Praktikum: Tes Presipitasi Lateral Flow

Peraturan Praktikum

• Mahasiswa bekerja dalam kelompok dengan satu pipet yang disediakan, periksa kelengkapannya dan lapor jika ada kekurangan
• Mahasiswa menyediakan baju praktikum dan pensil berwarna
• Dilarang merokok, makan, atau memasukkan benda asing ke mulut selama praktikum
• Laporkan segera jika terjadi kecelakaan, seperti luka atau kontaminasi darah/serum
• Bersihkan tumpahan darah/serum dengan lisol atau alkohol

Praktikum I: Tes Presipitasi Lateral Flow

• Untuk mendeteksi presipitasi akibat reaksi antara antigen spesifik Salmonella enteritica serovar typhi (LPS) dan IgM dari serum pasien demam tifoid

• Prinsip kerjanya yaitu imunokromatografi satu langkah

• Antigen yang digunakan adalah Lipopolisakarida (LPS) dari bakteri Salmonella enterica serovar typhi yang diisolasi dari penderita demam tifoid di Makassar

• LPS dilewatkan pada garis dalam porus kertas nitroselulosa pada strip tes serum

• Reagen deteksi terdiri dari antibodi anti-human yang dilabel dengan partikel "red colloidal gold"

• Test menggunakan anti-human IgM antibodi dan LPS Salmonella enteritica serovar Typhi IgM dengan anti human IgM antibodi

• Sampel serum ditempatkan dalam lubang sampel

• “Running solution” ditambahkan untuk mencairkan reagen deteksi dan membawa molekul serum melalui membran porus

• Antibodi spesifik Salmonella serovar typhi akan melekat pada antigen LPS dan diwarnai oleh reagen deteksi

• Antibodi IgM spesifik terhadap LPS Salmonella enteritica serovar Typhi akan menampilkan garis merah di daerah tes

• Hasil akhir menunjukkan garis pita merah di daerah tes, jika sampel tidak mengandung antibodi IgM Salmonella serovar Typhi, tidak akan ada warna merah di daerah tes

• Semua sampel harus menunjukkan warna merah pada daerah kontrol, menandakan reagen deteksi aktif dan hasil akurat

Bahan yang Dibutuhkan

• Paket Lateral flow
• Cairan Running buffer
• Strip putih berisi pita antigen (lower band) dan internal kontrol (upper band)

Cara Kerja

• Buka kemasan test typhoid lateral flow dan letakkan mendatar
• Siapkan kapas alkohol, autoklik, dan pipet kapiler
• Disinfeksi ujung jari dengan kapas alkohol
• Tusuk jari secara vertikal dengan autoklik
• Hisap darah yang keluar dengan pipet kapiler (±5 µl)
• Masukkan darah ke lubang dengan menempelkan ujung pipet
• Tambahkan 130 µl atau 3 tetes "running buffer"
• Biarkan selama 10-15 menit dan amati perubahan pada daerah tes dan kontrol
• Pita merah pada daerah kontrol dan/atau tes menandakan hasil positif, semakin terang warna semakin tinggi nilainya

Interpretasi Hasil

• Pemeriksaan menggunakan perbandingan 5:130 antara larutan serum dan running buffer pada kertas nitroselulosa
• Pita antigen menunjukkan IgM antibodi spesifik S. typhi dalam serum sampel
• Pita horisontal kontrol memvalidasi integritas reagen deteksi
• Terjadi ikatan antara antibodi IgM spesifik dengan LPS dari Salmonella enterica serovar Typhi sebagai antigen tifoid
• Reaksi non-enzimatik dengan antibodi IgM manusia bersifat stabil
• Campuran 5 µl serum dengan 130 µl running buffer dilewatkan pada kertas nitroselulosa dan ditunggu 10-15 menit
• Reaksi positif ditandai warna merah pada pita antigen (pita bawah), intensitas warna memberikan nilai semi kuantitatif:
  • Negatif (-) berarti tidak berwarna
  • Merah kabur (1+)
  • Merah sedang (2+/3+)
  • Merah jelas (4+)

Praktikum II: Tes Aglutinasi MLPA (Mycobacterium Leprae Particle Agglutination) Kualitatif

• Untuk menentukan aglutinasi akibat reaksi antara antigen spesifik Mycobacterium leprae (Phenolic Glycolipid-1/PGL-1) dengan imunoglobulin M (IgM) dari serum penderita kusta/lepra

Bahan dan Alat

• Microplate dengan 96 sumur kecil berbentuk U (3 sumur per pemeriksaan kualitatif)
• Micropipet dan multipipet dengan berbagai ukuran tips
• Reading mirror
• Kit MLPA lengkap:
  • Dropper (25 µl per tetes)
  • Reconstituting solution
  • Serum diluent
  • Sensitized particles berisi NT-P-BSA (antigen semisintetik)
  • Unsensitized particles / kontrol negatif
  • Positive control

Prosedur Kualitatif

• Buat reagensia dari KIT MLPA dengan melarutkan sensitized particle, control particle, dan positif control dengan reconstituting solution, diamkan 30 menit

1. Teteskan 75 µl serum diluent ke sumur pertama, 25 µl ke sumur kedua dan ketiga
2. Tambahkan 25 µl serum pasien ke sumur pertama dan campur hingga merata (pengenceran 1:4)
3. Ambil 25 µl dari sumur pertama, campurkan ke sumur kedua, ambil lagi 25 µl dari sumur kedua, tambahkan ke sumur ketiga dan campur merata (pengenceran 1:8 di sumur kedua, 1:16 di sumur ketiga)
4. Tambahkan 25 µl kontrol partikel (unsensitized particle control) ke sumur kedua, 25 µl sensitized particle ke sumur ketiga (menghasilkan larutan serum 1:16 di sumur kedua dan 1:32 di sumur ketiga)
5. Diamkan pelat pada suhu kamar atau inkubator selama 2 jam
6. Baca hasil setelah 2 jam, hasil positif pada sumur ketiga