Pèptids, proteïnes i aminoàcids

Pèptids i Proteïnes

• Les proteïnes estan formades per aminoàcids i realitzen funcions com catàlisi enzimàtica, transport, nutrició, contracció muscular, estructura, defensa i regulació.

Aminoàcids

• Els aminoàcids contenen un grup amino (-NH2) i un grup carboxil (-COOH) i una cadena lateral (R) i estan formats per carboni, hidrogen, nitrogen i oxigen.
• Hi ha uns 500 aminoàcids coneguts que es classifiquen per la posició dels grups funcionals i per les característiques de la cadena lateral.
• D'aquests, 22 s'incorporen naturalment als polipèptids i es denominen proteogènics o estàndards, i 20 són codificats pel codi genètic universal.
• Nou aminoàcids són "essencials" per als humans i s'han d'obtenir per la dieta.
• Alguns aminoàcids no són proteics, ja que són derivats d'altres aminoàcids i s'utilitzen com a neurotransmissors o vitamines.

Propietats dels aminoàcids

• Els aminoàcids poden actuar com a àcids o bases segons el pH i el seu pKa.
• Els grups amino i carboxil els permeten tenir propietats amfipròtiques, actuant com a àcids o bases.
• A pH baix, predomina la forma protonada amb càrrega positiva; a pH alt, la forma desprotonada amb càrrega negativa.
• A un pH entre 2.2 i 9.4, la forma adoptada per l'aminoàcid és un zwitterió, amb una càrrega neta total de zero.

Zwitterions i Punt Isoelèctric

• L'estat molecular amb càrrega neta zero es coneix com a zwitterió.
• A pH baix, la forma dominant té un grup carboxil neutre i un grup a-amoni positiu (càrrega neta +1).
• A pH alt, té un grup carboxilat negatiu i un grup a-amino neutre (càrrega neta -1).
• La forma plenament neutra és minoritària en solució aquosa.
• Els aminoàcids també existeixen com a zwitterions en fase sòlida.
• El rang de pH entre 2.5 i 9.4 és on es troba la forma zwitteriònica.
• El punt isoelèctric (pI) és el pH en el qual la quantitat d'ió net negatiu i d'ió net positiu és igual, resultant en una càrrega neta mitjana de zero.
• En electroforesi, els aminoàcids no tenen mobilitat en el seu punt isoelèctric.
• Els zwitterions tenen la mínima solubilitat en el seu punt isoelèctric.
• Els aminoàcids es poden identificar pel seu nom, per un codi de tres lletres o per un codi d'una lletra.

Classificació dels aminoàcids apolars

• Els aminoàcids apolars no tenen grups polars ni ionitzables, no són solubles i presenten cadenes alifàtiques o aromàtiques.
• La glicina té un carboni α no quiral, mentre que la resta d'aminoàcids són quirals i són isòmers L.

Aminoàcids Apilars (continuació)

• La metionina té un grup tioèter.
• La prolina és ciclitzada, restringint estructures proteiques.
• La fenilalanina té un grup fenil (benzè).
• El triptòfan té dos anells: indol.

Aminoàcids polars sense càrrega

• Poden formar ponts d'hidrogen amb l'aigua, fent-los solubles.
• La cisteïna pot formar enllaços disulfur amb altres cisteïnes, facilitant estructures proteiques. Aquests enllaços (covalents sofre-sofre) són importants per a l'estructura i funció proteica.

Aminoàcids Aromàtics i Absorció de Llum

• La fenilalanina, el triptòfan i la tirosina són aminoàcids aromàtics.
• Els aminoàcids absorbeixen llum en el rang ultraviolat. El pic d'absorbància de les proteïnes és a 280 nm.

Aminoàcids Polars amb Càrrega

• Es troben a la superfície de les proteïnes o formen ponts salins interns o centres actius.
• La lisina, arginina i histidina es troben protonats a pH fisiològic (càrrega positiva).
• L'àcid aspàrtic i l'àcid glutàmic tenen càrrega negativa a pH fisiològic.
• La càrrega total de la cadena polpeptídica és la suma de les càrregues dels aminoàcids, tenint en compte que el pKa dels aminoàcids varia segons l'entorn on es troben.

Isòmers

• Isòmers: Molècules amb la mateixa fórmula empírica però diferent estructura molecular.
• Els aminoàcids es poden anomenar segons el seu enantiòmer. La capacitat de rotació afecta a la vibració de la llum polaritzada.
• Això són imatges especulars que no es poden superposar a causa del carboni quiral o asimètric.

Nomenclatura dels aminoàcids

• Es distingeixen els aminoàcids pel tipus L o D.
• Fixant-se amb la projecció de Fisher, el grup d'aminoàcids dibuixats amb una projecció vertical es troba en el pla, i horitzontal es troba fora d'ell.

