Introducción a la Microscopía

Introducción a la Microscopía

• Las células son intrínsecamente pequeñas y complejas, lo que dificulta su visualización y estudio.
• El estudio de la estructura, composición molecular y funciones de las células es un foco principal para los investigadores.
• Métodos de análisis biológicos se clasifican en tres tipos principales: "in vivo," "in vitro," y "post-vitales."
• In vivo implica el estudio de un organismo vivo en su estado natural, como la observación de la motilidad de los espermatozoides.
• In vitro se refiere al estudio de un organismo mantenido vivo, pero fuera de su entorno natural.
• Post-vitales se refiere al estudio de un organismo después de su muerte.
• El objetivo principal de estos métodos es estudiar las células, superando retos como el tamaño y el bajo contraste en las estructuras biológicas.
• El microscopio y las técnicas histológicas, incluyendo el uso de colorantes, han contribuido a resolver estos desafíos.

Historia del Microscopio

• El primer microscopio fue inventado entre 1590 y 1620 por Galileo (según los italianos) y Janssen (según los holandeses).
• El término "microscopio" fue acuñado por los miembros de la "Accademia dei Lincei," una sociedad científica a la que pertenecía Galileo.
• En 1660, Malpighi utilizó el microscopio para probar la teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea.
• Hooke publicó su obra "Micrographia" en 1665.
• A mediados del siglo XVII, Leenwenhoek describió protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos usando microscopios simples.
• El microscopio de Leenwenhoek utilizaba una sola lente convexa (lupa), con un aumento de 50 a 270 veces.
• En el siglo XVIII, mejoras mecánicas aumentaron la estabilidad y facilidad de uso del microscopio.
• En 1877, Abbe publicó su teoría del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión usando aceite de cedro en lugar de agua, permitiendo aumentos de hasta 2000 veces.
• En la década de 1930, se alcanzó el límite teórico para los microscopios ópticos, sin mejoras en los aumentos superiores a 500 o 1000 veces.
• El microscopio electrónico de transmisión (MET) fue el primer tipo de microscopio electrónico, ideado por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931.
• El MET utiliza un haz de electrones en lugar de luz, logrando aumentos de hasta 100,000 veces.
• El microscopio electrónico de barrido (MEB) se desarrolló en 1942.

Unidades de Medida

• Es importante conocer las unidades de medida para dimensionar las estructuras celulares.
• Milímetro (mm): Es la milésima parte del metro y equivale a 0,001 m o 0,1 cm.
• Micrómetro (μm): Es la milésima parte del milímetro, también conocido como micra o micrón, y equivale a 0,001 mm.
• Milimicrón (mμ) o Nanómetro (nm): Es la milésima parte del micrón y equivale a 0,001 μm.
• Ángstrom (Å): Es diez milésimas partes del micrón y equivale a 0,1 mμ.
• Picómetro (pcm): Es la centésima parte del angstrom y equivale a 0,01 Å.
• El ojo humano puede discriminar dos puntos separados por más de 0,1 mm (100 μm).
• El microscopio óptico tiene un poder de resolución de 0,2 μm, necesario para estudiar estructuras más pequeñas.
• En cuanto a las medidas, las células y organelos se miden en micras (μm).
• Las subestructuras celulares y moléculas se miden en nanómetros (nm), Ångstroms (Å) o picómetros (pcm).
• El peso de los componentes celulares se expresa en picogramos (pg), donde 1 pg = 10^-12 g.
• El peso de las moléculas se expresa en Dalton (Da), siendo 1 Da la doceava parte de la masa atómica del carbono 12.
• El kilodalton (kDa), donde 1 kDa = 1000 Da, se utiliza para moléculas grandes.
• Una molécula de agua pesa 18 Da, mientras que una de hemoglobina pesa 64,5 kDa.

Poder y Límite de Resolución

• Poder de Resolución (PR): Es la capacidad de una lente o instrumento óptico para distinguir puntos cercanos como entidades separadas.
• Si dos puntos de un objeto no están suficientemente separados, se observarán como una sola estructura.
• El poder de resolución indica la capacidad del microscopio para discriminar los detalles finos.
• Límite de Resolución (LR): Es la mínima distancia que debe existir entre dos puntos de un objeto para que una lente los distinga como dos puntos diferentes.
• Cuanto menor sea el LR de un instrumento, mayor será su poder de resolución.
• El LR del microscopio óptico se encuentra entre 0,18 μm y 0,25 μm, dependiendo de la longitud de onda de la luz que se utilice.
• Los puntos separados por menos de 0,18 μm no se visualizarán como puntos separados.
• Por ejemplo, si un glóbulo rojo tiene un diámetro de 8 μm y la distancia entre dos puntos en su superficie es mayor que 0,18-0,25 μm, estos puntos se percibirán como distintos con un microscopio óptico.

