Princípios de Biossegurança

Princípios de Biossegurança

• Biossegurança é um conjunto de ações e procedimentos para minimizar ou evitar riscos em atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços.
• Busca-se conter o risco de exposição a agentes nocivos a pessoas e ao meio ambiente em laboratórios.
• Os métodos de contenção são classificados em primários e secundários, formando as bases da biossegurança.
• Para preservar a segurança, nunca se deve guardar produtos dentro do laboratório, mantendo no interior apenas os que estão em uso.
• A utilização de equipamentos de segurança, juntamente com boas práticas, ajuda a eliminar ou reduzir os riscos da atividade.

Contenção Primária

• A contenção primária protege a equipe diretamente envolvida e o ambiente de trabalho
• É realizada por meio de práticas microbiológicas seguras e equipamentos de segurança individuais e coletivos.

Contenção Secundária

• A contenção secundária protege o ambiente externo e pessoas não diretamente envolvidas no laboratório;
• Diz respeito às instalações físicas, localização e construção do laboratório.
• Laboratórios devem ter controle de acesso, portas fechadas, área para lavar mãos e guardar pertences, além de paredes, pisos e bancadas fáceis de limpar e desinfetar.
• Bancadas e móveis devem suportar o peso dos equipamentos, e deve haver local para desinfetar amostras e guardar produtos.

Classificação de Risco de Micro-organismos

• A avaliação de risco reconhece agentes biológicos e a probabilidade de danos, considerando o agente, tipo de ensaio, o trabalhador e a espécie animal.
• Avalia procedimentos, infraestrutura e o grau de treinamento das equipes, organização do trabalho e práticas gerenciais. Grupo de Risco 1: Microrganismos com baixíssima probabilidade de causar doenças em humanos ou animais, como Lactobacillus sp.
• Grupo de Risco 2: Agentes patogênicos que podem causar doenças em humanos ou animais, com risco limitado de propagação como Schistosoma mansoni, Ehrlichia spp e Leptospira interrogans (todos os sorotipos).
• Grupo de Risco 3: Patógenos que causam doenças graves em humanos ou animais, com tratamento e medidas de prevenção eficazes como Histoplasma capsulatum, Mycobacterium bovis (exceto a cepa BCG) e Brucella spp (todas as espécies) .
• Grupo de Risco 4: Agentes que causam doenças graves em humanos ou animais, facilmente transmitidos, com tratamento ou prevenção nem sempre disponíveis, como Herpesvirus do macaco (vírus B), vírus da aftosa, vírus da cólera suína e Ebola.

Equipamentos de Segurança

• Equipamentos de segurança são divididos em Equipamentos de Proteção Individual (EPI) e Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC).
• Equipamentos de proteção individual (EPI) são dispositivos de uso individual para proteger dos riscos nas atividades.
• Jalecos de uso obrigatório e restrito ao laboratório que possui mangas longas, altura até os joelhos e sempre abotoado, deve ser trocado diariamente ou semanalmente dependendo das atividades.
• Luvas são de uso obrigatório, principalmente em procedimentos com exposição a sangue, hemoderivados e fluidos orgânicos.
• Máscaras e óculos de proteção devem ser usados quando necessário, para vapores nocivos, como na extração de DNA com Fenol Clorofórmio.
• Equipamentos de proteção coletiva são aqueles que protegem mais de um colaborador e o ambiente de trabalho, sendo essencial ter cuidado ao manuseá-los para assegurar a proteção de todos.
• Capela de exaustão é utilizada para manipular substâncias tóxicas e voláteis, com uso de máscara se o produto for muito tóxico ou concentrado, usada para produtos químicos como fenol e clorofórmio.
• Cabine de Segurança Classe I protege o operador com o ar circulando internamente e sendo enviado ao ambiente após passar pelo filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air), que elimina aerossóis.
• Cabine de Segurança Classe II protege o operador, o ambiente e o produto, diferenciando-se da Classe I por proteger a amostra do ambiente externo, com 70% do ar reciclado na cabine e 30% expelido após passar pelo filtro HEPA.
• A escolha da cabine de segurança depende do tipo de atividade e risco para o operador, produto e meio ambiente.

