Pharmacognosie: Extraction et Screening Phytochimique

Préambule et Instructions aux Étudiants

• La pharmacognosie est un pilier de la formation pharmaceutique, étudiant les matières premières d'origine naturelle à visée thérapeutique.
• Les travaux pratiques permettent d'acquérir des compétences essentielles pour l'identification, l'analyse et le contrôle qualité des drogues végétales.
• Les séances se déroulent par groupes de 30 étudiants, avec présence obligatoire.
• Tout retard de plus de 15 minutes entraîne l'exclusion de la séance.
• Les absences doivent être justifiées sous 48h auprès du secrétariat du département Sciences du médicament.
• Préparation des séances implique la lecture préalable de la manipulation objet de la séance de TP et la révision des cours théoriques correspondants.
• Le matériel personnel obligatoire inclut une blouse propre, le polycopié du TP, et un appareil photo pour documenter les observations.
• Il est interdit de manger ou de boire pendant les séances, l'élimination des déchets doit être appropriée, et les solvants doivent être manipulés avec précaution.
• Il faut contrôler l'état de la verrerie avant utilisation et la manipuler avec précaution, et nettoyer la paillasse à la fin de la manipulation.

Séance I : Méthodes Générales de Préparation et Analyse des Extraits Végétaux

• L'objectif est de maîtriser les différentes techniques d'extraction des principes actifs végétaux.

Partie 1 : Principes et Techniques d'Extraction

• L'extraction solide-liquide est la technique la plus utilisée pour récupérer des molécules bioactives de sources végétales, largement appliquée dans l'industrie pharmaceutique pour extraire des composés d'intérêt.

A. Extractions par solvant à froid

• Macération : Contact prolongé entre la drogue et le solvant à température ambiante.
• Les paramètres critiques incluent le rapport drogue/solvant, la durée de contact, la nature du solvant, et la granulométrie de la drogue.
• Avantages : Technique simple qui préserve les composés thermolabiles.
• Inconvénients : Extraction incomplète et durée longue.
• Percolation : Écoulement continu du solvant à travers la drogue.
• Les paramètres critiques incluent le tassement de la drogue, le débit de percolation, et le temps de contact.
• Avantages : Extraction plus complète qu'en macération.
• Inconvénients : Consommation importante de solvant.

B. Extractions par solvant à chaud

• Infusion : Versement du solvant bouillant sur la drogue.
• Applications : Parties fragiles telles que feuilles et fleurs.
• Durée : 15-30 minutes.
• Température : Décroissante de 100°C à ambiante.
• Décoction : Maintien à ébullition de la drogue dans le solvant.
• Applications : Parties dures telles que écorces et racines.
• Durée : 15-30 minutes.
• Température : Constante à 100°C.
• Digestion : Extraction à température modérée entre 35 et 65°C.
• Avantages : Meilleur rendement qu'à froid.
• Applications : Composés sensibles à la chaleur.

Extractions spécifiques

• Extraction au Soxhlet : Extraction continue par solvant chaud recyclé.
• Le montage comprend un ballon chauffé contenant le solvant d'extraction, et le corps central (l'extracteur Soxhlet) qui comprend un siphon latéral et une chambre d'extraction.
• Le montage comprend également un condenseur (réfrigérant) en partie supérieure.
• Avantages : Extraction exhaustive et automatisée, utilisation d'un faible volume de solvant, pas besoin de filtration, bonne efficacité d'extraction.
• Inconvénients : Chauffage prolongé.
• Appareil de Clevenger : Hydrodistillation avec recyclage continu.
• Spécificités : Séparation eau/huile essentielle et retour automatique de l'eau.
• Avantages : Économie d'eau et meilleur rendement.
• Les parties essentielles sont un ballon en verre, une colonne verticale, un condenseur, un tube gradué et un système de recirculation de l'eau.
• Le processus implique : Matériel végétal et eau dans le ballon, ébullition, entraînement des composés aromatiques volatils par vapeurs d'eau, condensation dans le réfrigérant.
• Egalement la séparation du distillat (mélange eau + huile) par différence de densité, huile essentielle flottant au-dessus, et retour de l'eau au ballon par recirculation.

