30 Questions
Perché è preferibile sintetizzare il DNA partendo da frammenti del genoma anziché dal DNA genomico integro?
Per scegliere la zona del genoma umano d'interesse
Cosa si ottiene dopo 11 anni di sequenziamento del genoma umano?
Una libreria genomica
Qual è il processo necessario per convertire l'mRNA in DNA?
Retrotrascrizione
A cosa servono le sonde generate tramite PCR?
Al southern blot o northern blot
Perché il sequenziamento di un genoma umano è molto complicato?
Perché è lungo e costoso e può portare a tanti errori
Cos'è il dogma centrale della biologia?
DNA → RNA → PROTEINA
Qual è il principale obiettivo dei plasmidi ricombinanti ingegnerizzati?
Riconoscere i batteri contenenti il DNA ricombinante
Cosa accade all'unità trascrizionale della tetraciclina quando il plasmide viene tagliato a livello della polylinker?
Viene interrotta
Perché i batteri contenenti il plasmide chiuso iniziano a crescere sulla piastra contenente la tetraciclina?
Perché il plasmide è resistente alla tetraciclina
Cosa si ottiene quando si appoggia il foglietto di carta sulla piastra contenente i batteri?
Una copia speculare della piastra
Quale è il risultato finale della selezione inserzionale?
La selezione dei batteri contenenti il DNA ricombinante
Quale è il ruolo della polylinker all'interno del plasmide?
Interruzione dell'unità trascrizionale della tetraciclina
Che cosa viene clonato all'interno del plasmide per produrre insulina?
cDNA dell'insulina umana
Perché vengono utilizzati batteri invece delle cellule eucariotiche per produrre insulina?
Perché l'insulina non necessita di modifiche post-traduzionali
Cos'è un vettore di espressione?
Un sistema che deve avere un promotore
Qual è il nome del sito all'interno del plasmide che serve per scopi commerciali?
RBS
Che tipo di insulina veniva estratta inizialmente?
Insulina del maiale
Perché vengono utilizzati plasmidi ricombinanti per produrre insulina?
Perché producono elevate quantità di insulina
Perché possono non essere visibili le differenze di espressione genica tra i campioni?
Perché la PCR è un'amplificazione sintetica
Che cosa succede quando la PCR arriva al plateau?
Le differenze di espressione genica non sono più distinguibili
Perché è importante fermare la PCR prima che i campioni arrivino alla fase di plateau?
Perché le differenze di espressione genica sono più visibili nella fase esponenziale
Che cos'è la PCR quantitativa in tempo reale?
Una variazione tecnica della metodica PCR che permette di vedere la curva di amplificazione del gene in tempo reale
Perché è difficile bloccare l'esperimento alla fase esponenziale?
Perché non possiamo vedere a che punto si trova la PCR
Che cosa si può vedere durante la PCR quantitativa in tempo reale?
La curva di amplificazione del gene
Come vengono create le nanoparticelle lipidiche per introdurre DNA ricombinante all'interno delle cellule eucariotiche?
Inserendo DNA ricombinante all'interno di piccole vescicole fatte da un doppio strato fosfolipidico
Qual è il principio chimico-fisico che consente l'ingresso del DNA ricombinante all'interno delle cellule eucariotiche?
Fusione tra la vescicola e la membrana plasmatica
Come si chiamano le vescicole utilizzate per introdurre DNA ricombinante all'interno delle cellule eucariotiche?
Liposomi
Perché si utilizza il calcio fosfato per introdurre DNA ricombinante all'interno delle cellule eucariotiche?
Perché il calcio fosfato è carico positivamente e il DNA è carico negativamente
Qual è il metodo utilizzato per introdurre DNA ricombinante all'interno delle cellule eucariotiche che non sono permissive?
Utilizzo di virus ricombinati
Come vengono trattati i virus utilizzati per introdurre DNA ricombinante all'interno delle cellule eucariotiche?
Vengono resi non duplicanti
Study Notes
Estrazione del RNA e retrotrascrizione
- L'analisi dell'espressione di un gene richiede la estrazione del RNA e la retrotrascrizione per ottenere il DNA
- La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica utilizzata per amplificare il DNA, ma può essere sfavorita dall'arrivo a plateau
- È necessario interrompere la PCR durante la fase esponenziale per evitare di perdere le differenze tra i campioni
Analisi semi-quantitativa
- La PCR non è una tecnica quantitativa, poiché non fornisce informazioni sulla quantità assoluta del gene espresso
- Tuttavia, è possibile ottenere informazioni semi-quantitative sulla differenza di espressione del gene tra i campioni
PCR Quantitativa in Tempo Reale
- La PCR quantitativa in tempo reale è una variante della PCR che consente di visualizzare la curva di amplificazione del gene in tempo reale
- Questa tecnica permette di ottenere informazioni quantitative sulla espressione del gene
Libreria genomica
- Una libreria genomica è una raccolta di sequenze di DNA che rappresentano il genoma umano
- Le librerie genomiche vengono utilizzate per produrre sonde per l'analisi di sequenziamento e per creare vettori di espressione
Insulina ricombinante
- L'insulina è stata la prima proteina ricombinante prodotta attraverso la tecnica del clonaggio molecolare
- L'insulina viene prodotta utilizzando plasmidi ricombinanti all'interno di batteri
Vettori di espressione
- I vettori di espressione sono sistemi di conservazione delle sequenze di DNA umano
- I vettori di espressione devono avere un promotore per permettere l'espressione della proteina
Processo di retrotrascrizione
- Il processo di retrotrascrizione è il processo che converte l'mRNA in DNA
- Questo processo è necessario per clonare il gene all'interno di un plasmide
Introduzione di acidi nucleici all'interno delle cellule eucariotiche
- È più complesso introdurre un acido nucleico all'interno delle cellule eucariotiche rispetto alle cellule procariotiche
- Esistono diversi stratagemmi per introdurre gli acidi nucleici all'interno delle cellule eucariotiche, come l'utilizzo di nanoparticelle lipidiche, l'aggiunta di molecole di calcio fosfato e la microiniezione.
Learn about plasmids engineered to recognize recombinant DNA in bacteria colonies on a plate. This system is based on insertional selection and presents a second antibiotic resistance and a polylinker inserted into another resistant gene.
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