Moleculaire Biologie: Inleiding tot levende organismen

Moleculaire Biologie Inleiding

• Levende organismen zijn door een celmembraan of celwand afgescheiden van hun omgeving, de samenstelling verschilt per soort.

Eigenschappen van levende organismen

• Energie wordt opgenomen en verbruikt door alle levende organismen.
• Dieren nemen energie op via voedsel, planten via fotosynthese.
• Alle levende organismen evolueren in de tijd.
• Meercellige organismen groeien in complexiteit tot ze volwassen zijn.
• Ouderdom ontstaat door cellen die zich delen in twee of meer dochterorganismen.
• Voortplanting gebeurt via seksuele of a-seksuele voortplanting, via een bevruchte/onbevruchte eicel of afsplitsing.
• Organismen verzamelen gegevens uit de omgeving en reageren hierop, bijvoorbeeld op licht, gevaar of de aanwezigheid van voedsel.
• Organismen kunnen zelfstandig bewegen, bijvoorbeeld naar voedsel. Planten richten zich naar de zon en zoeken met wortels naar water en mineralen.
• Cellen en organismen communiceren met elkaar via moleculaire signalen; dit is noodzakelijk voor het leven en leidt tot biodiversiteit.

Moleculaire biologie definitie

• De wetenschap die chemische processen in levende wezens bestudeert, zoals voortplanting, beweging, energiewinning, groei en communicatie.

Onderdelen van een levende cel

• De cel is de kleinste, min of meer autonome eenheid van leven.
• De cel is afgescheiden van zijn omgeving en georganiseerd door interactie tussen eiwitten, vetten, koolhydraten en nucleïnezuren.
• Informatie voor celopbouw is aanwezig in elke cel en kan op een gecontroleerde manier tot expressie komen. Deze moleculen zijn betrokken bij verschillende functies en activiteit van de cel.
• De cel geeft eigenschappen door aan dochtercellen.
• Er zijn twee soorten cellen: prokaryoten en eukaryoten (met compartimenten en een celkern).

Mijlpalen in de geschiedenis van de erfelijkheidsleer

• Genen zijn informatie-bevattende elementen die de karakteristieken van een individu coderen voor erfelijke eigenschappen.

Wie is Mendel?

• Mendel definieerde genen als overerfbare kenmerken.
• In zijn studie met erwten concludeerde hij dat waarneembare eigenschappen terug te brengen zijn tot overerfbare eenheden.
• Elk individu bevat twee gekoppelde genen met meerdere allelen. Genen kunnen dominant, recessief of intermediair zijn.

Wie is Garrod?

• Garrod ontdekte in 1902 alkaptonurie, een zeldzame aandoening waarbij een defect gen een defect enzym oplevert (homogentisinezuur oxidase breekt homogentisinezuur af).
• Alkaptonurie is een erfelijke stofwisselingsziekte.
• Garrod stelde vast dat het een recessieve ziekte is, omdat niet alle kinderen de ziekte overerven.
• Dit onderzoek was een mijlpaal voor het onderzoek naar de moleculaire verklaring van erfelijkheid.

Genetische informatie

• Chromosomen zijn waarschijnlijk de dragers van genen, zichtbaar als draadvormige structuren tijdens de celdeling.

Fractioneren van cellen

• De cel fractioneren in verschillende componenten
• Cellen homogeniseren, hierbij worden de verschillende componenten in oplossing gebracht door detergenten of mechanische afbraak.
• Detergenten breken de celmembraan af, waardoor de inhoud in oplossing komt.
• Mechanische afbraak gebeurt met een mixer of sonicatie, waarbij ultrasoon geluid de celwand breekt.
• De oplossing verdelen in fracties door centrifugatie: differentiële of densiteitscentrifugatie.

Differentiële centrifugatie

• Maakt gebruik van verschil in vluchtigheid
• Cellen worden stukgemaakt door detergenten of mechanisch af te breken.
• Het homogenaat wordt gefilterd om grote brokstukken te verwijderen.
• Het gefiltreerde homogenaat wordt gecentrifugeerd met lage rotatiesnelheid (lage g-force), waardoor grote organellen naar de bodem gaan (pellet). Het materiaal erboven is het supernatans.
• De pellet word terug in oplossing in een nieuwe buffer gebracht en apart gehouden.
• Het supernatans gaat naar een andere centrifugebuis en wordt opnieuw gecentrifugeerd met een hogere rotatiesnelheid (grotere g-force).
• De stappen worden meermaals herhaald, waarbij steeds kleinere organellen naar de bodem gaan. Uiteindelijk blijft enkel het cytosol over als supernatans.
• Bij een rotatie van 50.000 rotaties per minuut kunnen g-krachten tot 300.000 keer de zwaartekracht ontstaan.

