Introdução à Biotecnologia

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Biotecnologia

• Biotecnologia é qualquer aplicação de organismos, sistemas biológicos e seus derivados para a modificação de processo ou produtos
• Áreas da biotecnologia incluem:
  • Verde (Agricultura)
  • Vermelha (Diagnóstico)
  • Branca (Indústria)

Vantagens dos processos biológicos

• Há menor dependência de energias não renováveis
• O consumo de energia é reduzido
• Há menos desperdício de matéria-prima
• Menor geração de resíduos
• Maior seletividade e performance
• Redução da carga poluente

Vantagens dos processos químicos

• Nem todos os compostos sintetizáveis quimicamente podem ser sintetizados biologicamente
• Os rendimentos dos processos biológicos podem ser muito baixos
• Processos químicos têm controlos mais fáceis pois não possuem organismos vivos
• Normalmente não há questões éticas ou morais
• Operações em contínuo com grande estabilidade durante intervalos de tempo muito longos
• Processos bem estabelecidos sobre os quais há bastante "know-how"

Microbiologia

• Domínios biológicos incluem:
  • Bacteria
  • Archaea
  • Eucarya

Características Comuns

• Características comuns a todos os organismos:
  • Comunicação: Microrganismos emitem sinais químicos para se comunicarem.
  • Evolução.
  • Nutrição: Organismos absorvem nutrientes e libertam resíduos.
  • Diferenciação: Células formam células diferentes.
  • Reprodução: Organismos originam novos organismos.
• Microrganismos:
  • Multicelulares: Plantas/animais (Eucariotas)
  • Unicelulares: Bactérias (Procariotas), Protozoários/Fungos (Eucariotas)

Compostos Químicos

• Compostos químicos das estruturas celulares:
  • Ácidos nucleicos (polímero) -> Nucleótidos (monômero)
  • Lípidos -> Ácidos gordos
  • Proteínas -> Aminoácidos
  • Polissacarídeos -> Açúcares

Nucleótidos

• Nucleótidos são formados por:
  • Base nitrogenada (pirimidinas e purinas)
  • Grupo fosfato
  • Pentose
• Pirimidinas e purinas são tipos de bases nitrogenadas, pirimidina com um anel simples e purina com dois anéis fusionados, ligadas por pontes de hidrogénio
• Bases nitrogenadas não existem livres:
  • Ligam-se a uma pentose formando nucleósidos
  • Nucleósido liga-se a um grupo fosfato

Funções dos nucleótidos

• Funções dos nucleótidos:
  • "Transportadores" de energia química e açúcares
  • Coenzima (liga-se a uma enzima, catalisa reações químicas)
  • Reguladores de metabolismo

DNA e RNA

• DNA (ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico) são ácidos nucleicos
• DNA:
  • Polímero que alterna fosfato e pentose
  • Bases nitrogenadas emparelham no interior da dupla hélice espiralada
  • Cadeias complementares: A emparelha com T, G emparelha com C
  • Cadeias antiparalelas: Uma cadeia termina em C5, a outra em C3
  • Armazena a função genética, instruções para construir/manter um organismo vivo
• RNA:
  • Contem a informação genética do DNA
  • A sequência de bases é complementar à do DNA
  • Contém ribose em vez da pentose e uracilo em vez da timina
  • Apresenta uma cadeia única
• Três tipos de RNA:
  • RNA mensageiro: Tem informação para a formação de um peptídeo
  • RNA transferência: Traduz o código genético para aminoácido
  • RNA ribossómico: Componente estrutural e catabólico do ribossoma

Polissacarídeos

• Polissacarídeos (açucares) são hidratos de carbono
• Características dos polissacarídeos:
  • Elevado peso molecular
  • Ligam-se a proteínas (glicoproteínas)
  • Ligam-se a lípidos (glicolípidos)
  • Ligações covalentes muito fortes
  • Propriedades variam consoante o tipo de ligação

Proteínas (Aminoácidos)

• Proteínas formadas por:
  • Um grupo amino
  • Um grupo carboxílico
  • Um resíduo lateral
• A propriedade de cada aminoácido depende do tipo de resíduo lateral
• Proteínas podem variar em:
  • Composição de aminoácidos
  • Sequência de aminoácidos
  • Número de aminoácidos
  • Atividade estrutural
  • Atividade funcional: Catalítica (enzimas) e/ou transporte.

