Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

Biologie cellulaire et moléculaire

• Cours dispensé par TRIPIER Sylvain
• Sujet : Réplication, Mutations, Réparations de l'ADN
• Programme : DTS IMRT
• Institution : École Supérieure Privée I SANTÉ&SOCIAL, neosup

Réplication de l'ADN

• La réplication est le processus de duplication de l'ADN lors de la division cellulaire pour assurer que chaque cellule fille reçoive une copie identique du patrimoine génétique.
• Avant la mitose, l'ADN se double.
• Les erreurs de réplication peuvent se produire et entraîner des mutations de l'ADN.
• La plupart des mutations sont réparées par des mécanismes cellulaires.
• Certaines mutations peuvent être léthales, mais d'autres peuvent conférer un avantage sélectif dans l'évolution d'une espèce.

Conditions de réalisation de la réplication

• Une molécule d'ADN parentale sert de modèle.
• Des nucléotides sous forme de désoxyribonucléotides triphosphates (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) sont nécessaires. Ceux-ci fournissent l'énergie pour la réaction.
• Une amorce d'ADN ou d'ARN ayant une extrémité 3'OH libre est requise.
• Des ribonucléotides triphosphates (ATP, UTP, CTP et GTP) sont aussi nécessaires.
• Des enzymes sont nécessaires pour séparer les brins d'ADN parentaux, et pour accrocher les nucléotides les uns aux autres.
• Des ions Mg2+ sont également requis.

Caractéristiques fondamentales de la réplication

• L’expérience de Meselson et Stahl a démontré que la réplication est semi-conservative. Cela signifie que chaque nouvelle molécule d'ADN est constituée d'un brin ancien et d'un brin nouvellement synthétisé.

Expérience

• Des bactéries cultivées sur un milieu contenant de l'azote lourd (15N) ont été transférées à un milieu contenant de l'azote léger (14N)
• L'ADN a été extrait et analysé après chaque réplication.
• Cette constatation a conduit à la conclusion que la réplication de l'ADN est semi-conservative.

Résultats

• L'expérience a confirmé que la réplication de l'ADN est semi-conservative.
• Après une réplication, les molécules d'ADN se composent d'un brin ancien et d'un brin nouveau.

Règles de la réplication

• La réplication se fait en sens 5'→3’.
• La réplication est complémentaire (A avec T et G avec C).
• La réplication est antiparallèle.

Œil de réplication

• Les hypothèses sur la réplication concernent le modèle monodirectionnel et le modèle bidirectionnel.

Conclusion de l'expérience

• La réplication est bidirectionnelle.
• La réplication se propage simultanément des deux côtés du point d'initiation.
• Les fourches de réplication ressemblent à la forme de la lettre Y.
• Plusieurs origines de réplication sont utilisées pendant la réplication.

Nombre de réplicons

• La taille du génome des E. coli est de 2.10^6 paires de bases. La taille du génome des mammifères est de 3.10^9 paires de bases.
• La vitesse de réplication est différente selon les espèces. Pour E. coli : 30 000 paires de bases par minute ; pour les mammifères : 3 000 paires de bases par minute.
• La durée de réplication pour E. coli est d'environ 1 heure. Pour les mammifères, elle est de 6 à 8 heures.

Fragments d'Okasaki

• Les fragments d'Okasaki sont constitués d'amorces d'ARN et de désoxyribonucléotides.
• Une ARN polymérase (primase) est requise pour créer l'amorce d'ARN.
• L'ADN polymérase ajoute ensuite les désoxyribonucléotides pour former les fragments.
• L'amorce d'ARN est remplacée par de l'ADN.
• Une enzyme (ligase) relie les fragments d’Okasaki pour compléter le brin d'ADN.

Les ADN polymérases

• L'ADN polymérase α commence l'initiation de la réplication en créant une amorce.
• L’ADN polymérase δ est responsable de la synthèse du brin précoce.
• L'ADN polymérase ε est responsable de la synthèse du brin tardif.
• L'ADN polymérase permet la réparation de l'ADN.
• Les hélicases démêlent l'ADN.
• Les topoisomérases relâchent la tension dans l'ADN.

Réplication fidèle ?

• La réplication peut entraîner des mutations de l'ADN, dites spontanées.
• La plupart des mutations sont réparées par les mécanismes cellulaires.
• Certaines mutations peuvent être léthales, mais d'autres peuvent conférer un avantage évolutif.

Résumé

• La réplication est semi-conservative.
• La réplication est bidirectionnelle.
• La réplication est complémentaire et antiparallèle.
• La réplication est semi-discontinue.

Mutations de l'ADN

• Définition : modification de la séquence nucléotidique d'un gène, soit spontanée, soit induite par des agents extérieurs.
• Les mutations ponctuelles impliquent un changement singulier de la séquence. Les réarrangements impliquent des modifications plus larges.
• Causes des mutations :
  • Erreurs de copie lors de la réplication
  • Agents mutagènes (ex: substances chimiques, radiations)
  • Erreurs de réparation de l'ADN
• Classification des mutations selon leurs conséquences
  • Les mutations sans changement de cadre de lecture (silencieuses, faux-sens et conservatrices)
  • Les mutations avec changement de cadre de lecture (délétions et insertions).

Agents mutagènes

• Agents chimiques : analogues de bases, agents alkylants, intercalants, produits chimiques altérant la structure et l'appariement des bases
• Agents physiques : radiations (UV , rayons X, gamma)

Mécanismes de réparation de l'ADN

• Restauration de la zone endommagée
• Suppression de la zone endommagée
• Tolérance de la zone endommagée
• Réparation des mésappariements
• Réparation par excision de nucléotides (NER)

Phase de réplication

• La réplication se déroule pendant la phase S du cycle cellulaire, d'une durée d'environ 8 heures chez les cellules humaines.

Télomères

• Les télomères sont des régions répétées en fin des chromosomes qui maintiennent l'intégrité des chromosomes au cours du cycle cellulaire.
• Les télomères sont raccourcis à chaque division cellulaire, et leur raccourcissement peut être lié à la sénescence cellulaire ou au cancer.

Implication des télomères dans la sénescence cellulaire

• L'allongement des télomères grâce à la télomérase peut prolonger la capacité de division des cellules.

Amplification de fragments d'ADN in vitro (PCR)

• La PCR est une technique utilisée pour amplifier des sections spécifiques d'ADN in vitro.