Purification des protéines

• Les notes de cours portent sur la manipulation et l'étude des protéines.

Purification des protéines

• Les protéines doivent être en solution pour être purifiées.
• Les protéines extracellulaires présentes dans le plasma sanguin sont purifiées par centrifugation du plasma et récupération des protéines dans le surnageant.
• La purification des protéines cellulaires implique le prélèvement d'un fragment d'organe, son homogénéisation, la lyse douce des cellules, et la centrifugation à la vitesse appropriée en fonction de la localisation de la protéine.
• La centrifugation initiale est cruciale car elle permet d'enrichir la préparation en protéine d'intérêt tout en éliminant les matériaux indésirables.
• La vitesse de sédimentation pendant la centrifugation dépend de l'écart entre la densité d'une particule et celle du solvant.
• Si la densité de la particule est supérieure à celle du solvant, il y a sédimentation.
• Les phases obtenues sont récupérées dans des tubes séparés afin d'isoler différents composés.
• Une technique utilisée pour séparer un mélange de protéines.
• La chromatographie implique une phase stationnaire (par exemple, papier, gel poreux, billes) et une phase mobile (gaz ou liquide).
• L'échantillon est déposé au sommet d'une colonne, puis la phase mobile est ajoutée.
• La vitesse à laquelle les protéines migrent dépend de leurs propriétés, ce qui permet de les séparer.

Chromatographie d'échange d'ions

• La séparation de protéines en fonction de leur charge implique une phase immobile chargée (polymère) et une phase mobile (solution aqueuse tamponnée).
• Les molécules avec la même charge que la phase stationnaire sont éluées.
• Les molécules de signe contraire sont retenues dans la colonne.
• Les protéines retenues sont récupérées par compétition, en ajoutant un sel comme du NaCl.
• La charge d'une protéine varie avec le pH, ce qui permet des séparations très différentes.
• Une résine échangeuse de cations retiendra principalement les cations.

Chromatographie d'exclusion

• Les protéines sont séparées en fonction de leur taille en utilisant une matrice stationnaire poreuse et une phase mobile aqueuse tamponnée.
• Les petites molécules sont piégées dans les pores du polymère, tandis que les protéines plus volumineuses traversent les espaces entre les billes.
• Les grosses molécules atteignent donc le bas de la colonne en premier.
• Différentes fractions sont collectées dans des tubes distincts.
• Le temps de rétention est la durée entre le dépôt et la sortie d'une protéine de la colonne.
• Le temps de rétention est inversement proportionnel à la taille des protéines.
• L'approche permet d'estimer approximativement la masse moléculaire des protéines.
• Il est également possible de séparer les protéines par taille en utilisant la dialyse.

Chromatographie d'affinité

• Des protéines sont capturées par leur ligand.
• Une phase stationnaire avec un ligand spécifique à la protéine d'intérêt est utilisée, ainsi qu'une phase mobile aqueuse tamponnée.
• Les protéines d'intérêt sont capturées en raison de leur affinité pour le ligand.
• Les protéines retenues sont ensuite éluées en ajoutant une grande quantité de ligand soluble, qui se lie aux protéines et les libère sous forme de complexe protéine-ligand.

Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

• Le principe est identique à celui de la chromatographie classique, mais utilise des microbilles incompressibles de silicate ou d'alumine comme phase stationnaire.
• La HPLC améliore la vitesse de flux et la résolution de la séparation.
• C'est une technique très puissante.

Électrophorèse

• Des particules chargées migrent dans un champ électrique.
• La distance de migration dépend de la vitesse de migration.

Électrophorèse SDS-PAGE

• SDS-PAGE utilise du dodécylsulfate de sodium (SDS), un agent dénaturant qui confère des charges négatives aux protéines.
• SDS se lie aux protéines et submerge leurs charges intrinsèques.
• Toutes les protéines sont accélérées avec la même force, indépendamment de leur charge.
• Les protéines sont séparées en fonction de leur taille, les petites protéines se déplaçant plus rapidement que les grosses.
• La distance de migration peut être utilisée pour estimer la taille d'une protéine.
• La présence de ponts disulfure dans la structure 3D d'une protéine nécessite l'utilisation d'agents réducteurs pour les rompre.
• Le nombre de bandes dans une électrophorèse SDS-PAGE donne une évaluation qualitative de la pureté d'une purification.
• L'épaisseur des bandes est une indication quantitative, mais peu précise.
• L'analyse d'une électrophorèse SDS-PAGE permet de comparer la présence de protéines dans des cellules traitées dans des conditions différentes.
• Le poids moléculaire d'une protéine peut ainsi être déterminé.
• La distance de migration sur un gel est directement liée à la taille des protéines et donc à leur masse moléculaire.
• L'utilisation de marqueurs de taille permet de déterminer le poids moléculaire d'une protéine par comparaison.
• L'électrophorèse est un excellent moyen d'isoler des mélanges complexes de protéines et d'estimer la taille des protéines inconnues.