Instalações Laboratoriais

• O nível de biossegurança recomendado determina as intervenções necessárias nas instalações, com separação das áreas de passagem dentro do edifício, como um corredor sem saída ou uma antecâmara.
• Paredes, tetos e pisos devem ser laváveis e selados para evitar contaminações, com sistemas de ventilação adequados
• É essencial a presença de autoclave para descontaminação de vidrarias
• Seguir os protocolos de acondicionamento e transporte de resíduos infecciosos para descontaminação e descarte.

Normas de Segurança Geral no Laboratório

• Trabalhar com seriedade, atenção e calma.
• Usar jaleco, calças compridas, calçado fechado e cabelos presos, sem adornos como brincos grandes, anéis, pulseiras e correntes.
• Utilizar luvas, consultando o técnico responsável ou o padrão operacional sobre a luva apropriada.
• Manter objetos pessoais fora do laboratório, em armário específico.
• É proibido comer ou fumar no laboratório.
• Ler o manual e ter o técnico do laboratório presente ao operar um equipamento pela primeira vez.
• Manipular reagentes tóxicos e voláteis na capela de exaustão com o exaustor ligado.
• Não pipetar ou abrir materiais com a boca.
• Frascos devem ter rótulos com a identificação, rotulagem e classificação de risco, segundo a legislação.
• Ler o rótulo antes de abrir frascos ou manipular substâncias, nunca direcionando a abertura para si ou outros.
• Observar a tensão elétrica dos equipamentos e o estado físico de fios, tomadas e plugues, utilizando-os apenas se estiverem em bom estado.
• Anotar a data, o horário de início e fim de uso de equipamentos em livros, seguido de assinatura.
• Não utilizar equipamentos elétricos sobre superfícies úmidas ou próximos a produtos inflamáveis.
• Estudar protocolos e possíveis riscos antes de realizar atividades.
• Desligar equipamentos elétricos ao fim do expediente, anotando no quadro de avisos se houver autorização para deixá-los ligados.
• Acondicionar reagentes ou soluções preparados em frascos rotulados com nome, concentração, data e responsável.
• Verificar o estado de conservação dos materiais antes do uso (pinças, espátulas, vidraria, etc.).
• Devolver materiais e equipamentos aos seus lugares após o uso.
• Limpar a bancada antes e depois de qualquer procedimento com papel-toalha e álcool 70%.
• Conter e limpar derramamentos de reagente imediatamente, consultando o técnico sobre a toxidez e limpeza.

Limpeza Biológica do Laboratório

• Conhecer os termos descontaminação, desinfecção e esterilização é importante para a segurança biológica do laboratório.
• Na desinfecção, microrganismos morrem por meios físicos ou químicos, mas não há destruição de esporos.
• Na esterilização, ocorre a morte de todas as classes de microrganismos, incluindo esporos.
• A descontaminação protege os profissionais da limpeza de superfícies ou objetos contaminados, tornando-os seguros para contato.

Descarte de Materiais e Resíduos

• O descarte deve seguir o tipo de material biológico ( ou químico) utilizado e as diretrizes da instituição, considerando os graus de risco envolvidos

Principais Reagentes Químicos - Agarose

• Agarose é uma substância não perigosa
• Em caso de inalação, exposição ao ar fresco.
• Em caso de contato com a pele, lavar abundantemente com água e tirar a roupa contaminada.
• Em caso de contato com os olhos, enxaguar abundantemente com água.
• Em caso de ingestão, beber água ( no máximo dois copos) e consultar médico se houver algum mal estar.
• A água, espuma, dióxido de carbono, ou pó seco são meios adequados de extinção
• Nenhuma limitação de agentes extintores é dada para essa substância/mistura
• Material combustível forma gases inflamáveis e vapores perigosos em caso de incêndio.