Partie 2 : Élimination des Solvants

• Évaporation sous vide (Rotavapeur) : Évaporation accélérée par rotation et dépression.
• Les composants du système sont un bain-marie chauffant, un ballon d'évaporation rotatif, un système de refroidissement et une pompe à vide.
• Les paramètres incluent la température du bain, la vitesse de rotation, et le niveau de vide.
• Avantages : Rapide et température modérée.
• Lyophilisation : Sublimation de l'eau à basse température sous vide.
• Les étapes sont la congélation à -40°C à -80°C, la dessiccation primaire (sublimation), et la dessiccation secondaire (désorption).
• Applications : Extraits aqueux et composés thermosensibles.
• Avantages : Préservation optimale des principes actifs.

Séance II : Détection et Caractérisation des Métabolites Secondaires

• Objectif pédagogique : Pratiquer la caractérisation des métabolites secondaires existants dans des drogues végétales.

I- INTRODUCTION

• Le screening phytochimique représente l'ensemble des techniques qualitatives permettant la détermination des différents groupes chimiques contenus dans une drogue végétale.
• Ce sont des réactions qui permettent la mise en évidence des substances chimiques (métabolites secondaires).
• Les techniques de détection utilisables pour un screening des substances actives doivent être rapides, simples, reproductibles, sensibles afin de ne mettre en œuvre qu'une faible quantité de matière végétale.
• Le screening phytochimique est réalisé tant sur les phases aqueuses qu'organiques par des réactions usuelles à l'aide des réactifs de caractérisation classiques.
• Quatre types de principes actifs seront recherchés lors de cette séance de travaux pratiques : Tanins flavaniques, Alcaloïdes, Anthracénosides, Saponosides.

II-MÉTHODES GÉNÉRALES DE DETECTION DES METABOLITES SECONDAIRES

A. DÉTECTION DES TANINS

• Les tanins sont des composés phénoliques complexes d'une extrême diversité, présents dans toutes les parties des végétaux. Ils agissent comme armes chimiques défensives et ont des propriétés astringentes.
• Les tanins sont divisés en tanins condensés (proanthocyanidines) et tanins hydrolysables.
• La réaction de Bate-Smith est utilisée pour détecter les tanins condensés, en traitant les tanins à chaud en milieu acide pour libérer les anthocyanes, donnant une coloration rouge ou rouge violacée:
• Introduire 250 mg de matériel végétal broyé et 10 ml d'acide chlorhydrique 2N dans un tube à essais, puis chauffer au bain-marie bouillant pendant au moins 15 minutes.

B. DÉTECTION DES ANTHRACÉNOSIDES

• Les anthracénosides sont des composés phénoliques hétérosidiques, dérivés de l'anthracène, existant sous forme réduite (anthrones-anthranols) et oxydée (anthraquinones).
• La réaction de Borntraeger permet de caractériser les principes actifs anthracéniques, basée sur la coloration rouge des anthraquinones libres en milieu alcalin.
• Manipulation: introduire dans un tube à essais 500 mg environ de racines de garance broyés.
• Ajouter 10 ml d'acide chlorhydrique 2N, chauffer au bain-marie pendant 10 minutes, filtrer, ajouter 10 ml de toluène, agiter, transférer le toluène dans un autre tube, et agiter avec NaOH 1N. La couche aqueuse devient rouge-violacée.

