Traducción in vitro: sistemas celulares

Sistemas Celulares de Traducción In Vitro

• Maxicélulas: células de E. coli mutantes y transformadas que se irradian con luz UV para degradar su DNA, permitiendo expresar genes clonados.
• Minicélulas: divisiones alteradas que forman septos de forma descontrolada y generan minicélulas sin DNA, capaces de expresar genes en un medio con un precursor radiactivo.

Ovocitos de Xenopus leavis

• Se microinyectan con mRNAs eucariotas que se traducen en el citoplasma.
• Existen expresiones completas que incluyen transcripción y traducción de DNA con o sin intrones, clonada o no.

Expresión In Vivo de Secuencias Clonadas

• Requiere que la secuencia codificante sea provista de señales para su expresión:
  • Promotor
  • Terminadora
  • RBS (Región de Binding Secuencial)
  • Codón de inicio
  • Codón de término

Promotor

• Es la región de DNA que interacciona con el aparato transcripcional (RNA pol y factores auxiliares) para iniciar la transcripción de la secuencia contigua.
• Secuencia -35 y -10 (Caja Pribnow) son importantes para la interacción con el aparato transcripcional.
• Elementos promotores se encuentran en la región upstream (rio arriba) y downstream (rio abajo).

Secuencias Consenso

• Plac
• Ptrp
• PlacI
• PtRNATyr
• ApI
• Pt7
• PlagV5
• Ptac
• Ptrc
• Cada consenso tiene una secuencia específica para la interacción con el aparato transcripcional.

Tipos de Promotores

• Promotor constitutivo: de expresión continua, puede deteriorar a la célula por un gasto alto de energía continuo.
• Promotor regulable: es inducible solo bajo condiciones específicas en ciertas etapas del crecimiento de la célula.
• Promotor fuerte: tiene gran afinidad por la RNA polimerasa y por lo tanto la secuencia ubicada rio abajo será transcrita con alta frecuencia.

Identificar un Promotor

• Utilizar un gen reportero para identificar la actividad del promotor.
• Clonar la secuencia promotora para estudiar su función.

Mecanismo de Regulación

• La sobreexpresión de un gen puede generar un elevado costo energético y frenar el crecimiento de la célula.
• La toxicidad del producto génico puede ser evitada con el uso de promotores bien regulados.
• Un promotor fuerte puede generar entre 20 y 40% de la proteína total de la célula.