Extração de Ácidos Nucleicos

• A classificação celular é feita em procariontes e eucariontes, com fósseis de procariontes datados de três bilhões de anos e eucariontes de um bilhão de anos atrás.
• Procariontes: Sem envoltório celular do material genético, organelas e citoesqueleto
• Plasmídeos: Filamentos de DNA circulares encontrados em procariontes
• Membrana plasmática rica em lipopolissacarídeo
• Eucariontes: Membrana nuclear protege o DNA do movimento do citoesqueleto, compartimentos eficientes na metabolização
• Separação da duplicação de DNA (replicação) e síntese de RNA a partir do DNA (transcrição).
• Ácidos nucleicos: Macromoléculas de nucleotídeos (pentose, grupo fosfórico e base nitrogenada), divididos em DNA (ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico).
• DNA: Principal constituinte dos cromossomos e contêm todos os genes
• RNA: Diferentes tipos são formados no núcleo (mensageiro, ribossômico e transportador), passam para o citoplasma e promovem a síntese de proteínas.
• DNA é uma macromolécula orgânica (Ácido Desoxirribonucleico), que possui material genético, conhecido também por código genético.
• RNA: Tem a capacidade de replicar-se.
• DNA tem a capacidade de guiar e modificar o desenvolvivmento de organismos vivos (exceto RNA - vírus)
• DNA possui dupla-hélice, pontes de hidrogênio, nucleotídeos, base nitrogenada e pentose, formada por fósfato compactado por proteínas (histonas).
• DNA compactado permanece protegido, diminuindo a superfície de contato.

Localização do DNA

• Células eucarióticas : Núcleo envolvido por membrana nuclear, a carioteca.
• Membrana plasmática: A carioteca é localizada no interiorda célula.
• O Dogma Central da Biologia Molecular foi postulado por Francis Crick (1958) e explica o fluxo de informações do código genético.
• Uma sequência de ácido nucleico pode gerar uma proteína, mas o contrário não é possível.
• Dogma: DNARNAProteínas.
• A informação genética se encontra no DNA que, por sua vez, será transcrito em RNA
• Transcrição: Molécula de DNA serve de molde para a criação de molécula de RNA.
• Processo de tradução : molécula de RNA que se encontra o código utilizado na organização da sequência de aminoácidos (é capaz de formar proteínas).
• A replicação do DNA, : uma molécula de DNA é responsável por gerar outra molécula idêntica à molécula original.
• Transcrição reversa: RNA pode produzir DNA

Etapas da Extração

• A obtenção do material genético, (sangue, tecidos, cultivos bacterianos, ectoparasitos, endoparasitos, leite e plantas) é a primeira e mais importante etapa para garantir a integridade e pureza das moléculas de DNA e RNA.
• A extração consiste em três etapas: rompimento do envoltório celular, desproteinização e recuperação do DNA/RNA.
• Métodos físicos: abrasão física, aquecimento
• Métodos químicos: ação enzimática (proteinase K), detergentes (SDS, CTAB).
• A desproteinização utiliza solventes orgânicos como fenol tamponado ou fenol:clorofórmio removendo os componentes celulares.
• Nesta etapa formam-se a fase aquosa (DNA ou RNA) e a fase orgânica (restos celulares, fenol, clorofórmio, etc.).
• A precipitação utiliza etanol absoluto ou isopropanol gelado e solução salina catiônica, seguido por etanol 70% para remover impurezas.
• o DNA é ressuspenso em água ultrapura ou tampão com pH adequado, dependendo do protocolo.

Métodos de Extração de DNA e RNA

• Kits comerciais ou soluções preparadas no laboratório, seguindo POPs (Procedimento Operacional Padrão).
• Kits specificos com colunas de filtro retêm o material genético para eluição ao final do processo, com restos celulares trocados em microtubos a cada etapa.
• A dificuldade é a presença de RNAses ativas e estáveis que degradam o material rapidamente, sendo crucial adicionar um tampão de extração no início para auxiliar na precipitação e manter o RNA intacto.
• A escolha do tipo de extração depende do tipo de amostra, tempo, recursos financeiros e laboratório.

Quantificação de DNA/RNA

• Após a extração, quantificar o material genético é importante para integrar o material e a sua concentração e utilizar no cálculo do volume de DNA/RNA a utilizar para a PCR.
• Equipamento com espectrofotometria: Analisa quantidade de luz absorvida pelo DNA/RNA nos espectros de 260 e 280nm (não diferencia ácidos nucleicos).
• Eletroforese em gel de agarose: Utiliza padrão de peso molecular na avaliação.
• Fluorímetro: Utilização do fluorímetro onde um material fluorescente se liga ao ácido nucleico.
• Os métodos espectrofotométricos são utilizados para verificar o grau de pureza da solução.
• Razão A260/A280 >= 1,75 e 1,80 indica contaminação com lipídeos ou proteínas.
• Razão A260/A280~2,0 (menor que 2,0): Contaminação com guanidina (da extração).
• Razão maior que 2,0: Contaminação com fenol e/ou clorofórmio. .

