Spectrofotometrie

Spectrofotometrie

• Het is een techniek om de concentratie van een opgeloste stof te bepalen, vaak met behulp van licht
• Moleculen kunnen energie absorberen en uitzenden bij specifieke golflengten
• Moleculen kunnen worden geïdentificeerd en hun concentratie bepaald door deze eigenschap
• Lichtabsorptie kan gebruikt worden om de structuur van een molecuul af te leiden
• Spectrometrie analyseert stoffen met behulp van elektromagnetische straling
• Bij deze methode reageren opgeloste stoffen op zichtbaar licht, ultraviolet (UV) en nabij-infrarood

Ontstaan van Spectrofotometrie

• Max Planck ontdekte een relatie tussen temperatuur en golflengte/frequentie van uitgezonden straling
• Albert Einstein stelde dat elektromagnetische straling alleen in bepaalde hoeveelheden energie kan voorkomen, bekend als fotonen
• De relatie die ontstond door Einstein stelt dat de frequentie van een foton een meervoud is van de constante van Planck (aangeduid met de letter h)
• Er is een directe relatie tussen de energie van een foton (E), gemeten in Joules, en zijn frequentie (v) of golflengte (λ)
• Elektromagnetische straling, inclusief licht, kan worden gezien als een stroom van lichtdeeltjes (fotonen) met een specifieke frequentie (f)
• De energie van een foton kan worden berekend met E = h * f = (h * c) / λ, waarbij h de constante van Planck is (6,626 × 10-34 J·s), f de frequentie in Hertz (Hz), en c de lichtsnelheid in meters per seconde (m/s)

Basisprincipes van Spectrofotoscopie

• Spectrofotoscopie is een analytische/fysisch-chemische techniek om atomen en/of moleculen kwalitatief of kwantitatief aan te tonen
• Spectrofotometrie maakt gebruik van elektromagnetische straling met verschillende golflengten
• Elektromagnetische straling is licht, een elektromagnetisch golfverschijnsel waarbij de golflengte de eigenschappen bepaalt
• Een toename in frequentie betekent een toename in energie
• Energie die wordt gebruikt om een stof aan te brengen (bijvoorbeeld door verhitting of belichting) wordt omgezet in elektromagnetische straling

Elektromagnetische Straling in Atomen en Moleculen

• Elektromagnetische straling is het gevolg van atomen en/of moleculen in een monster
• De energie van een foton wordt gebruikt voor de excitatie van een elektron bij toenemende energie

Atoom versus Molecuul

• Een molecuul is een verzameling van atomen en kan dus ook fotonen absorberen en uitzenden, net als een atoom
• Het voornaamste verschil tussen atomen en moleculen is dat moleculen energie kunnen opslaan in de bindingen tussen de atomen
• Een molecuul kan vibreren en roteren zolang de verbindingen intact blijven

Spectroscopie Technieken

• Atoomspectroscopie analyseert de atoomcompositie
• Molecuulspectroscopie analyseert de moleculaire structuren
• Beide technieken gebruiken verschillende delen van het elektromagnetisch spectrum om atomen en moleculen te identificeren
• Moleculen hebben geen duidelijke absorptie- en emissielijnen vanwege het grote aantal elektronen en vibratietoestanden
• Moleculen absorberen fotonen bij een groot aantal frequenties (absorptiespectrum) en zenden fotonen uit bij een groot aantal frequenties (emissiespectrum)
• Emissiegolflengten bevinden zich voor de meeste moleculen in het infraroodgebied
• Fluorescentie is emissie die zichtbaar is

Ultraviolet Spectrometrie

• Verstrooiing of reflectie van licht ontstaat wanneer fotonen niet worden geabsorbeerd door een molecuul
• Kleurloze stoffen (gassen, veel vloeistoffen, sommige vaste stoffen) laten de meeste (zichtbare) golflengten door
• Witte stoffen verstrooien fotonen van alle zichtbare golflengten
• Zwarte stoffen absorberen deze fotonen
• Gekleurde stoffen absorberen sommige golflengten en verstrooien andere
• Veel organische verbindingen absorberen geen licht in het zichtbare gebied, waardoor ze kleurloos of wit zijn in vaste toestand
• Aanwezigheid van metaalionen en/of ongebonden elektronen en/of geconjugeerde dubbele bindingen zorgen ervoor dat organische verbindingen licht absorberen
• De frequentie van de fotonen bepaalt de kleur van het licht