Estrutura das proteínas

• Estrutura das proteínas:
  • Sequência primária: Sequência linear dos aminoácidos
  • Sequência secundária: Resíduos laterais determinam interações intramoleculares, estrutura é estabilizada por pontes de hidrogénio entre grupos amino e carboxilo das ligações peptídicas
  • Sequência terciária: A proteína dobra-se, resíduos laterais ligam-se, estabilizada por pontes de bissulfito
  • Sequência quaternária: Formada por mais de uma ligação polipeptídeo
• A sequência primária é obrigatória, as outras são importantes para o funcionamento da proteína
• Desnaturação: Perda de estrutura e funcionalidade da proteína, nem sempre é irreversível, mas geralmente é se exposta a condições extremas

Diversidade Microorganismos

• Microrganismos (diversidade):
• Tamanho: Procariotas (0,5-2,0 μm), Eucariotas (2-200 μm), Vírus (20-450 nm)
• Complexidade celular: Pequena < Grande
• Diversidade morfológica: Pequena< Grande
• Diversidade metabólica: Grande > Pequena
• Morfológica: Diversidade da estrutura e da forma do organismo
• Metabólica: Diversidade das reações químicas que o organismo consegue realizar

Microrganismos procariotas

• Microrganismos procariotas:
  • Ribossomas -> Síntese de proteínas
  • Nucleoide -> Contém a informação genética
  • Citoplasma -> Ocorrem reações catabólicas
  • Parede celular -> Dá forma e proteção à célula
  • Membrana citoplasmática -> Regula a saída e entrada de substâncias
• Formas celulares: Bastonetes, cocos, filamentos

Microrganismos eucariotas

• Microrganismos eucariotas:
  • Lisossoma -> Digestão de enzimas líquidas
  • Núcleo -> Contém o material genético
  • Retículo endoplasmático liso -> Produção de lípidos
  • Retículo endoplasmático rugoso -> Possui ribossomas, faz glicosilação, forma pontes de dissulfureto e faz o enrolamento de proteínas
  • Citoplasma -> Ocorrem reações catabólicas
  • Ribossomas -> Síntese proteicas
  • Membrana citoplasmática -> Regula a saída e entrada de substâncias
  • Complexo de Golgi -> Modificação da glicosilação
  • Mitocôndrias -> Produção de energia
  • Nucléolo -> Síntese de ribossomas
  • Microtúbulos -> Confere rigidez
  • Cloroplasto -> Fotossíntese
  • Membrana celular -> Separação entre o núcleo e o meio da célula

Membrana citoplasmática

• Membrana citoplasmática:
  • Estrutura: Bicamada de fosfolípidos ou glicolípidos
    • Parte polar (hidrofílica): Gosta de água
    • Parte apolar (hidrofóbica): Não gosta de água
  • Funções:
  • Barreira osmótica
  • Proteínas de suporte
  • Conservação de energia: Local de geração de gradiente eletroquímico.

Sistemas de transporte transmembranar

• Sistemas de transporte transmembranar:
  • Difusão simples: Passagem direta de água e moléculas hidrofóbicos através da bicamada
  • Transporte ativo: Utilização de energia que provém da dissipação do gradiente
  • Transporte simples: Soluto não modifica quimicamente, energia dissipa o gradiente eletroquímico
  • Translocação de grupo: Soluto modifica-se quimicamente, energia hidrólise de moléculas
  • Sistema ABC: Soluto liga-se a uma proteína periplasmática não modificada quimicamente, energia hidrólise de ATP por uma proteína citoplasmática

Tipos de transporte transmembranar

• Como o transporte ocorre:
  • Uniporte: Transporta um soluto
  • Antiporte: Transporta dois solutos em direções opostas
  • Simporte: Transporta dois solutos na mesma direção

Parede celular

• Parede celular:
  • Equilíbrio a pressão de turrescência
  • Dá forma à célula
  • Protege contra agressões externas

Coloração de Gram

• Coloração de Gram:
  • Técnica de coloração diferencial para classificar bactérias pela parede celular
  • Gram positiva: Células ficam roxas
  • Gram negativa: Células ficam rosas

Proteção Osmótica

• Proteção osmótica:
  • Meio hipotónico: O potencial osmótico externo é mais baixo, logo há maior concentração de água no exterior da célula
  • Meio isotónico: Concentração de água e soluto dentro e fora da célula equilibrada
  • Meio hipertónico: Concentração de água dentro da célula é maior que no exterior, o potencial osmótico externo é mais alto
• Flagelos:
  • Em células procariotas
  • Microrganismos possuem flagelos para locomoção

Energia de Rotação

• Energia de rotação provém da dissipação do gradiente eletroquímico
• Bactérias movem-se aleatoriamente, mas se necessário, movem-se num gradiente de substância atrativa (quimiotaxia positiva) ou repelem-se de substância repulsiva (quimiotaxia negativa).