PCR (Reação em cadeia da polimerase)

• Uma técnica de biologia molecular revolucionária proposta por Mullis, em 1983, rendeu o Prêmio Nobel em química.
• Possibilita avanços na genotipagem, detecção, identificação de microrganismos, polimorfismos, análise de diversidade genética, etc.
• Possibilita a amplificação de sequências genômicas em amostras complexas e heterogêneas, com alta sensibilidade e especificidade (TYRELL, 1997).
• Combinada com extração e purificação de ácidos nucleicos, e separação dos fragmentos genômicos, otimizam o aproveitamento da técnica como um todo.

Princípios da PCR

• A PCR consiste na multiplicação in vitro de uma região específica do genoma, gerando milhões de cópias (TYRRELL, 1997).
• Facilita analises genéticas desta porção, favorecendo a métodos de detecção e diagnóstico, baseados em ácidos nucleicos, com alta especificidade
• A técnica se baseia na reprodução do processo de replicação do genoma in vivo, com os mesmos elementos essenciais.
• A amostra de DNA extraído e purificado, com segmento a ser amplificado (150 a 200ng/µL).
• Mistura de nucleotídeos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP) em concentrações iguais, com a concentração de 20mM a 200mM.
• Enzima Taq polimerase (uma UI).
• Enzima termoestável responsável pela síntese das novas fitas.
• Cloreto de magnésio (1 a 4 mM).
• Cloreto de magnésio, que atua como cofator para a enzima
• Pares de iniciadores (ou primers) (0,1 e 0,5mM).
• Pares de iniciadores são fragmentos sintetizados em laboratório com sequências complementares que flanqueiam a região alvo com 18 a 30 bases.
• Solução tampão, que favorece a atividade enzimática e a hibridização do primer.
• Após a extração, purificação e quantificação do DNA, a mistura de reação – ou mix – contendo os elementos acima descritos.
• Preparar a mistura em estante resfriada, dentro de fluxo laminar, em uma sala especial, com tubos preparados para uma aliquotagem e transferidos para uma sala diferente , na qual serão inseridas as diferentes amostras de DNA extraído.
• A PCR é realizada em um termociclador, com um bloco capaz de aquecer ou resfriar, controlado pela variação de temperatura.

Etapas da PCR

• Desnaturação: Aumento da temperatura para romper as pontes de hidrogênio e separar a dupla-fita em fitas únicas.
• Anelamento: Diminuição da temperatura para religação das pontes de hidrogênio, permitindo que os primers se liguem às sequências-alvo.
• Extensão: Aumento da temperatura ótima para a ação da enzima Taq polimerase, que promove a extensão do fragmento.
• A desnaturação ocorre entre 91 e 95°C por cerca de dois minutos.
• Na etapa de otimização, as moléculas do DNA da amostra analisada e dos primers se separam e seus sítios de ligação são expostos.
• Os primers em concentração ligam os sítios específicos dos quais foram designados.
• A temperatura de anelamento varia de acordo com o primer e é informada pelo fabricante, favorecendo a religação das pontes de hidrogênio com temperatura entre 40 e 65ºC, por cerca de um minuto e meio.
• Equação 1 é utilizada para iniciadores com até 20 nucleotídeos.
• Para iniciadores com mais de 20 nucleotídeos, a Tm deve ser calculada pelo método de Meinkoth e Wahl (equação 2)
• A temperatura é elevada para 72ºC (acoplamento e ação da enzima Taq polimerase). O ciclo é repetido várias vezes, com aumento exponencial de moléculas replicadas chamado de amplicon.