Més Sobre La Nomenclatura

• El carboni α de tots els aminoàcids és quiral (asimètric), excepte en el cas de la glicina (amb dos hidrògens).
• Tots els aminoàcids són L-α-aminoàcids, alguns levogirs i altres dextrogirs. Les molècules L no sempre són levogires (-) ni totes les D són dextrogires (+).
• Tots els aminoàcids proteogènics (que formen part de les proteïnes) són L.
• N'hi ha que no formem part de les proteïnes, principalment, els bacteris, que els utilitzen per sintetitzar antibiòtics i que són de tipus D, de manera que no poden ser degradades per proteases.
• A més, tots els aa L també són S, excepte la Lys, que és R.

Aminoàcids modificats

• Són aminoàcids que es modifiquen després de la traducció, com la hidroxiprolina i hidroxilisina, per tal d'obtenir propietats addicionals útils com per exemple en el disseny d'enzims.
• Aquests formen part del col·lagen, i li donen resistència.
• Poden ser modificats per metilació, acetilació, fosforilació i hidroxilació.

Compostos derivats d'aminoàcids

• Els neurotransmissors i els àcids orgànics, poden derivar-se dels aa.
• GABA: Neurotransmissor inhibidor al cervell; nivells baixos associats a depressió i ansietat. Sintetitzat a partir de la descarboxilació del glutamat.
• Dopamina: Se sintetitza a partir de la tirosina a través de diverses reaccions.

Histamina i Altres Compostos derivats d'aminoàcids

• Histamina: Molècula involucrada en respostes immunològiques d'hipersensibilitat (al·lèrgies); sintetitzada a partir de la L-histidina.
• Altres compostos: β-cianoalanina i homocisteïna, citrulina i ornitina, azaserina i S-adenosilmetionina. La tiroxina és una hormona de les tiroides. La citrulina i ornitina són aa no proteogènics intermediaris en la síntesi de l'arginina.

Pèptids i Polipèptids

• En eucariotes, el primer aminoàcid és sempre la metionina, tot i que posteriorment, sempre és eliminat o modificat a l'extrem del cap on es troba aquest aminoàcid.
• En procariotes el primer aminoàcid és formilmetionina (aa modifica.
• Pèptids/oligopèptids = cadenes curtes d'aminoàcids. Polipèptids = cadenes llargues.
• Les cadenes s'uneixen mitjançant enllaços peptídics entre el grup carboxil d'un aminoàcid i el grup amino de l'altre, formant aigua.

Enllaç Peptídic i Configuració

• L'enllaç peptídic crea un extrem N-terminal i un extrem C-terminal i condicionant el plegament de la proteïna.
• L'enllaç peptídic no és del tot simple a causa de la deslocalització d'electrons, té polaritat i els sis àtoms que l'integren són al mateix pla.

Angles de Torsió i Configuracions

• Dels tres enllaços de la cadena principal, dos poden rotar (angles Φ i Ψ), depenent de les cadenes laterals.
• Segons la posició dels carbonis α, hi ha dues configuracions: cis i trans. La trans és més estable, però la prolina pot causar la cis.

Exemple: Insulina

• Hormona peptídica petita (51 aminoàcids) produïda als illots de Langerhans al pàncrees. Té dues cadenes (A i B) unides per ponts disulfur intercatenaris i té un enllaç disulfur intracatenari.
• Permet a les cèl·lules agafar glucosa, disminuint els nivells en sang; s'uneix a receptors i activa vies de senyalització al múscul, fetge i teixit adipós.
• Els aminoàcids de les proteïnes s'anomenen monòmers.

Multímers i Enllaços Disulfur

• Un multímer és una proteïna formada per diferents subunitats proteiques (dímer, trímer, tetràmer, etc.), que poden ser homodímers o heterodímers. Les cadenes polipeptídiques poden provenir d'un mateix gen o de diferents. Les cadenes formades per pocs aminoàcids són oligopèptids.
• El β-mercaptoetanol i el ditioltreitol (DTT) es fan servir per reduir els i trencar enllaços disulfur ja que els protons es queden amb els sulfurs.

Mida de les Proteïnes i Pèptids Biològics

• Els compostos tenen grups tiols, responsables de la seva capacitat de protonar (reductor).
• Classificació de la mida proteica: petites (<20 kDa), mitjanes (40-60 kDa) i grans (>100 kDa).
• Però la definició de mida d'una proteïna dependrà dels següents elements: aminoàcids, glutamina àcids orgànics, o molècules com el glutatió

Glutatió com a exemple de Pèptid d'Importancia Biològica

• El glutatió és un tripèptid amb glicina, cisteïna i àcid glutàmic; antioxidant intracel·lular amb el grup tiol de la cisteïna actua com a reductor.
• L'àcid glutàmic no està enllaçat de la forma normal. No forma un enllaç peptídic i presenta per tant, dos extrems C-terminalS.

