Microscopy Techniques

• Microscopía de fluorescencia se usa para observar estructuras autofluorescentes o con fluorocromos unidos a anticuerpos o sondas de ADN/ARN.
• Un microscopio confocal permite obtener imágenes de alta calidad de muestras histológicas marcadas con fluorocromos, eliminando la información fuera del plano focal.
• Un microscopio de fotones/excitación multifotónica es una variante del confocal para la observación tridimensional de colorantes fluorescentes en células vivas.
• Los microscopios electrónicos utilizan un haz de electrones en lugar de luz.

Tipos de microscopios electrónicos

• Microscopio electrónico de transmisión (MET).
• Microscopio electrónico de barrido (MEB).

Técnica

• La técnica consiste en el conjunto de pasos para la visualización de células y tejidos mediante el microscopio óptico.

Procedimientos de la técnica

• In vivo/Intravital: estudio de muestras directamente tomadas de un organismo vivo.
• In vitro/Supravital: estudio de células o tejidos vivos fuera del organismo.
• Post mortem: técnica histológica convencional aplicada a muestras después de la muerte.

Técnica histológica de rutina

• Se utiliza en citología, histología y diagnóstico histopatológico.
• Los colorantes se unen electrostáticamente al tejido.
• El proceso busca estudiar una porción de tejido o célula.
• El proceso consiste en seguir una serie de pasos.
• El preparado debe estar coloreado, ser fino y conservar la estructura normal.

Muestra

• Muestra histológica: porción de tejido procesada.
• Muestra citológica: células obtenidas por raspaje o aspiración.

Pasos de la técnica histológica

• Obtención de la muestra: biopsia (tejidos vivos) o necropsia (material cadavérico).
• Otras técnicas de obtención: raspaje (observar citologías) y punción aspirativa (aspiración con aguja fina).
• Fijación: Preservar la estructura y ultraestructura de los componentes celulares y tisulares.
• Los fijadores pueden ser físicos (desecación o congelación) o químicos (formol).
• La fijación se realiza por inmersión (sumergir la muestra en el fijador) o por perfusión (introducir la solución fijadora en la circulación sanguínea).
• Deshidratación: Eliminar el agua del tejido con concentraciones crecientes de alcohol.
• Aclaración: Sustituir el deshidratante (alcohol) por una sustancia soluble en el medio de inclusión, como el xilol. Esta etapa elimina los lípidos.
• Inclusión: Endurecer la muestra para su corte, utilizando parafina (en microscopía óptica) o resinas epoxi (en microscopía electrónica).
• Corte: Se realiza con micrótomos y produce muestras delgadas (5 a 10 µm).
• Montaje inicial: Colocar la muestra en un portaobjetos con albúmina como adhesivo.
• Desparafinación: Eliminar la parafina con xilol para permitir la rehidratación, necesaria para la coloración.
• Rehidratación: Recuperar la hidratación del tejido sumergiéndolo en soluciones de alcohol en concentraciones decrecientes.
• Coloración: Se utiliza hematoxilina (carga positiva) y eosina (carga negativa) para teñir componentes tisulares.
• Deshidratación y aclaramiento: Deshidratar en alcohol creciente y aclarar en xilol para pegar el cubreobjetos.
• Montaje final: Cubrir la muestra con un cubreobjetos utilizando un medio de montaje como el bálsamo de Canadá.
• Hematoxilina tiñe componentes basófilos (ácidos) de color azul violáceo, mientras que la eosina tiñe componentes acidófilos (básicos) de color rosado.
• La basofilia es la afinidad por colorantes básicos y la acidofilia es la afinidad por colorantes ácidos.
• Los lípidos se disuelven, y los glúcidos (excepto los cargados negativamente) son neutros y no se colorean.
• Las técnicas especiales permiten identificar componentes químicos específicos en células y tejidos.

Factores importantes en microscopía

• Índice de refracción del medio: El medio entre el preparado y el objetivo influye en la refracción de la luz.
• Semiángulo de incidencia de la luz: El ángulo de la luz al incidir en el objetivo afecta la resolución.
• Densidad del medio: Menor densidad resulta en menor refracción.
• Medios de mayor densidad: Agua o aceite causan mayor refracción, mejorando la inclusión de rayos en la formación de la imagen.
• Disminuir la longitud de onda de la luz: Usar luz azul o ultravioleta para mejorar la resolución.
• Aumentar la apertura numérica: Modificar el índice de refracción del medio (usar agua o aceite) para mejorar la resolución.

