BM UD8. Técnicas de Reacción en Cadena Polimerasa (PCR)

Cuestionario de PCR

• Se pregunta sobre varios aspectos de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
• La PCR puede aumentar el tiempo para obtener múltiples fragmentos de ADN en comparación con la clonación de vectores con ADN recombinante en bacterias.
• Las copias de ADN obtenidas en un ciclo de PCR sirven como moldes para ciclos posteriores, generando copias exponenciales del fragmento.
• Las tres fases consecutivas de la PCR son la desnaturalización, hibridación y la amplificación.
• El cebador F (Forward) se une a la hebra molde con dirección 3' a 5'.
• El cebador R (Reverse) se une a la hebra molde con dirección 5' a 3'.
• En la PCR, la ADN polimerasa inicia una nueva cadena de ADN que se elonga para copiar completamente el gen seleccionado.
• Los cebadores definen y delimitan la región diana que se amplifica en la PCR.
• Se recomienda que la región 3' del cebador no contenga tres o más G/C seguidas, para evitar uniones inespecíficas al ADN.
• Las ADN polimerasas se desactivan con el calor; se usa la polimerasa termoestable Taq.
• La ADN polimerasa no tiene actividad exonucleasa para corregir o reparar la nueva hebra.
• Para estudios de mutaciones, se emplea Taq polimerasa con exonucleasa 5' a 3' sin actividad exonucleasa 3' a 5' para disminuir errores en la creación de nuevas hebras de ADN.
• La fase de desnaturalización ocurre a 94°C durante 15-30 segundos.
• La fase de elongación se produce a 72 °C.
• Es normal obtener amplificados deseados y no deseados tras ciclos repetidos de PCR.
• En el primer ciclo de PCR, es habitual que la cadena de ADN se elongue más de lo deseado.
• A partir del tercer ciclo de PCR, se obtienen secuencias exactas llamadas amplicones.

Mezcla de Reacción PCR

• La mezcla de reacción PCR contiene Tris (Tris-aminometano o Tris-amina), para tamponar entre 7 y 9 de pH.
• El tampón de reacción contiene cloruro de magnesio (cofactor de la polimerasa), desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP), cebadores, ADN polimerasa (Taq polimerasa) y ADN molde.
• La concentración de MgCl2 debe ser optimizada, ya que una baja concentración inactiva la ADN polimerasa, y una alta disminuye la fidelidad de replicación.
• La mezcla de reacción debe contener los cuatro dNTP en la misma concentración. Si no, disminuye la fidelidad de la enzima.
• La concentración de los cebadores debe establecerse experimentalmente, pero siempre debe ser la misma para cada pareja.
• La elección de la ADN polimerasa depende de la longitud del fragmento, de la fidelidad requerida y de la secuencia que se va a amplificar.
• Una concentración excesiva de ADN polimerasa no supone ninguna mejora en el rendimiento de la reacción, pero sí un aumento considerable del coste.
• La cantidad de ADN molde requerida depende del tipo de ADN que se trate (ADN genómico, plasmídico, etc).
• En cualquier caso, no se sobrepasarán 10ng de ADN/µl de mezcla de reacción, lo que equivale a 500 ng de ADN para un volumen de reacción de 50 µl.

Aditivos y Potenciadores

• Aumentan el rendimiento de la reacción y disminuyen la aparición de productos no deseados.
• DMSO y la formamida disminuyen Tm del ADN.
• La gelatina, el glicerol el PEG (polietilenglicol) estabilizan la Taq Polimerasa.
• La BSA (Albúmina bovina) bloquea inhibidores.
• Tween 20 y Triton X100 son detergentes que previenen la agregación de la polimerasa.

Preparación de Muestras en PCR

• La preparación de las muestras requiere ajustar el volumen de reacción, elaborar la mezcla master y establecer los controles positivo y negativo.
• El volumen típico de reacción (volumen final) es de 25 o 50 microlitros.
• Los componentes de la reacción de PCR se suministran concentrados ya que los volúmenes utilizados son muy pequeños.
• Mezclar todos los componentes de la mezcla de PCR para garantizar la homogeneidad se conoce como realizar una mezcla master.
• Para calcular la cantidad para cada componente, hay que multiplicar por el número de tubos +1 para compensar por error y evitar que se termine antes de realizar el último tubo de reacción.