Densiteitscentrifugatie

• Maakt gebruik van verschil in dichtheid
• Verschillende lagen van oplossingen met dalende concentratie van sucrose in een centrifugebuis.
• Een celhomogenaat wordt bovenop de gradiënt aangebracht.
• Tijdens de centrifuge gaan de organellen naar de bodem en komen vast te zitten in de sucroseoplossing die overeenkomt met hun densiteit.
• Na centrifugatie zweven de organellen in de lagen van de gradiënt die overeenkomen met hun densiteit.
• Cesiumchloride kan gebruikt worden om kleine verschillen in densiteit tussen moleculen te bepalen.

Experiment van Griffith

• Doel: Het vergelijken van twee stammen van Streptococcus pneumoniae.
• S-stam (smooth vorm) veroorzaakt longontsteking bij proefdieren; R-stam (rough vorm) doet dit niet.
• Griffith voegde een homogenaat van de S-stam toe aan een bacterie van de R-stam en injecteerde dit in een muis, waardoor de muis longontsteking kreeg.
• Besluit: Bacteriën kunnen genen uit de omgeving opnemen (transformatie).
• Er werd een homogenaat van S-bacteriën gefractioneerd in RNA, DNA, vetten en koolwaterstoffen, waarna elke factie met de R-stam in een muis werd gespoten.
• Alleen de fractie met DNA kon de R-vorm omzetten in een S-vorm, waaruit bleek dat erfelijke eigenschappen zich in het DNA bevinden.

Het experiment van Hershey-Chase

• Bacteriofagen zijn virussen die bacteriën besmetten en bestaan uit een nucleïnezuurmolecule ingepakt in een eiwitmantel.
• Na infectie komen bacteriofaag eiwitten (genen) tot expressie in de bacterie en wordt bacteriofaag DNA gemaakt voordat de E. coli openbarst.
• Vraag: worden overerfbare eigenschappen overgebracht door de eiwitten of door het DNA van bacteriofaag?
• E-coli cultuur geïnfecteerd met bacteriofagen.
• Radioactief fosfaat (³²P) wordt toegevoegd aan een groeimedium, dat in het DNA van de nieuwe bacteriofaag terechtkomt. Radioactief zwavel (³⁵S) wordt toegevoegd aan een andere cultuur, dat enkel in de eiwitten van de nieuwe bacteriofaag terechtkomt.
• De twee culturen worden geschud om het contact tussen bacteriofagen en bacteriën te verbreken.
• Door centrifugatie worden de E-coli verzameld als pellet en blijven de kleinere bacteriofagen achter in het supernatans.
• Het radioactief fosfaat zit in de pellet (in de bacterie), het radioactief zwavel in de oplossing (het groeimedium).
• Besluit: DNA bevat informatie over de bouwstenen (van DNA als eiwitten) van de bacteriofagen.

De structuur van deoxyribonucleic acid (DNA)

• DNA (deoxyribonucleïnezuur) bestaat uit suiker, fosfaat en basen.
• DNA is de drager van erfelijkheid en bestaat uit zeer lange polymeren.
• DNA is een viskeuze oplossing bij opzuivering en is 1 meter lang bij een menselijke cel, welke een celkern heeft van 20 nanometer.
• DNA bevat de specifieke suiker deoxyribose (β-D-2-deoxyribose), een pentose afgeleid van β-D-ribose.
• DNA bevat een fosfaatgroep en nucleobasen (purines: adenine, guanine; pyrimidines: thymine, cytosine).
• Een base gebonden aan een ribose is een nucleoside door een N-β-glycosidische binding.

Nucleosides en Nucleotides

• Nucleoside = suiker (ribose of deoxyribose) + stikstofbase (A, T, C, G, of U).
• Nucleotide = nucleoside + één of meer fosfaatgroepen.
• Nucleotiden worden gemaakt door de cel zelf, partiële hydrolyse van nucleïnezuren door nucleasen of door enzymatische recuperatieprocessen van vrijgekomen basen.

Fosfaatbinding

• Fosfaat bindt aan de 5'-koolstof van de nucleoside.
• Er kunnen tot drie fosfaatgroepen binden in serie (fosforanhydridebinding).
• Desoxyribonucleoside-tri-fosfaten (dNTPs) zijn desoxyribonucleoside-tri-fosfaten zonder deoxilatie van ribose = NTPs. Enkel NTPs voornaamste dragers van biochemische energie.
• Fosfaten worden aangeduid met alfa, beta en gamma, beginnend bij de ribose; beta en gamma kunnen door enzymen afgesplitst worden.
• In DNA-ketens zijn ribosomen verbonden via fosfordiesterbindingen, waarbij de 5'-koolstof van de ene deoxyribose via een fosfaatgroep verbonden is met de 3'-koolstof van de vorige deoxyribose.

