Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

• La PCR amplifica selectivamente una secuencia específica de ADN en un tubo de ensayo.
• Se utilizan cebadores (oligonucleótidos) de 20-30 bases que flanquean la secuencia objetivo, actuando como punto de partida para la ADN polimerasa.
• Los cebadores, forward y reverse, son complementarios a los extremos inicial y final de la cadena objetivo.
• La reacción requiere: ADN blanco, ADN polimerasa termoestable, cebadores, desoxirribonucleótidos (dNTPs), MgCl2 y un tampón.

Componentes de la Reacción

• Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs): Sustratos esenciales en exceso para la síntesis de ADN, se utilizan a una concentración de 50-200 µM acompañados de iones Mg+2.
• Cebadores (oligonucleótidos): Son cruciales para la especificidad. Un cebador de 10 bases tiene una probabilidad baja de unirse a una secuencia aleatoria, pero cebadores de 16 bases o más se unen casi a un solo sitio en un genoma.
  • La temperatura de fusión (Tm) de los cebadores debe ser similar para una hibridación eficiente. Se calcula como: Tm = 2(A+T) + 4(G+C).
  • La temperatura de hibridación (generalmente 5°C por debajo de la Tm) es crucial para la unión a la hebra objetivo, y depende de la concentración, longitud y secuencia de los cebadores.
  • Los cebadores deben tener un contenido de G+C de aproximadamente 50%, evitar regiones ricas en pirimidinas/purinas, no ser complementarios entre sí, y evitar estructuras secundarias.
  • Se utilizan normalmente en una concentración de 0.1 a 0.5 µM.
• ADN polimerasa termoestable (ej. Taq polimerasa): Enzima activa a altas temperaturas (75-95 °C) aislada de Thermus aquaticus, permitiendo múltiples ciclos de replicación sin inactivarse. Se usa a 1 U/50 µL de reacción.
• Tampón (buffer): Contiene KCl (50mM), Tris-HCl (10mM, pH 8.3) y MgCl2 (1.5mM) para la hibridación y como cofactor de la enzima.
• ADN blanco (molde): Secuencia a amplificar; su calidad y cantidad son esenciales. Evitar sustancias que inhiban la Taq polimerasa (ejemplo: hemo, urea, etanol, SDS).

Etapas del Proceso

• Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN a 95°C.
• Anillamiento: Hibridación de cebadores a las hebras sencillas a 37-65°C (10-120 segundos).
• Extensión: ADN polimerasa alarga los cebadores utilizando las hebras originales como molde (5' → 3') hasta completar la secuencia o iniciar un nuevo ciclo. Duración entre 30-120 segundos.

Consideraciones Importantes y Prevención de Contaminaciones

• La PCR es una técnica sensible, se requieren rigurosos protocolos para evitar contaminaciones.
• Realizar PCR y electroforesis en áreas separadas.
• Utilizar guantes, puntas de pipeta con filtro y material estéril.
• Terminar de preparar la reacción simultáneamente y comenzar los ciclos de temperatura rápidamente.
• Descongelar los reactivos con cuidado.
• Usar agua ultrapura desionizada, autoclavada y filtrada.
• Mantener la Taq polimerasa fría (congelada o en hielo) para evitar su desactivación.
• Identificar correctamente los tubos.
• Si el termociclador presenta evaporación, agregar aceite mineral estéril a los tubos.

Este cuestionario explora los fundamentos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), una técnica esencial en biología molecular para amplificar secuencias específicas de ADN. Preguntaremos sobre los componentes clave y el proceso de amplificación. Además, se analizará la importancia de los cebadores en la especificidad del ADN amplificado.