Como la imagen en una lente

• Lente objetivo: produce una imagen real, invertida y aumentada del objeto.
• Lente ocular: produce una imagen virtual, directa y aún mayor de la imagen formada por el objetivo.
• Combinación de lentes: la imagen final es virtual, invertida y altamente magnificada.

Tipos de microscopios ópticos

• Microscopio invertido: Permite la observación de cultivos celulares adheridos al fondo de cápsulas de Petri.
• Microscopio de fondo oscuro: Permite estudiar el relieve y la estructura superficial de células y microorganismos en preparados frescos.
• Microscopio de luz polarizada: Se usa para estudiar moléculas con alta estructura.
• Microscopía de contraste de fase: Permite observar células vivas sin teñir.

Partes del microscopio

• Lentes objetivos.
• Lentes oculares.
• Iluminación & condensador.
• Filtros & diafragma.

Lentes

• Las lentes objectives ofrecen una imagen real, aumentada e invertida.
• Existen lentes secas y de inmersión.
• El aumento va de 4X, 5X, 10X, 40X, hasta 100X.
• Objetivos DE CAMPO (vista panorámica)
• Objetivos SECO DÉBIL (mayor capacidad de aumento).
• Objetivos SECO FUERTE (más aumento).
• Lentes oculares proporcionan una imagen virtual, aumentada y derecha, con un aumento generalmente de 10X.

Sistema de iluminación

• Más antiguos usan un espejo.
• Los binoculares tienen iluminación propia.
• Condensador: enfoca la luz sobre el preparado.
• Diafragma: limita el haz de luz.
• Filtros: seleccionan las longitudes de onda.

Manejo del microscopio óptico

• Iluminación: Regular la intensidad de la luz.
• Enfoque: Usar el objetivo panorámico (4x) o seco débil (10x). Colocar el preparado con el cubreobjetos hacia arriba.
• Movilizar los tornillos hasta obtener el foco.
• Aumento: Relación entre el tamaño real del objeto y el observado. (producto del aumento del objetivo y del ocular)
• Poder resolutivo: es independiente al aumento o magnificación obtenida por la combinación lentes usadas.
• Límite de resolución (LR): mínima distancia para distinguir dos puntos separados.
• Poder resolutivo (PR): capacidad de un sistema óptico para ver detalles con claridad.

Microscopio

• Permite observar y estudiar células y tejidos.
• Microscopio de luz o fotónico.
• Funcionamiento: Absorción de luz visible por células y tejidos.

Partes del microscopio

• Mecánicas: tornillos, estativo, brazo, tubo, platina, revólver.
• Monocular cuenta con una lente ocular, puede desplazarse y revolver giratorio
• Binocular unicas peças son articuladas con sistema espejado

Tecnicas

• Técnica de PAS: visualiza hidratos de carbono (glucocáliz, membranas basales).

• Fundamento: ácido peryodico rompe, genera aldehídos, reacción de Schiff da color magenta.

• Compatible con H&E.

• Técnica de Feulgen: tiñe ADN en el núcleo (interfase o mitosis).

• Fundamento: ácido clorhídrico rompe estructura del ADN, se originan grupos aldehídos, reacción de Schiff.

• Actúa sobre las desoxirribosas.

• Tecnica de Sudan: Demuestra lípidos (triglicéridos, colesterol, fosfolípidos, esteroides).

• Fundamento: tinción física por afinidad a lípidos.

• No se puede usar junto a la parafina.

• No compatible con H&E.

• Existen Sudan black y Sudan III (rojo).

Otras técnicas especiales

• Técnica de Mallory: tiñe colágeno y MEC azul, citoplasmas rojos, fibras elásticas amarillas.
• Técnica de Masson y Van Gieson: tiñe núcleos azules, citoplasmas rojos, fibras colágenas celestes, eritrocitos rojos y músculo fucsia.
• Impregnación argénica (Cajal): utiliza sales de plata, observa tejido nervioso y fibras reticulares.
• Histoquímica enzimática: localiza enzimas, se incuba con el sustrato y reactivo de captura, se obtiene un producto coloreado.
• Metacromasia: capacidad de varios tejidos de cambiar el color del colorante.