41 Questions
Wat is het doel van DNA-sequenceren?
De opeenvolging van basen in de DNA-keten te bepalen
Wie ontwikkelde de Sanger-sequencingmethode?
Frederick Sanger
Wat is het verschil tussen dNTPs en ddNTPs?
dNTPs hebben een hydroxylgroep, ddNTPs hebben geen hydroxylgroep
Waarvoor wordt het ddNTP gebruikt?
Om de DNA-synthese te stoppen
Hoeveel reacties worden gebruikt in het originele Sanger-sequencingprotocol?
4
Wat gebeurt er tijdens de denaturatie?
Het DNA wordt enkelstrengs gemaakt
Wat is het resultaat van het binden van de gelabelde primer?
De primer bindt aan het DNA
Wat gebeurt er met de fragmenten in de elektrokinetische injectie?
Ze migreren door het polymeer naar de anode
Waarom vindt er een frame shift plaats bij een insertie of deletie?
Omdat het mRNA niet in de correcte combinatie van 3 nucleotiden vertaald wordt
Wat is het gevolg van een incorrect leesraam?
Een eiwit dat vaak veel korter is dan het oorspronkelijke eiwit
Wat is het doel van DNA-sequencing?
Om genetische variaties te identificeren
Wat is één type van mutatie?
Substitutie
Wat is de functie van de ‘Standard Mutation Nomenclature in Molecular Diagnostics’?
Om duidelijk te communiceren over mutaties
Wat wordt gebruikt in het forensisch onderzoek om verdachten aan sporenstalen te linken?
STRs
Wat is de notatie die verwijst naar de positie in het ORF van het gen?
c.
Waar kan een mutatie voorkomen?
Alles bovenstaande
Welke ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het CFTR-gen?
Mucoviscidosis
Wat is het effect van een stille mutatie?
Het resulterende eiwit is ongewijzigd
Wat is een missense mutatie?
Een substitutie die een aminozuur vervangt door een ander aminozuur
Wat is het effect van een insertie of deletie van 3 baseparen of een veelvoud daarvan?
Het resulterende mRNA wordt na de insertie of deletie vertaald in correcte aminozuursequentie
Wat is een nonsense mutatie?
Een substitutie die een stopcodon creëert
Wat is een repeats?
Een reeks nucleotiden die verschillende keren herhaald wordt
Wat gebeurt er wanneer het polymerase een nucleotide G moet inbouwen in een eppendorftube met ddGTP?
Ofwel een dGTP ofwel een ddGTP wordt ingebouwd
Wat is het resultaat van de synthese in een eppendorftube met ddGTP?
Een mengsel van DNA-strengen van verschillende lengte
Hoe worden de fragmenten van elke eppendorftube gescheiden?
Op basis van hun grootte door middel van polyacrylamidegelelektroforese
Waarom migreren de langere fragmenten minder ver dan de kortere fragmenten?
Omdat de langere fragmenten het lastiger hebben om zich door de gel te bewegen
Hoe kan men de sequentie achterhalen?
Door het bekomen bandenpatroon van de 4 reacties te analyseren
Wat is het voordeel van cyclisch sequencen?
Men heeft minder matrijs-DNA nodig
Hoe worden de ddNTPs gelabeld in de moderne Sangersequencing?
Met een verschillend fluorochroom voor elk type ddNTP
Wat is het voordeel van het gebruik van fluorescente ddNTPs?
Men heeft minder eppendorftubes nodig
Hoe worden de fluorescente fragmenten gescheiden?
Door capillaire gelelekroforese
Wat is het resultaat van de sequentieanalyse?
De sequentie van de matrijsketen
Wat is het gevolg van een frame shift als gevolg van een insertie of deletie in het mRNA?
Een incorrect leesraam en vaak een voortijdig stopcodon.
Wat is de notatie die verwijst naar de positie in het ORF van het gen?
c.
Welke ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het CFTR-gen?
Mucoviscidosis.
Wat is het effect van een insertie of deletie van 3 baseparen of een veelvoud daarvan?
Een frame shift.
Wat is de relatie tussen een incorrect leesraam en een voortijdig stopcodon?
Een incorrect leesraam bevat vaak een voortijdig stopcodon.
Hoe worden mutaties in het CFTR-gen genoteerd?
Met behulp van de ‘Standard Mutation Nomenclature in Molecular Diagnostics’.
Wat is het gevolg van een frame shift voor het eiwit?
Een eiwit dat vaak veel korter is dan het oorspronkelijke eiwit.
Wat is de functie van de notatie ‘p.’?
Om de positie in het eiwit aan te duiden.
Wat is de relatie tussen een frame shift en het leesraam?
Een frame shift leidt tot een incorrect leesraam.
Study Notes
Sanger Sequencing
- Frederick Sanger ontwikkelde in de jaren '70 een methode om DNA te sequeneren, genaamd Sanger sequencing.
- Sanger kreeg in 1980 de Nobelprijs voor het uitwerken van deze methode.
Originele Sangermethode
- De oorspronkelijke Sangermethode gebruikt het principe van de ddNTP (dideoxynucleotidetrifosfaat) keten terminatiemethode.
- dNTPs (deoxynucleotidetrifosfaat) zijn de standaard bouwstenen voor de DNA synthese.
- ddNTPs (dideoxynucleotides) zijn chemisch gemodificeerde nucleotide-analogen.
- Het 3' koolstofatoom van de ribose van een ddNTP bevat geen hydroxylgroep, maar slechts een H-atoom.
- Door de afwezigheid van de 3' hydroxylgroep kan er geen fosfodiësterbinding met een volgend nucleotide tot stand komen.