Isoélectrofocalisation

• Les protéines sont séparées en fonction de leur point isoélectrique (pI).
• La charge nette des protéines dépend du pH.
• Au pI, une protéine ne migre pas dans un champ électrique.
• Chaque protéine migre dans le champ électrique jusqu'à la zone de pH correspondant à son pI.
• L'isoélectrofocalisation peut séparer les mélanges de protéines en fonction de leur pI.
• L'isoélectrofocalisation permet de déterminer le pI d'une protéine purifiée inconnue.
• L'électrophorèse bidimensionnelle combine l'isoélectrofocalisation et L'électrophorèse SDS-PAGE. Les protéines sont triées par pI puis par taille.

Spectrophotométrie

• Mesure l'absorbance à une longueur d'onde de 280 nm.
• Permet pas de déterminer la quantité d’une protéine d’intérêt contenue dans un mélange de protéines non purifiée.

Immunodosage ELISA

• ELISA est utilisé pour quantifier une protéine en utilisant des anticorps.
• ELISA direct sandwich les étapes sont les suivantes :
  • Un anticorps de capture est fixé sur une plaque. Il reconnait l'antigène, ie, la protéine d'intérêt
  • Un lavage est effectué pour retirer les anticorps qui ne se sont pas fixés
  • Ajout d’extrait de la protéine -Un lavage est effectué pour retirer les composantes, sauf le complexe protéine anticorps
  • Un anticorps de détection est ajouté, il se lie à la protéine et est couplé à une enzyme -On effectue un lavage pour retirer les anticorps non fixés à la protéine
  • On ajoute un substrat. la coloration dépend de la quantité de protéine, en d'autres termes, une réaction colorimétrique
  • Quantification de la coloration.
• L'ELISA permet la détermination de la quantité dans un échantillon

Immunotransfert (Western Blot)

• Les protéines sont visualisées en utilisant des anticorps. Étapes :
  • Électrophorèse SDS-PAGE
• Séparation des protéines sur la surface d'une membrane dans un champ électrique
• La membrane est saturée afin d'éviter des liaisons non spécifiques
• Les anticorps se lient à la protéine désirée Lavage pour éliminer les anticorps non liés
• Les anticorps secondaires cibleront l'anticorps primaire, et permettront d'amplifier le détectable
• Western blots donne une visualisation précise de la protéine

Séquençage d'Edman

• Le séquençage d'Edman dégrade la séquence d'une protéine étape par étape.
• Trois étapes sont réalisées :
  • Couplage en milieu basique
  • Phase de clivage en milieu acide Conversion des aa-ATZ stables, en un aa-PTH. L'identification d'un aa-PTH peut se faire par chromatographie
• Le premier cycle identifie le premier aa, N-terminal Le test peut être répété une vingtaine de fois

Digestion par proteases

• Les protéases clivent les proteines au niveau de sites spécifiques
• Ex: la trypsine clive les proteins aprés les résidus lysine et arginine

Détermination de la conformation des protéines par diffraction aux rayons X

• Procédure :
  • Les protéines subissent d'abord une cristallisation
  • Une figure de diffraction est ensuite créée
• Une carte mathématique de la densité electronique est ensuite construite. La séquence de protéines et électrons s'alignent La structure de crystal reflètera la forme d'environnements d'eaux.

Spectrometrie de masse

Détermine la masse des protéines avec précision Accélération des particules et détermination du temps de vol Applications :

• Protéine connue : Déterminer s'il y a des modifications post- traductionnelles (glycosylation..)
• Protéine inconnue :

1. Fragmentation de la protéine par clivages spécifiques (protéases)
2. Comparaison des résultats de spéctro obtenus sur ces fragments avec ceux de fragments connus identification de la protéine