Programación del termociclador

• Es necesario programar las temperaturas y los tiempos de incubación de cada una de las fases del ciclo básico de PCR: Desnaturalización, Hibridación (annealing) y Extensión.
• El ciclo de desnaturalización inicial tiene una temperatura de 95 grados celsius, durante 3 minutos y se usa 1 ciclo.
• La desnaturalización en la replicación ocurre a 95 grados durante 30 segundos, y se usan entre 25-35 ciclos.
• La hibridación del cebador ocurre a 57 grados durante 30 segundos, se usan entre 25-35 ciclos.
• La extensión ocurre a 72 grados durante 45 segundos, se usan entre 25-35 ciclos.
• La extensió final ocurre a 72 grados durante 7 minutos y se completa un ciclo.
• El mantenimiento ocurre a 4 grados y se hace de forma indefinida.
• La mezcla calentada a 95°C durante varios minutos asegura la desnaturalización de las cadenas de ADN de la mezcla de reacción.

Control Positivo y Negativo

• El control positivo es un tubo con la mezcla master, a la que se añade ADN molde que contiene el fragmento que se quiere amplificar.
• El control negativo en este tubo se sustituye el ADN por un volumen igual de agua grado PCR.
• Para descartar el falso positivo, se incluye un control negativo.

Técnicas de PCR Convencional

• La PCR estándar se utiliza principalmente con fines diagnósticos, amplificando secuencias de hasta 3,5 kb.

Amplificación de Fragmentos de ADN

• Se pueden amplificar varios fragmentos de ADN en una única PCR múltiple.

Formato de Cebadores

• Los cebadores son fragmentos monocatenarios con secuencias complementarias a las regiones que flanquean el fragmento de ADN que se quiere amplificar.

Dirección de Copiado

• La PCR utiliza cebadores para copiar en dirección 5' a 3', no en dirección 3' a 5'.

Ciclo Natural de la PCR

• El ciclo natural de una PCR incluye la desnaturalización, la hibridación de los cebadores en la hebra molde y la extensión.

Control de Calidad Post-PCR

• Una vez finalizada la PCR, se corren las muestras en un gel para verificar su nivel de calidad.
• El ADN debe aparecer sin banda en el control negativo.. La aparición de una banda en el control negativo indica contaminación de los reactivos y/o pipetas utilizadas.

Técnicas de PCR Convencional

• Son PCR con inicio en caliente - Hot Start PCR.
• PCR de grandes fragmentos.
• PCR de alta fidelidad.
• PCR anidada - Nested PCR.
• PCR múltiple - Multiplex PCR.
• PCR con transcripción inversa - RT PCR.

PCR con inicio en caliente - Hot Start PCR

• Reduce la amplificación no específica durante la fase inicial de la PCR, evita la actividad de la polimerasa a baja temperatura.
• Aislan la polimerasa en el interior de esferas de cera que liberan la enzima cuando se alcanza una temperatura adecuada, y el método más especializado consiste en la inactivación de la polimerasa mediante un anticuerpo o mediante la unión termolábil a un grupo químico inactivador.
• Tras un ciclo a alta temperatura, se liberan los inhibidores y la polimerasa es activa de nuevo.

PCR de grandes fragmentos

• Esta técnica permite amplificar fragmentos de hasta 35kb modificando la mezcla de reacción y la programación del termociclador.
• Se utiliza una mezcla de polimerasas: una de ellas, "mayoritaria" y con una concentración elevada, sin actividad correctora de errores y otra polimerasa, "minoritaria" en baja concentración.
• En caso de que la polimerasa mayoritaria incorpore un nucleótido erróneo y origine un producto truncado que detenga la polimerización, la polimerasa con actividad exonucleasa elimina este nucleótido que impide la continuación de la polimerización.
• La mezcla de reacción incluye aditivos tales como DMSO, que favorece la desnaturalización, o Glicerol que estabiliza las ADN polimerasas.

PCR de alta fidelidad

• PCR diseñada para amplificar productos en condiciones especiales para evitar introducir mutaciones puntuales.
• La mezcla estándar de la PCR de alta fidelidad incluye polimerasas termoestables con actividad correctora y se ajustan los niveles de pH y Mg2+ para asegurar unas condiciones óptimas para dichas enzimas.