Tamaño de Celulas

• La figura muestra los tamaños aproximados de células y componentes, y el límite de resolución de instrumentos.
• La progresión estimada va desde un pulgar hasta átomos, con aumentos en un factor de 10 para cada imagen sucesiva.
• Para observar un objeto, su tamaño debe ser igual o mayor al límite de resolución del instrumento.

Instrumentos Opticos

• Los microscopios ópticos, incluyendo lupas, son instrumentos de lentes que aumentan la visión directa con mayor detalle.
• Pueden incluir prismas, espejos, armazones de montaje y accesorios.
• La imagen que se obtiene es mayor, virtual y derecha.
• El aumento de una lupa es aproximadamente igual al cociente entre la distancia de visión clara (250 mm en el ojo normal) y la distancia focal de la lente.
• Una lupa con una sola lente es una "lupa simple" o "de mano.
• Una "lupa compuesta" tiene un sistema de lentes y puede ser monocular o binocular.
• La lupa binocular tiene dos tubos de lentes para cada ojo, con ejes ópticos que convergen en el objeto, produce una imagen tridimensional con aumentos de 8 a 20 veces.
• Las lupas se utilizan para examinar objetos de más de 0,07 mm (70 μm), se realizan estudios macroscópicos detallados.
• Las lupas binoculares se utilizan en cirugías oculares, neurocirugías y cirugías traumatológicas.
• Las lupas de mano son utilizadas por dermatólogos para examinar lesiones de piel, por biólogos para diferenciar plantas y por ingenieros agrónomos para estudiar daños en cultivos.
• Es importante tener en cuenta que los materiales no necesitan preparación y pueden ser vivos o muertos.
• Microscopio proviene del griego "mikro" (pequeño) y "scopeõ" (mirar); sirve para estudiar estructuras muy pequeñas más allá del ojo humano.

Partes del Microscopio Óptico

• El microscopio óptico incluye partes mecánicas y ópticas.
• La parte mecánica incluye: la base, la columna, el tubo porta lentes, el sistema de movimiento (tornillos macrométricos y micrométricos), la platina y los soportes de condensador, diafragma y filtros. Los componentes que sostienen los elementos mencionados.
• La base asegura la estabilidad del microscopio.
• La columna un soporte vertical que se extiende desde la base.
• El tubo portalentes es un cilindro metálico hueco, cuyo extremo inferior tiene un revólver y los objetivos.
• El sistema de movimiento moviliza el tubo con movimientos finos y gruesos usando tornillos macrométricos y micrométricos, controlando foco
• La platina es una placa metálica con un orificio para permitir el paso de la luz, donde se coloca el preparado a observar
• La parte óptica incluye: el sistema de lentes (objetivos y oculares), el aparato de iluminación (espejo, diafragma y condensador) y la fuente de iluminación.
• El sistema de lentes tiene lentes convergentes cerca del objeto, formando una imagen para que el ocular la haga visible.
• La "x" indica el factor de aumento.
• Los objetivos pueden ser "secos" (con aire entre la lente y la muestra) de 4x, 10x y 40x o "de inmersión" (con aceite de cedro), permitiendo una imagen más detallada.
• Los objetivos de inmersión son de mayor longitud, aumento (100x) y tienen "oil" u "olio" en la montura.
• Los oculares son dos lentes convergentes que amplifican la imagen, montadas en un tubo metálico, que tienen aumento grabado (5x o 10x)
• La imagen es formada por el objetivo, del que depende su riqueza en detalles, el ocular solo aumenta la imagen.
• El total del aumento es el producto del aumento del objetivo y el ocular.
• El aparato de iluminación incluye: un espejo (en aparatos sin fuente de luz), un diafragma iris (para regular la luz), un condensador (sistema de lentes convergentes) y la fuente luminosa.
• La fuente luminosa puede ser luz natural o artificial (lámpara eléctrica).
• Se usa iluminación diascópica o transmitida, con rayos de luz que atraviesan la muestra y penetran en la lente.

