การประยุกต์ใช้เทคนิค PCR ในวิทยาศาสตร์สุขภาพ

หัวข้อหลัก: การประยุกต์ใช้เทคนิค PCR

• เนื้อหาครอบคลุมถึงการประยุกต์ใช้เทคนิค PCR ในด้านวิทยาศาสตร์สุขภาพ
• มีการอธิบายถึงองค์ประกอบสำคัญในการทำ PCR และปัจจัยที่เกี่ยวข้อง
• อธิบายขั้นตอนการเตรียมสารละลายองค์ประกอบ PCR
• อธิบายวิธีการใช้เทคนิค electrophoresis ในการตรวจสอบผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยา PCR
• อธิบายวิธีการตรวจสอบ อ่านผล และวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยา PCR
• ระบุถึงการตรวจหา DNA ของเชื้อ Leishmania และ Trypanosoma ในแมลงวันยุงตอม

หัวข้อย่อย: การตรวจหาด้วย PCR

• การตรวจหา DNA ของเชื้อ Leishmania และ Trypanosoma ในแมลงวันยุงตอม ในพื้นที่ที่มีโรคระบาด
• เชื้อโรคเหล่านี้กระจายอยู่ในแถบภาคใต้ของประเทศไทย
• ส่วน ITS1 ของ DNA เป็นบริเวณที่สำคัญในการตรวจหา

หัวข้อย่อย: ขั้นตอนการวิจัย

• ขั้นตอนการวิจัย PCR
• มีวิธีการเก็บตัวอย่าง, การเจือจาง, การอบ, การหมุน, การเพิ่มสารละลาย PCR, การทำ PCR และการตรวจสอบด้วย electrophoresis
• มีการอธิบายถึงอุปกรณ์และเคมีที่ใช้
• การใช้ Taq DNA polymerase, Primer, dNTPs, Buffer และ DNA เป็นส่วนสำคัญ
• สารละลายและส่วนประกอบสำคัญในปฏิกิริยา PCR เช่น MgCl₂, Tris-HCI, Triton X-100, Tween, deoxynucleotides (dNTPs), primer และ template มีความสำคัญ

หัวข้อย่อย: การสร้าง PCR

• มีการสร้าง PCR แบบ end-point detection และ real-time detection ที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์
• การตรวจแบบ real-time จะแสดงผลในระหว่างการทำปฏิกิริยา
• การใช้ electrophoresis และ calibrator
• การใช้จุดตัดเฉพาะเพื่อแยกความแตกต่างระหว่าง PCR positive และ PCR negative
• มีการแบ่งผลิตภัณฑ์ที่ได้จากปฏิกิริยา PCR ออกเป็นหลายส่วน

หัวข้อย่อย: ชุด PCR

• กระบวนการเตรียมชุด PCR: Reagents กระบวนการ design และ optimizaiton การเลือกใช้เครื่องมือและอุปกรณ์

• ประกอบด้วย ส่วนประกอบ reagent, DNA polymerases, DNA Template

• การออกแบบและปรับปรุง PCR: การกำหนดเงื่อนไข PCR, การออกแบบ Primer, และการเพิ่มประสิทธิภาพ

หัวข้อย่อย: Reagents PCR

• ส่วนประกอบ reagents PCR เช่น buffer, deoxynucleotides (dNTPs), และ primer oligonucleotide, DNA polymerase (เช่น Taq polymerase, Hot start) , DNA template
• การใช้ชุด reagent PCR ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์เช่น KOD ONE PCR Master Mix

หัวข้อย่อย: Purification และการประเมินคุณภาพของสารพันธุกรรม

• การทำความสะอาดและประเมินคุณภาพสารพันธุกรรม DNA เป็นขั้นตอนสำคัญในการทดลอง PCR
• สารพันธุกรรมต้องถูกแยกและทำความสะอาดเพื่อให้ได้ผลการทดลอง PCR ที่แม่นยำ
• การเลือกใช้เทคนิคที่เหมาะสมในการแยกสารพันธุกรรม
• ขั้นตอนนี้ส่งผลต่อการขยายพันธุ์ได้