- Het ddNTP is een 'dead end' of stopnucleotide voor de DNA streng.
Procedures
- Het te sequeneren DNA (matrijsketen) is in hoge concentratie aanwezig en wordt verdeeld over 4 eppendorftubes.
- In elke eppendorftube wordt één van de vier types stopnucleotiden aangebracht (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP).
- De temperatuur wordt zodanig gewijzigd dat achtereenvolgens:
- het DNA enkelstrengs wordt gemaakt (denaturatie),
- de gelabelde primer kan binden (annealing),
- en tenslotte het DNA polymerase kan starten (extensie).
Resultaat
- Het resultaat is dat sommige nieuw gevormde DNA-strengen kort zullen zijn, omdat al redelijk snel een stopnucleotide werd ingebouwd.
- Het globaal resultaat is dat de eppendorftube gelabelde fragmenten van verschillende lengte bevat die complementair zijn aan de oorspronkelijke matrijsstreng en allemaal eindigen met ddGTP.
- De fragmenten van elke eppendorftube worden nu opnieuw enkelstrengs gemaakt en van elkaar gescheiden op basis van hun grootte door middel van polyacrylamidegelelektroforese.
Hedendaagse Sanger Sequencing
- Er zijn verschillende aanpassingen gebeurd aan het oorspronkelijke protocol.
- Cyclisch sequencen wordt gebruikt, waarbij opeenvolgende cycli van denaturatie, annealing en extensie worden toegepast.
- Fluorescente ddNTPs worden gebruikt in plaats van radiolabeling.
- Capillaire elektroforese wordt gebruikt om de fragmenten te scheiden.
Mutaties
- DNA-sequencing is het proces waarbij de volgorde van nucleotiden van een DNA-fragment wordt bepaald.
- Mutaties kunnen voorkomen in:
- Coderende sequenties van een gen (ORF)
- Regulerende sequenties van een gen, zoals de promoter
- Sequenties die betrokken zijn bij de processing van het mRNA
- Mutaties kunnen verschillende effecten hebben op het resulterende eiwit.
- Er bestaan verschillende soorten polymorfismen/mutaties:
- Substitutie
- Insertie
- Deletie
- Duplicatie
- Inversie
- Repeats
Sanger Sequencing
- Frederick Sanger ontwikkelde in de jaren '70 een methode om DNA te sequeneren, genaamd Sanger sequencing.
- Sanger kreeg in 1980 de Nobelprijs voor het uitwerken van deze methode.
Originele Sangermethode
- De oorspronkelijke Sangermethode gebruikt het principe van de ddNTP (dideoxynucleotidetrifosfaat) keten terminatiemethode.
- dNTPs (deoxynucleotidetrifosfaat) zijn de standaard bouwstenen voor de DNA synthese.
- ddNTPs (dideoxynucleotides) zijn chemisch gemodificeerde nucleotide-analogen.
- Het 3' koolstofatoom van de ribose van een ddNTP bevat geen hydroxylgroep, maar slechts een H-atoom.
- Door de afwezigheid van de 3' hydroxylgroep kan er geen fosfodiësterbinding met een volgend nucleotide tot stand komen.
- Het ddNTP is een 'dead end' of stopnucleotide voor de DNA streng.
Procedures
- Het te sequeneren DNA (matrijsketen) is in hoge concentratie aanwezig en wordt verdeeld over 4 eppendorftubes.
- In elke eppendorftube wordt één van de vier types stopnucleotiden aangebracht (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP).
- De temperatuur wordt zodanig gewijzigd dat achtereenvolgens:
- het DNA enkelstrengs wordt gemaakt (denaturatie),
- de gelabelde primer kan binden (annealing),
- en tenslotte het DNA polymerase kan starten (extensie).
Resultaat
- Het resultaat is dat sommige nieuw gevormde DNA-strengen kort zullen zijn, omdat al redelijk snel een stopnucleotide werd ingebouwd.
- Het globaal resultaat is dat de eppendorftube gelabelde fragmenten van verschillende lengte bevat die complementair zijn aan de oorspronkelijke matrijsstreng en allemaal eindigen met ddGTP.
- De fragmenten van elke eppendorftube worden nu opnieuw enkelstrengs gemaakt en van elkaar gescheiden op basis van hun grootte door middel van polyacrylamidegelelektroforese.
Hedendaagse Sanger Sequencing
- Er zijn verschillende aanpassingen gebeurd aan het oorspronkelijke protocol.
- Cyclisch sequencen wordt gebruikt, waarbij opeenvolgende cycli van denaturatie, annealing en extensie worden toegepast.
- Fluorescente ddNTPs worden gebruikt in plaats van radiolabeling.
- Capillaire elektroforese wordt gebruikt om de fragmenten te scheiden.
Mutaties
- DNA-sequencing is het proces waarbij de volgorde van nucleotiden van een DNA-fragment wordt bepaald.
- Mutaties kunnen voorkomen in:
- Coderende sequenties van een gen (ORF)
- Regulerende sequenties van een gen, zoals de promoter
- Sequenties die betrokken zijn bij de processing van het mRNA
- Mutaties kunnen verschillende effecten hebben op het resulterende eiwit.
- Er bestaan verschillende soorten polymorfismen/mutaties:
- Substitutie
- Insertie
- Deletie
- Duplicatie
- Inversie
- Repeats
Sanger sequencing is een methode om DNA te sequeneren. Deze methode is ontwikkeld door Frederick Sanger en is nog steeds de gouden standaard. Sanger kreeg twee Nobelprijzen voor zijn werk.
Make Your Own Quizzes and Flashcards
Convert your notes into interactive study material.
Get started for free