C. DÉTECTION DES ALCALOÏDES

• Les alcaloïdes sont des composés organiques azotés, basiques, d'origine végétale, de structure complexe. Ils réagissent en formant des précipités.
• Utilisation d'une solution neutre d'iodomercurate de potassium (Réactif de Mayer) ou une solution acide d'iodobismuthate de potassium (Réactif de Dragendorff).
• Manipulation : Réduire en poudre le matériel végétal et ajouter 10 ml d'acide sulfurique à 1%. Laisser macérer, filtrer, et diviser le filtrat en deux tubes.
• Ajouter 3-4 gouttes de réactif de Mayer au premier tube ; un précipité blanchâtre indique la présence d'alcaloïdes.
• Ajouter 3-4 gouttes de réactif de Dragendorff au deuxième tube ; un précipité rougeâtre indique la présence d'alcaloïdes.

D. DÉTECTION DES SAPONOSIDES

• Les saponosides sont des hétérosides à génine stéroïdique ou triterpénique, tensioactifs, caractérisés par la formation de mousse en solution aqueuse.
• Manipulation : Mettre 5g de matériel végétal broyé dans 100 ml d'eau distillée, porter à ébullition pendant 20 minutes, filtrer, refroidir et introduire 10 ml de décoction dans un tube à essais.
• Agitez le tube horizontalement pendant 20 secondes et laissez reposer. Une mousse persistante pendant au moins 15 minutes, non affectée par l'ajout de HCl 2N, indique la présence de saponosides.

SEANCE III : METHODES GENERALES D'EXTRACTION, PURIFICATION, SEPARATION ET CARACTERISATION DES ALCALOÏDES

• Objectif pédagogique : Pratiquer l'extraction, la détection et la caractérisation des alcaloïdes à partir des drogues végétales.

I-METHODES D'EXTRACTION DES ALCALOÏDES

• En général, les alcaloïdes à l'état de sels sont solubles dans l'eau et insolubles dans les solvants organiques; à l'état de bases, ils sont insolubles dans l'eau et solubles dans les solvants organiques.
• Les bases et les sels d'alcaloïdes peuvent être extraits avec des alcools usuels comme l'éthanol et le méthanol, qui sont des solvants non sélectifs
• Les réactifs utilisés pour caractériser les alcaloïdes sont le réactif de Mayer et le réactif de Dragendorff.

Manipulation :

• Extraction en milieu acide : Réduire en poudre 300 mg de graines de Peganum harmala. Ajouter 20 ml d'acide sulfurique à 1%, laisser macérer, filtrer.
• Partager le filtrat en deux tubes, ajouter le réactif de Mayer au premier, et le réactif de Dragendorff au deuxième.
• Noter l'importance de la fluorescence après exposition à la lumière UV.
• Le réactif de Mayer contient de l'iodure de potassium (5g), du bichlorure de mercure (1,36g), et de l'eau (100ml).
• Le réactif de Dragendorff contient des nitrates de bismuth (0,85g dans 50 ml d'acide acétique 80%) et de l'iodure de potassium (8g dans 20ml d'eau).

Extraction en milieu alcalin

• Imbiber 300 mg de graines de Peganum harmala réduites en poudre avec quelques gouttes de NaOH 0.1N, ajouter 20 ml de dichlorométhane, laisser macérer, filtrer.
• Déposer une petite quantité sur une plaque de silice, noter la fluorescence sous UV, pulvériser avec le réactif de Dragendorff.

II/ PURIFICATION

• Manipulant : Ajouter un même volume d'acide sulfurique à 1% à l'extrait de dichlorométhane.
• Il est important d'assurer le déplacement des alcaloïdes par l'utilisation des réactifs adéquats et d'ajuster le pH.

III/ CHROMATOGRAPHIE (CCM)

• La silice F254 est utilisée comme support; le solvant de développement est un mélange de chloroforme/méthanol/ammoniaque.
• Après le développement du chromatogramme, sécher la plaque, examiner sous lumière visible et UV, et révéler avec le réactif de Dragendorff.

Ce cours aborde les principes de la pharmacognosie, en se concentrant sur diverses méthodes d'extraction telles que la macération, la percolation, et l'extraction au Soxhlet. Il couvre également le screening phytochimique pour identifier les groupes chimiques dans les plantes, avec des exemples spécifiques de plantes riches en tanins, alcaloïdes, et autres composés.