Variações da PCR

• A PCR multiplex é importante para estudos epidemiológicos ou em ensaios de diferenciação de variantes da mesma espécie.
• Utiliza vários pares de primers para regiões distintas do genoma; gerando padrões únicos que permitem sua diferenciação
• Exemplos: Escherichia coli, Corynebacterium pseudotuberculosis e Microsporum spp.
• A nested-PCR é uma variação da PCR convencional para aumentar a sensibilidade e especificidade da reação, sendo necessários dois pares de primers, para cada etapa do processo
• Na primeira etapa, o primers externos amplificam uma sequência extensa (um número conhecido de pares de bases) e têm como alvo uma região menor dentro do produto do primeiro par e diminuindo as chances do produto gerar um resuldato não desejado.
• As duas etapas podem ser simultâneas (nested-PCR) ou separadas (semi-nested PCR
• É mais específica e sensível (a sensibilidade do nested-PCR pode ser até 100 vezes maior quando comparada à PCR convencional)
• Exemplos: Lentivírus de pequenos ruminantes, Mycobacterium tuberculosis e Ureaplasma diversum.
• A PCR em tempo real monitora a reação em tempo real sem a necessidade da eletroforese, e a quantificação é feita através da emissão e capitação.
• Utiliza um termociclador com um sistema óptico de captação da emissão de luz e usa um sistema de sondas de fluorescência.
• SYBR Green se intercala em qualquer fragmento do DNA e emite fluorescência a partir daí.
• A discriminação entre os sinais é feita pela análise da curva de dissociação que utilizam sondas que se anelam após o local de anelamento do primer na sequência alvo.
• Detecção TaqMan contém um corante apresentador que emite fluorescência na extremidade 5’ e um corante silenciador que inibe a emissão na extremidade 3’
• Durante a atividade da sonda Tagman clivada, o reporter libera fluorescência para ser captada e analisada pelo sistema óptico.
• Exemplos de uso: Detecção/quantificação de patógenos, detecção de mutações, expressão gênica (com RNA/cDNA).
• A técnica do Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (Restriction-Fragment Length Polymorphism – RFLP) consiste na submissão prévia do DNA amostral a um conjunto de enzimas de restrição que clivam a molécula de DNA em pontos específicos e posterior eletroforese.
• Permite diferenciar:polimorfismo genético, genética herdada entre indivíduos e diferenciassão entre aintrae interspecies.
• A diferença entre os locais de clivagem de uma endonuclease irá gerar fragmentos de tamanhos diferentes entre dois indivíduos
• O genona egerairá um padrão proporcional ao número de enzimas utilizadas
• Exemplos de uso: mapeamento genômico, genotipagem e ciência forense.
• A PCR de transcriptase reversa (Reverse Transcription PCR) tem como objetivo reproduzir in vivo a replicação do genoma original (RNA).
• A enzima transcriptase reversa é utilizada para converter o RNA em cDNA
• Após a síntese, utilizam-se enzimas (como a RNAse H) que degradam seletivamente o RNA e submete o produto à PCR convencional
• O bom desempenho depende da seleção adequada dos primers e da boa conservação da amostra (dado que o RNA é mais instável que o DNA).
• A PCR convencional apresenta um fator limitante: necessidade de conhecimento das sequências que flanqueiam a região alvo para a confecção dos primers
• A RAPD (DNA polimórfico aleatoriamente amplificado) com o objetivo de contornar essa necessidade; possibilitando o uso da técnica em organismos sobre os quais se tinha pouco ou nenhum conhecimento sobre o seu genoma.
• No RAPD utiliza-seum primer de sequência arbitrária, além de uma temperatura de anelamento mais baixa que a da PCR convencional; diminuindo a especificidade.
• Quanto mais complexo o genoma, maior a chance de a técnica funcionar.
• Vários oligonucleotídeos curtos servem como “primers” dentro dessas condições
• É possível montar um painel de candidatos a primers universais, de modo que possam detectar polimorfismos (principal objetivo do RAPD) diretamente, em praticamente qualquer organismo biológico
• Exemplos de uso: estudos de mapeamento gênico, genética de populações e taxonomia molecular.

Obtenção e Visualização dos Resultados da PCR

• A eletroforese descreve o deslocamento de uma partícula eletricamente carregada sob um campo elétrico.
• O objetivo é separar moléculas por carga elétrica e peso molecular.
• Quantificação de DNA em amostras após extração.
• Detecção de proteínas defeituosas.
• Análise da integridade dos ácidos nucleicos, diagnóstico de bioagentes, detecção de adulterações e fraudes.
• A análise de DNA por eletroforese baseia-se na carga negativa do DNA migrando para o polo positivo (cátodo).
• A velocidade da migração depende do tamanho da molécula.
• Os modelos são de gel de agarose e gel de poliacrilamida.
• A concentração do gel está relacionada à densidade das tramas do polímero: 1% de concentração possue menor densidade do um gel com concentração de 3%