Belangrijke basen en nucleotiden

• Cyclische vorm van een mononucleotide, bijvoorbeeld 3'-5'-fosforzuurester (cAMP), zijn signaalmoleculen in biochemische processen.
• cAMP wordt gesynthetiseerd door adenylaatcyclase door alfa-fosfaat van ATP te binden met 3'OH van eigen ribose, en weer afgebroken door cAMP fosfodiesterase door hydrolyse van de verbinding tussen fosfaat en 3'OH.
• Cafeïne is een opwekmiddel dat de werking van fosfodiesterase remt, waardoor het effect van cAMP wordt versterkt.
• 3'-azido-2'-deoxythymidine (AZT) is een middel dat gebruikt wordt bij de behandeling van AIDS en remt het enzym (reverse transcriptase) dat noodzakelijk is voor de replicatie van HIV.
• Tenofovir remt het HIV-virus op een gelijkaardige wijze.
• Co-enzym A is betrokken bij acyltransfer-reacties.
• NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) is betrokken bij elektronentransfer.
• FAD (flavin adenine dinucleotide) is betrokken bij elektronentransfer.

Evolutie van kennis in DNA

• Chargaff's regel: elk organisme heeft van de 4 basen dezelfde hoeveelheid; de hoeveelheid adenine is gelijk aan thymine en guanine aan cytosine.
• Rosalind Franklin: heeft verklaard dat DNA helicaal is door x-straaldifractie op gekristalliseerd DNA.
• Watson en Crick: basen A en T komen gekoppeld voor in DNA.
• DNA is dubbelstrengig.
• Twee strengen vormen een dubbele helix en zijn anti-parallel.
• De afstand tussen de ruggengraten is overal gelijk.

Heden van DNA

• Dubbelstrengs molecuul met basen die naar elkaar toe liggen.
• Negatief geladen fosfaat aan de buitenkant, naar het water toe (lading wordt geneutraliseerd door Na⁺).
• Basen zijn complementair omdat ze waterstofbruggen vormen (2 tussen A en T, 3 tussen G en C).
• Basen liggen op een vlak dat loodrecht staat op de ruggengraat. Dubbele helix heeft 10,4 baseparen per winding.
• Ribosen en fosfaatgroepen zijn naar buiten gekeerd, baseparen naar binnen.
• B-helix heeft een grote en kleine groeve doordat de N-glycoside binding niet diametraal tegenover elkaar liggen. O-2 van de pyrimidine en N-3 van de purine zijn steeds naar de kleine groeve gekeerd.

Stabiliteit van DNA

• Waterstofbruggen en opeenvolging van wanderwaalskrachten geven de dubbele helix grote stabiliteit.
• Twee strengen van DNA kunnen scheiden door waterstofbruggen te breken (stijging temperatuur). Eerst gaat A/T binding breken, nadien G/C binding.

Notatie basenvolgorde

• DNA-streng wordt genoteerd van 5' -> 3' (links naar rechts), de 2de streng loopt anti-parallel van 3'-5'.
• De strengen zijn niet hetzelfde, omdat de opeenvolging van basen - fosfaten in de ruggengraat niet hetzelfde is.

Palindromische sequentie

• Een woord of zin die je in twee richtingen hetzelfde leest.

Palindroom ja of nee

• 'TCCGAAGCCT' is geen palindroom
• 'TCCGATCGGA' is wel een palindroom
• Korte palindromen worden herkend door specifieke enzymen die DNA enkel ter hoogte van die sequentiemodieven zal doorknippen.

Hyperchromiciteit en hybridisatie

• Veel moleculen absorberen licht en max van licht ligt bij een specifieke golflengte.
• DNA absorbeert UV-licht (260 nm) door de geconjugeerde bindingen in de basen
• Dubbelstrengig DNA heeft een absorptiewaarde van 1.0 (bij 260 nm) en een max lichtabsorptie (ultraviolet licht)
• Base in Dubbelstrengig DNA absorberen minder dan in enkelstrengig DNA.
• Hyperchromiciteit van enkelstrengig DNA= de absorptiewaarde van DNA in de tijd zal een plateau waarde bereiken bij een smelttemp.
• Wanneer de temperatuur stijgt, gaat DNA denatureren, door afkoelen kunnen complementaire strengen elkaar terugvinden als: DNA mengsels niet complex is en de temperatuurdaling traag gebeurt.

DNA electroforese

• DNA te bekijken
• DNA moleculen van verschillende lengte te scheiden
• Bepaalde DNA fragmenten op te zuiveren
• Agarose (hydrofiel, niet-ionisch, sterk gellerend polysaccharide dat uit zeewier word gezuiverd)
• Door opwarming word het opgelost. Na afkoeling onstaat er een gel
• DNA is negatief geladen (fosfaatgroepen in ruggengraat) migreert naar postieve pool van elektrisch veld
• Elktro-forese= dragen door elektriciteit
• Agarosegel heeft een netwerk gevormd en daardoor ondervinden grote DNA fragmenten meer weerstand
• Na een bepaalde tijd krijgt men scheiding op basis van lengte
• Ethidiumbromide (EtBr) is een plaintaire stof die zich migreert tussen de basenparen in dubbelstrengig DNA maar is carcinogeen