Transmissie en Absorptie

• Transmissie is het licht dat niet wordt verstrooid of geabsorbeerd, maar wordt doorgelaten
• Gassen hebben een hoge transmissie
• Vaste stoffen hebben een lage transmissie, met uitzondering van glas, kristallen en kunststoffen
• Transmissie is afhankelijk van de lichtweg en de golflengte, omdat absorptie en verstrooiing ook van de golflengte afhangen
• Transmissie wordt gemeten door licht met een specifieke golflengte te laten schijnen en vervolgens de overgebleven intensiteit (I) te meten ten opzichte van de oorspronkelijke intensiteit (Io)
• Absorptiespectrometrie verwijst naar de studie van transmissie, absorptie en verstrooiing
• Licht verdwijnt door absorptie of verstrooiing

Absorptiespectrum

• Het absorptiespectrum is een unieke vingerafdruk van een molecuul
• Absorptie- en verstrooiingseigenschappen zijn afhankelijk van de structuur, vorm, ladingsverdeling en elektronenconfiguratie van het molecuul, alsook de temperatuur van de omgeving
• Het absorptiespectrum van een stof in oplossing is ook afhankelijk van het oplosmiddel, de redox-toestand, de aanwezigheid van andere moleculen en de pH

Wet van Lambert-Beer

• Transmissie van licht in vloeistoffen wordt beïnvloed door de stoffen die erin zijn opgelost, afhankelijk van de golflengten
• Een hogere concentratie van een opgeloste stof resulteert in een sterkere beïnvloeding van de transmissie
• Als de extinctie bij een bepaalde golflengte precies toeneemt met de concentratie, kan extinctie worden gebruikt om de concentratie van een stof te meten
• De intensiteit (I) neemt exponentieel af met de lichtweg
• α (Extinctiecoëfficiënt) is de waarde die aangeeft hoe snel de intensiteit afneemt en is afhankelijk van het medium en de golflengte
• Io vertegenwoordigt de beginintensiteit
• I vertegenwoordigt de intensiteit na het afleggen van de weglengte
• Transmissie (T) is dus de fractie van de beginintensiteit: T = I / Io
• De intensiteit (I) neemt exponentieel af bij een bepaalde lichtweg, weergegeven als I=Io·10-αl.

Extinctie en Lichtintensiteit

• Extinctie (A of E) wordt gedefinieerd als A = -log T = - log (I / I₀) = ε·l·c
• Lichtintensiteit (hoeveelheid fotonen) neemt nog steeds exponentieel af door een medium
• Extinctie van een medium is altijd golflengte-afhankelijk
• Bij een vloeistof met een opgeloste stof is absorptie doorgaans belangrijker
• In situaties waar verstrooiing minimaal is, wordt de extinctie absorptie genoemd
• I₀​ = intensiteit begin straling
• I= intensiteit doorgelaten straling
• ε= molaire extinctiecoëfficiënt (l·mol⁻¹·cm⁻¹)
• l = weglengte (cm)
• c = concentratie absorberende verbinding (mol/l)

Factoren die de Wet van Lambert-Beer Beïnvloeden

• Experimenteel kan een kalibratielijn worden opgesteld door extinctie uit te zetten tegen de concentratie van de opgeloste stof
• Het is mogelijk om waarden voor de extinctiecoëfficiënt in de literatuur te vinden
• De waarden zijn wel afhankelijk van factoren als het oplosmiddel, de pH en de temperatuur
• Er bestaat een relatie tussen de concentratie van een opgeloste stof en de hoeveelheid licht die het bij een specifieke golflengte absorbeert
• Bij hoge concentraties opgeloste stoffen is er geen lineair verband meer merkbaar vanwege het schaduw-effect, waarbij de moleculen elkaars lichtweg belemmeren
• Aggregatie van moleculen en extra verstrooiingseffecten beïnvloeden de extinctie

