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Terapia Genica

• Definizione: introduce un gene corretto in una cellula con un gene difettoso per curare una patologia
• Meccanismo: sostituire, correggere, compensare o silenziare un gene difettoso per un effetto terapeutico
• Possibilità: vasta gamma di malattie genetiche ereditarie, tumori, malattie infettive e autoimmuni
• Malattie ereditarie: correggere il gene mutato tramite editing del genoma per una correzione del fenotipo
• Malattie acquisite: forniscono nuova funzione ai tessuti o cellule per fini terapeutici o preventivi

Tipologie di Terapia Genica

• Ex vivo: prelievo cellule somatiche, modifica genica in laboratorio, impianto delle cellule modificate nell'organismo
• In vivo: introduzione diretta del gene terapeutico nel tessuto bersaglio; metodologia più semplice ed estendibile a molti pazienti

Terapia Genica Ex Vivo

• Procedura: preleva le cellule somatiche, le modifica in laboratorio, le amplifica e poi le re-implanta nel paziente
• Tipo di cellule: cellule staminali ed altre cellule specializzate
• Vettori: virus modificati o metodi fisico-chimici
• Vantaggi: elevata efficienza e possibilità di selezionare e amplificare le cellule target
• Svantaggi: la procedura è lunga e costosa

Terapia Genica In Vivo

• Metodologia: trasferimento diretto del gene terapeutico nelle cellule bersaglio
• Vettori: trasportano il gene terapeutico attraverso un metodo sistemico o locale
• Vantaggi: semplice e potenzialmente efficace per molti pazienti
• Svantaggi: difficoltà nella selezione delle cellule bersaglio, possibilità di risposta immunitaria, rischio di inattivazione genetica

Metodi e Vettori

• Iniezione di DNA nudo: semplice e poco costoso con scarsa efficienza.
• Liposomi: crea complessi lipidici per veicolare il DNA
• Elettroporazione: induce pori temporanei nella membrana cellulare per l'ingresso del DNA

Virus come vettori

• Utilizzati per il trasferimento genico
• Modificati per sicurezza (rimuovendo geni responsabili della patologia)
• Vantaggi: elevata efficienza e varietà di cellule bersaglio.
• Svantaggi: può provocare mutagenesi inserzionale, reazioni immunologiche

GLI STRUMENTI DELLA TERAPIA GENICA

• Efficienza, efficacia e sicurezza del trasferimento genetico.
• Utilizzo di diversi vettori basati su virus o metodi fisico-chimici.
• Il metodo ideale deve essere sicuro, facile da produrre e selettivo.

Retrovirus

• Genomio costituito da singolo filamento di RNA (circa 10kb)
• tre geni essenziali: gag (proteine del core), pol (trascrittasi inversa) e env (proteine del capside)
• LTR con sequenze per l'integrazione nel genoma ospite

Lentivirus

• Possono infettare anche cellule in fase di non replicazione
• Genomi costituiti da un singolo filamento di RNA
• Possono essere somministrati in vivo
• Può essere utilizzato un vettore senza rischio di mutagenesi inserzionale

Adenovirus

• Sono sicuri, manipolabili e si ottengono con alti titoli
• Infettano cellule staminali
• Svantaggio: espressione transiente non integra nel genoma
• Alta risposta immunitaria

Virus Adenoassociati

• Non sono patogeni per l'uomo
• Sono stabili con alti titoli e ampia capacità di transfezione.
• Meno pericolosi dei retrovirus ma meno efficaci.
• Svantaggio: dimensioni ridotte del transgene, non sempre sono integrazioni sito specifiche

Herpes virus

• Utilizzato per trasportare geni nel sistema nervoso centrale
• Sono in grado di stabilire infezioni latenti nei neuroni, con un genoma di 152kb con una metà di geni non essenziali
• Sono idonei al trasporto di grandi quantità di geni stranieri.

Terapia Genica Ex Vivo di Malattie Monogeniche (es. ADA-SCID e SCID-X1)

• Utilizzo di cellule staminali ematopoietiche
• Modifica del genoma con vettori retrovirali o lentivirali
• Re-introduzione delle cellule modificate nel paziente
• Vantaggi: trattamento di successo con elevata sopravvivenza.
• Svantaggi: il trapianto richiede un donatore compatibile

Terapia Genica Ex Vivo dei Tumori

• Uso di linfociti T
• Modifica genetica con vettori virali per indurre le cellule a riconoscere e distruggere le cellule tumorali (CAR-T)
• Rischi: sindrome da rilascio di citochine (CRS), insufficiente produzione di anticorpi (ipogammaglobulinemia), reazioni neurologiche

DNA Editing

• Tecnologia CRISPR/Cas9: sistema precisone che può usare enzimi come bisturi molecolare
• Utilizzo di endonucleasi per tagliare in maniera precisa il DNA
• Vantaggi: modificare gli specifici target genetici in cellule di un paziente.
• Utilizzo di cellule somatiche e germinali.

Farmacogenetica

• Studia la risposta individuale dei farmaci
• Differenze genetiche influenzano l'efficacia e la tossicità dei farmaci
• Identifica il tipo ideale di farmaco migliore per un individuo.
• Polimorfismi genetici nell'assorbimento, metabolismo, distribuzione ed escrezione dei farmaci
• Importanza dei polimorfismi nei geni per il metabolismo e recettori per la risposta dei farmaci

Glucosio-6-Fosfato Deidrogenasi

• Enzima cruciale nel metabolismo delle purine, la sua carenza causa accumulo di metaboliti con danni ai linfociti.
• La sua carenza determina un aumento di rischio in caso di terapia con antimalarici.

TPMT

• Enzima importante nel metabolismo dei farmaci tiopurinici.
• Polimorfismi genetici in TPMT influenzano la risposta ai farmaci
• La diminuzione dell'attività di TPMT porta alla accumulo di metaboliti inattivi e un'aumentata tossicità.

CYP2D6

• Citocromo P450, responsabile del metabolismo di circa il 25% dei farmaci
• Varianti alleliche (es. *2, *3) influenzano la metabolizzazione dei farmaci
• Possibilità di reazioni avverse come conseguenza di un metabolismo inefficiente
• Utile identificare i polimorfismi per una gestione di dosaggi personalizzati.

CYP2C9

• Importo rispetto al 17% circa dei citocromi epatici
• Associa la variabilità del rapporto dose/risposta
• Polimorfismi (es. *2, *3) influenzano la metabolizzazione dei farmaci
• Dosaggi personalizzati per warfarin per evitare sanguinamenti eccessivi o insufficienze terapeutiche.

CYP2C19

• Isoenzima del Citocromo P450, coinvolto nel metabolismo di molti farmaci come; Clomipramina, Diazepam, Imipramina
• Varianti alleliche (es. *2, *3) influenzano la risposta ai farmaci
• Utili per ottimizzare efficacia ed evitare reazioni avverse.

VKORC1

• Il gene è cruciale per produrre vitamina K epossido reduttasi per il metabolismo del warfarin
• Polimorfismi di questo gene possono alterare la risposta al warfarin
• Per ottimizzare la dose del farmaco per i pazienti

Tamoxifene

• Antiestrogeno utilizzato nel trattamento del carcinoma mammario
• Il tamoxifene viene metabolizzato da diversi enzimi, tra cui CYP2D6
• I poor metabolizzatori di CYP2D6 potrebbero avere dosi meno efficaci