Tipos de Microscopios

• El microscopio de contraste de fases mejora la visualización de tejidos transparentes traduciendo los cambios de fase de la luz en variaciones de intensidad.
• Logra esto con modificaciones en el condensador (diafragma anular) y un objetivo especial (anillo de fase), creando una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad.
• El efecto es la diferenciación de partes celulares más brillantes o más oscuras según el índice de refracción.
• Se utiliza para examinar células y tejidos vivos sin tinciones, y observar la mitosis en cultivos celulares.
• El microscopio de campo oscuro bloquea los rayos centrales de luz usando un disco, permitiendo sólo la entrada de rayos desviados al objetivo, creando una imagen brillante sobre un fondo oscuro.
• Permite descubrir estructuras que no se resuelven con microscopía de campo claro.
• Se utiliza para identificar microorganismos, como bacterias del género Treponema (sífilis), en lesiones genitales.
• El microscopio de fluorescencia visualiza moléculas que emiten fluorescencia al ser iluminadas con luz excitatoria (UV).
• La molécula absorbe un fotón ultravioleta y emite un fotón de mayor longitud de onda (visible) al regresar a su nivel de energía original.
• La tinción fluorescente (fluorocromos) se utiliza en laboratorios, siendo los más famosos el isotiocianato de fluoresceína (FITC) y la rodamina.
• Los microscopios contienen una fuente de luz intensa (lámpara de mercurio) y filtros especiales para seleccionar la longitud de onda ultravioleta.
• Permite estudiar localización intracelular y movimiento de macromoléculas, evidenciando distribución de proteínas en células, organoides y citoesqueleto.
• Es utilizado en inmunofluorescencia, por su especificidad, sensibilidad y sencillez.
• Se basa en unir un fluorocromo con un anticuerpo para visualizar componentes celulares.
• Puede diagnosticar enfermedades infecciosas como toxoplasmosis y chagas mediante anticuerpos fluorescentes.
• Dentro de la microscopía de fluorescencia destacan FRAP y FRET.
• FRAP permite estudiar la dinámica intracelular de macromoléculas.
• FRET facilita la colocalización, interacción y mecanismos de acción entre proteínas vecinas.
• El microscopio de fluorescencia confocal realiza escaneos focalizados en puntos individuales, creando imágenes de alta calidad.
• Tiene un "pinhole" (agujerito) para controlar la trayectoria focal de la luz
• La fuente de luz es un láser poderoso que se dirige hasta la muestra dentro de un microscopio.
• Un barrido a diferentes posiciones del tornillo micrométrico toma imágenes que son unidas por un programa en 3D. Mejora la estructura celular, facilita la medición, define profundidades para analizar macromoléculas.
• El microscopio confocal mejora la calidad, pero no cambia su rango de resolución, que es 0.2 μm.
• El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar, debido a que la potencia amplificadora de otros microscopios está limitada por la onda de luz visible.
• La longitud de onda de los electrones (0,056 Å) es más pequeña que la onda de luz visible (4.000 Å).
• El microscopio hace que pasen electrones a través de un filamento a través de aceleración elevada para luego concentarlos con bobinas que actúan como condensador, que se dirige al objeto.
• Luego de esto, el haz vuelve a pasar por la bobina objetivo desviando algunos electrones y proyectándola en una pantalla o placa fotosensible.
• Hay dos tipos de microscopios electrónicos.
• MET (de transmisión): Los electrones desviados no forman parte de la imagen, así, las grandes estructuras aparecen más obscuras, y las de menor densidad aparecen más claras. Solo se pueden examinar células deshidratadas y fijadas.
• MEB (de barrido): Recorre por encima la muestra y enfoca simultáneamente varios planos. Detecta electrones dispersos que son transmitidos a una pantalla de televisión que los convierte en una imagen en tercera dimensión. Este tipo de microscopio aumenta hasta 20 000 veces las imágenes y no permite examinar células vivas.

Procesamiento y Análisis Digital de Imagen.

• Es fundamental conocer la muestra que se va a trabajar, y realizar investigación bibliografía antes de comenzar a trabajar.
• Etapas: obtención de la imagen, registrar todos los procedimientos utilizados para documentarlos. Captura de la imagen con cámaras conectadas o con un escáner, el segundo en menos calidad.
• Procesamiento de la imagen, es decir el tipo de información que se busca estudiar en programas como Photosop.
• Se puede realzar la imagen cambiando contrastes, aplicar filtros, cambiar el foco mientras lo demás no lo está, etc.
• Se puede cambiar la composición en color, los métodos de segmentación modifican intensidad y cantidad de luz.
• Se hace una importante consideración de cómo se va a guardar la imagen antes de trabajar con las archivos.
• Finalmente, es importante recordar que siempre el mismo que se debe analizar lo que se ve y "no lo que creemos" que se ve.