Moleculaire Spectroscopie Technieken

• UV (ultraviolet) spectrometrie wordt gebruikt voor cafeïne, methyloranje en acetylsalicylzuur
• IR (infrarood) Spectrometrie wordt gebruikt voor fluorenon, salicylzuur, kunststoffen en XTC-stoffen
• Fluorescentie spectrometrie

UV-VIS Spectrometrie

• UV/VIS-spectrometrie is een chemische analysetechniek die gebruikmaakt van de absorptie van zichtbaar licht (VIS) of ultraviolet licht (UV) om de concentratie van een opgeloste stof te bepalen
• Een deuteriumlamp heeft een golflengtebereik van 190 nm tot 400 nm
• Een wolfraamlamp heeft een golflengtebereik van 300 nm tot 900 nm

Onderdelen van een Spectrofotometer

• Een spectrofotometer bestaat ten minste uit een lichtbron, een monochromator, een compartiment om het monster te plaatsen, en een detector
• Een deuteriumlamp wordt gebruikt als UV lichtbron
• Een wolfraamlamp als lichtbron voor zichtbaar licht
• Monochromatoren werken met een rooster/tralie in het UV spectrum
• Monochromatoren werken met een filter voor zichtbaar licht
• Cuvetten van kwarts worden gebruikt in het UV spectrum
• Cuvetten van plastic worden gebruikt in het zichtbare spectrum

Infrarood Spectrometrie

• Infraroodspectroscopie is een vorm van molecuulspectroscopie die het infrarode deel van het elektromagnetisch spectrum gebruikt
• Het is een techniek om de structuur van een molecuul te bepalen
• Analyseert de trillingsfrequenties (trek- en buigvibraties) van bindingen in moleculen
• Verandering van de vibratietoestand kan leiden tot de uitzending van een foton in het infrarode golflengtegebied
• Een warm object zendt infraroodstraling (warmtestraling) uit

Atoom Absorptiespectrometrie (AAS)

• Atoomabsorptiespectrometrie (AAS) is een analysetechniek die gebaseerd is op de selectieve absorptie van elektromagnetische straling door atomen
• Onderdelen voor een klassieke absorptie spectrometrie (AAS) zijn een stralingsbron, een atomizer, een monochromator, en een detector

Holle Kathode Lamp

• De holle kathode lamp (HKL) is een belangrijke en veelgebruikte lamp in de AAS
• Een holle kathode lamp (HKL) is een gasontladingsbuis die is opgebouwd uit een glazen buis met een kwartsvenster, gevuld met neon- of argongas
• De anode is gemaakt van wolfraam
• HKL werkt door ionisatie/atomisatie, excitatie en emissie

Atoom Absorptie- en Emissie Spectrometrie

• AAS meet atomen, met name metaalatomen en kan één atoom tegelijk meten, terwijl ICP een alternatieve analysemethode is voor metaalatomen
• ICP staat voor inductief gekoppeld plasma en kan meerdere metaalatomen tegelijkertijd meten
• Bij AAS (atomaire absorptie) is de mate van absorptie van de straling een indicatie van de concentratie
• ICP-AES (atomaire emissie) is een analysetechniek die is gebaseerd op de selectieve emissie van elektromagnetische straling door atomen

ICP versus AAS

• De temperatuur van het plasma is veel hoger dan die van een vlam
• De temperatuur van het plasma is stabieler dan die van een vlam
• Argon als omgeving bij hoge temperaturen elimineert veel interferenties, wat een voordeel is ten opzichte van vlam-AAS
• ICP heeft een groter lineair bereik
• Simultaan bepalen van meerdere elementen is een belangrijk voordeel van ICP
• ICP heeft hoge gebruikskosten en is duurder in gebruik dan vlam-AAS
• Bij AAS en ICP moet een verbinding eerst worden ontleed tot atomen
• Atomen komen bij ICP in een toorts in aangeslagen toestand
• Vanuit een aangeslagen toestand valt het deeltje terug naar de grondtoestand, hierbij wordt licht van een karakteristieke golflengte uitgezonden.