หัวข้อย่อย: Design Primer สำหรับ PCR

• มีขั้นตอนในการออกแบบ: ตรวจสอบข้อมูลที่มีอยู่, เลือก target sequence, ออกแบบ primer, ตรวจสอบความเฉพาะเจาะจงของ primer, ประเมินคุณสมบัติของ primer (เช่นอุณหภูมิละลาย Tm), ตรวจสอบความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์ PCR

• แนะนำให้ใช้ primer ที่ออกแบบและผ่านการตรวจสอบแล้วสำหรับ assay ที่สนใจ

• ขั้นตอนในการออกแบบ novel primer : ค้นหาลำดับเป้าหมายอ้างอิง, ออกแบบ primer โดยใช้โปรแกรมออนไลน์, ตรวจสอบความเฉพาะเจาะจงโดยใช้ BLAST

หัวข้อย่อย: เลือก Target Sequence

• วางแผนขยายพันธุ์ผลิตภัณฑ์ขนาด 75-200 bp เพื่อให้สามารถแยกความแตกต่างจาก primer-dimers ได้อย่างชัดเจน
• หลีกเลี่ยงบริเวณที่มีโครงสร้างรอง (secondary structure)
• หลีกเลี่ยงบริเวณที่มีการซ้ำของเบส Gs หรือ Cs มากกว่า 3 เบส
• ควรเลือกบริเวณที่มีปริมาณ GC อยู่ในช่วง 50-60%

หัวข้อย่อย: การออกแบบ Primer

• ต้องการให้ GC content อยู่ระหว่าง 50-60%
• มีอุณหภูมิละลาย (Tm) อยู่ระหว่าง 50-65°C
• ควรอยู่ข้างนอกบริเวณที่มีโครงสร้างรอง (secondary structure)
• หลีกเลี่ยงการซ้ำของกของ Gs และ Cs มากกว่า 3 เบส
• ควรวาง Gs และ Cs ไว้ที่ปลาย primer
• ตรวจสอบว่าไม่เกิด complementarity
• ตรวจสอบความเฉพาะเจาะจงด้วย tools tools เช่น BLAST หรือ Primer-BLAST

หัวข้อย่อย: วิธีการหา Gradient Optimization สำหรับ PCR

• ค้นหาอุณหภูมิ annealing ที่เหมาะสม
• ทดสอบในช่วงอุณหภูมิสูงกว่าและต่ำกว่า Tm ของ primers
• ตรวจสอบผลด้วย electrophoresis
• อุณหภูมิ annealing ที่เหมาะสม คืออุณหภูมิที่ให้ผลเป็น band เดี่ยว
• ไม่มี band พิเศษ

หัวข้อย่อย: PCR Analysis

• ใช้ electrophoresis เพื่อวิเคราะห์ผลการทดลอง PCR
• มีการเลือกวิธี electrophoresis เช่น DGGE, TTGE
• ใช้การวิเคราะห์ semiquantitative

หัวข้อย่อย: Gel Electrophoresis

• วิธีการใช้ electrophoresis
• พิจารณาการใช้งาน agarose gel โดยคำนึงถึงขนาดของ DNA
• สารเรืองแสงที่ใช้ในการตรวจ: ethidium bromide หรือ SYBR® green
• การประมาณขนาด DNA
• การประเมินความเฉพาะเจาะจงของปฏิกิริยา PCR
• การตรวจบตำแหน่งและขนาดของ DNA fragment

หัวข้อย่อย: PCR Troubleshooting

• มีสาเหตุที่ทำให้ไม่มี band หรือ band อ่อนๆ

• มีสาเหตุที่ทำให้เกิด band ที่ไม่เฉพาะเจาะจงหรือ primer-dimer

• มีสาเหตุที่ทำให้เกิด bands Smeared

• การตรวจสอบสาเหตุ: อุณหภูมิและเวลาในการอบ, ปัญหาเกี่ยวกับส่วนประกอบของ PCR (เช่น dNTPs, template, primers, Mg2+), และปัญหาอื่นๆ