Oxitocina i Vasopressina

• Oxitocina: Hormona peptídica (9aa) que és un neurotransmissor cerebral principalment conegut per ser un alliberador del part
• Vasopresina: Hormona peptídica (9aa) que regula l'absorció d'aigua als túbuls renals. Funció al cervell i vasos sanguinis.

Factor Natriurètic Auricular

• Hormona peptídica (28aa) que es pot anomenar atriopeptina i que a l'hora és un potent vasodilatador, secretada per les cèl·lules musculars del cor. L'ANP actua per reduir les càrregues d'aigua, sodi i adipots.

Grups Protètics

• Proteïnes conjugades (heteroproteïnes) amb grups no peptídics units covalentment.
• Aquests grups poden ser molt variats i destacar per la síntesi de l'ATP. El grup protètic hemo forma part de moltes proteïnes com l'hemoglobina i tenen un ió de ferròs.

Centres Ferrosulfurats i Proteïnes Conjugades

• Són conjunts d'àtoms de Fe i S units a cisteïnes per enllaços disulfur. L'hemoglobina pot tindre més d'un grup però solen tindre un sol grups prostètics.
• Classe de proteïna conjugada: lipoproteïnes, glicoproteïnes, fosfoproteïnes, metal·loproteïnes, etc:

Polipèptids i Càrrega Neta

• Els polipèptids tenen un punt isoelèctric (pI) on la càrrega neta és zero.
• Aquest pH, la proteïna no és soluble i pot precipitar.
• Si pH < pI, la càrrega neta de la proteïna és positiva; si pH > pI, la càrrega neta és negativa.

Relació entre Pi teòric i real

• Tot i que es pot predir el pI amb software especialitzat, pot ser calculat per autoenfoc, però algun càrrega pot ocultar-se.
• L'estructura proteica primaria d'una proteïna és la descripció de tots les aminoàcids que la formen i que serveix per conèixer millor el seu plegament.

Obtenció de la Seqüència

• Podem obtenir la seqüència a partir del gens, o podem seqüènciar directament les proteïnes
• Per exemple, podem fer una comparació d'estudis proteòmic i si es fa de forma bi-dimencional, determinar quines són les proteïnes de forma diferencial;

Electroforesis

• Permet determinar El pI d'una proteïna experimentalment amb una electroforesi de poliacrilamida degut als elements que hi ha que creen un gradient de pH.
• Els aminoàcits en el gel s'uneixen fins que arriba al seu pI on deixen de tenir càrrega, per molt que estiguem corrent el gel.

Mètodes per conèixer sequencies proteiques

• Marcador de proteïnes amb Pi conegut.
• Proteïna + tampó de càrrega.

Més Sobre La Electroforesi

• Quan es purifica la proteïna es gràcies a la càrrega i en la electroforesi ens ajudarà a saber la seua càrrega a tot el pH possible.
• Si pH < pI: tindrà càrrega +
• Si pH > pI: tindrà càrrega -

Hidròlisi Àcida i Cromatografia

• La hidròlisi permet conèixer el nombre total d'aa, però no el seu ordre dins cada aminoàcid. Per exemple, si observem àcid carbònic o metionina a segons quines mesures de llum.
• Amb els tub i electroforesi separarem els aa.

Mètodes pel Trencaments dels ponts disulfurs

• Podem oxidar la proteïna amb àcid perfòrmic i ens dona dos cisteïnes.
• Podem reduir amb ditiotreitol.
• Cal tallar la proteïnas perquè hem de seqüenciar coses de 2-30AA;
• Quan tallem amb tripsina els terminals acaben en Lys o Arg i si les tallem amb termosilsina començaran amb leu Val,etc... o bromat de cianogen les talla en el les metonines

Degració D'Edman

• Tractarem una mostra de proteïnes amb una proteasa concreta i una altres mostra amb bronometil
• Es important conèixer el solapament d'aquests fragments d'aminoàcids.

Degradació d'Edman pt2

• Consisteix en: L’aminoàcid terminal N, és l'anàlisi de cada un dels aminoàcids, i en repetir-se de manera cíclic als Aminoàcids el fan de manera unitària , a cada residu del pèptid.

Mesurada Per Espectrometria

• La determinació de la massa d'una proteïna mitjançant espectrómetria ens proporciona un parámetro crític per la identificació de l'aminoàcid.

Mètodes MALDI

• Tècnica: espectrometria de masses per analitzar biomolècules (pèptids, proteïnes, sucres, …)
• És requereix la mezcla de la mostra amb matrix per així fer una cristalització i la desorsió i és bombardejada per polsos de llums..
• Tècnica utilizada amb freqüència anomenada “Mass fingerprint

Anàlisis de seqüències

• Producció de prot per mètodes recombinants i volem saber si la que hem clonat o purifcat és la que voliem.
• L’espectre de masses d’un compost s’obté mitjançant un gràfic de barres.
• Fem electroforesi, retallem la banda, prufiquem i l’enviem a seqüenciar