desparafinar y utiliza un marcaje colorimétrico que forma un color directamente sobre los tejidos.

ADN de Captura de Híbridos

• El señar que se genera es luminiscente y es proporcional a la cantidad de hibrido. No es proportional.
• Se usan anticuerpos de captura fijados al soporte.
• Los anticuerpos marcados con enzimas se unen a una parte diferente del híbrido.

Técnicas con Sondas de Amplificación de Señal

• En la técnica de ADN ramificado se utilizan sondas de amplificación de señal que se van añadiendo en diferentes momentos, y se unen al híbrido formado por la sonda inicial y el ADN/ARN extraído de nuestra muestra.

FISH

• La sonda monocatenaria se pone en contacto directamente con el tejido. Es incorrecto.
• Se debe desnaturalizar el ADN de las células del tejido antes de la hibridación.
• La sonda y el tejido se incuban a 37ºC en oscuridad.

Tipos de Sondas

• Las sondas locus-específicas permiten hibridar con una región muy concreta y específica del cromosoma, como un gen.