PCR anidada - Nested PCR

• Técnica para aumentar la sensibilidad y especificidad de la PCR a través de dos reacciones de PCR acopladas.
• La muestra que se amplifica en la segunda PCR es el producto de amplificación de la primera PCR.
• Primera PCR: Se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que la región de interés (cebadores externos a la región a amplificar).
• Segunda PCR: se diseñan para amplificar la región de interés e hibridan en el interior del fragmento amplificado en la primera PCR (cebadores internos).

PCR múltiple - Multiplex PCR

• Amplifica simultáneamente varias secuencias diana, en el mismo tubo en una sola PCR utilizando juegos de cebadores específicos para una región diferente los cuales deben cumplir una serie de requisitos:
• La temperatura de hibridación con su diana debe ser similar. Solo se utiliza un programa, con una temperatura de hibridación programada y todos los cebadores deben unirse con la misma eficiencia a dicha temperatura.
• Deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos con otros formando dímeros u oligómeros.

PCR con transcripción inversa - RT PCR

• Permite amplificar y analizar secuencias de ARNm.
• Como paso previo, se debe sintetizar un ADNc (complementario) mediante la retrotranscriptasa inversa.
• En un segundo paso, una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y lo amplifica.

Retrotranscripción

• Al igual que las polimerasas, las retrotranscriptasas necesitan primers que formen una pequeña región de doble hélice en el ARN molde para poder sintetizar ADNC. Actualmente se siguen 3 estrategias en la RT-PCR
• 1. Utilizar una mezcla de hexanucleótidos que hibridan al azar en múltiples posiciones de todas las moléculas de ARN presentes en la muestra. Se transcribe cualquier ARN.
• 2. Utilizar un oligo-dT que hibrida con las colas de poli-A de los ARNm presentes en la muestra. Solo se transcribe ARNm.
• 3. Usar un cebador específico para una secuencia determinada, en concreto uno de los cebadores que se va a utilizar en la PCR posterior. De esta manera solo se transcribe a ADNc exclusivamente el fragmento de ARN que contiene la secuencia que queremos amplificar.

PCR a Tiempo Real

• Permite seguir la cinética de cada reacción en tiempo real, por lo que permite una cuantificación sensible y específica del blanco que se desea analizar, al utilizar la fase exponencial de la curva de amplificación.
• Minimiza los problemas de contaminación ya que la amplificación y la detección se realizan en el mismo tubo cerrado.

Cinética de amplificación

• Posee tres fases de amplificación:
• Fase de ruido: fluorescencia que se detecta a la señal fluorescente de fondo en cada tubo.
• Fase de crecimiento exponencial: Curva lineal y de gran pendiente.
• Fase de meseta: Curva lineal pero de pendiente reducida debido a la disminución del rendimiento en los últimos ciclos de PCR.

Sistemas fluorescentes de detección de amplicones

• Pueden ser independientes de secuencia o específicos de secuencia.
• Sistema de detección independiente de secuencia: Se basa en el empleo de agentes fluorescentes intercalantes, sustancias que aumentan su emisión de fluorescenci.

PCR cuantitativa (qPCR).

• Permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra.
• El termociclador a tiempo real detecta el ciclo de la PCR en el que la fluorescencia de la muestra alcanza un valor por encima del límite de detección (Punto de Corte o Cp).
• El Cp de una muestra es inversamente proporcional a la cantidad inicial de la molécula diana en ella.

Cuantificación absoluta

• Expresa la cantidad de secuencia diana en la muestra en unidades de concentración o en número de copias por unidad de volumen.

Cuantificación relativa

• Consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en relación a la concentración de un gen de referencia que está presente en todas las muestras con un número constante de copias.

Detección de mutaciones.

• Permite analizar la curva de fusión con base a la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia frente a la temperatura.
• Hay tres tipos de curva de fusión posibles:
• Curva con un pico de fusión correspondiente al punto de fusión de la sonda (Homocigota normal).
• Curva con un pico de fusión a una temperatura menos al punto de fusión de la sonda (Homocigota mutado).
• Curva con dos picos de fusión, uno a la temperatura de fusión de la sonda y otro a una temperatura menor (Heterocigota mutado).