Substâncias Poliméricas

• Substâncias poliméricas intramoleculares:
  • Polímeros que se acumulam nas células como substâncias nutritivas de reserva
  • Glicocálix:
    • Aderência a superfícies aderentes, agregação celular, ligação de células hospedeiras
    • Proteção: Retenção de água em condições de desidratação
• Vírus:
  • Infeção de células animais
  • Transformação de células animais em células tumorais
  • Ciclo lítico: Morte da célula e libertação do vírus
  • Infeção persistente: Libertação lenta do vírus
  • Infeção latente: O vírus não danifica a célula inicialmente, mas depois ocorre o ciclo lítico
• Formas de dormência:
  • Endósporos
  • Esporos
  • Quistos
• Glicosilação: Açúcares adicionados a proteína ou lípidos, afetando estrutura, função e interação (bactérias não fazem)

Culturas mais utilizadas

• Microrganismos mais utilizados:
  • Procariotas: Eschecharia coli
  • Eucariotas: CHO -> Células animais

Proteínas Recombinantes

• Proteínas recombinantes:
  • Produzidas por engenharia genética, onde o DNA que codifica a proteína de interesse é inserido em um hospedeiro
  • Produção:
    • Speed: Células animais demoram mais a reproduzirem-se, bactérias são mais rápidas
    • Custo: Células animais precisam de meios de cultura complexos e ambientes controlados, plantas são mais baratas
    • Scale up: Plantas são mais fáceis de semear e produzir em larga escala
    • Regulação: Bactérias não implicam questões éticas
    • Modificação pós modificação: A célula animal produz proteínas glicosiladas, ao contrario das bactérias

Reatores

• Reatores mecanicamente agitados são adequados para processos com elevada densidade
• Coluna de bolhas preferível para processos biológicos

Meio de Cultura

• Meio de cultura:
  • A composição deve ser equilibrada com o tipo metabólico do organismo
  • Composição:
    • Fonte de energia
    • Fonte de carbono
    • Fonte de azoto
    • Sais minerais
  • Substrato para fonte de energia/carbono:
    • Glucose (dispensável, usado quando indispensável) / Sacarose
    • Melaço (substituto da glucose, pouco dispendioso)
    • Extrato de malte
  • Substrato para fonte de azoto:
    • Sais de amónia
    • Ureia
    • Soja

Mecanismos Metabólicos

• Catalisadores:
  • Reações químicas catalisadas
  • Catalisador:
    • Reduz a energia de ativação da reação
    • Aumenta a velocidade da reação
    • Não é modificado durante a reação
  • Catalisadores biológicos: Enzimas (proteínas)
  • Local ativo:
    • Local de ligação do substrato à enzima
    • Fenda ou ranhura
    • Substrato liga-se ao local ativo por ligações fraca
  • Interação enzima e substrato:
    • Modelo de chave: O substrato encaixa no sítio ativo
  • Modelo encaixe induzido: O sítio ativo muda

Outras informações sobre Enzimas

• Enzimas:
  • Proteínas (aminoácidos)
  • Ativas quando na conformação correta
  • Seletivas relativamente aos substratos
  • Conjunto de enzimas determina a via metabólica da célula
  • Cofatores (moléculas não proteicas)
    • Ião metálico: Liga-se fortemente à enzima no local ativo
    • Molécula orgânica: Derivado de uma vitamina, liga-se fracamente à enzima

Catabolismo

• Catabolismo:
  • Reações catabólicas obtêm energia, necessária ao crescimento
  • A célula acumula energia química sob a forma de:
    • Compostos químicos com ligações de alto conteúdo energético
    • Gradiente eletroquímico transmembranar

Mecanismo Celulares

• Mecanismos celulares que permitem a síntese de ATP:
  • Fosforilação a nível de substrato
  • Fosforilação oxidativa

Energia própria das Células

• Para obter energia, a célula transforma nutrientes através de um ou mais conjuntos de reações químicas
• Vias metabólicas utilizadas dependem da constituição genética e condições ambientais
• Fonte de energia é sempre um dador de eletrões (reduzido que se vai oxidar)
• Se a fonte cede eletrões, a célula tem de ter um composto para os receber

Processos Metabólicos

• Processos metabólicos geradores de energia:
  • Reações redox
  • Geração de equivalentes redutores
  • Geração de gradiente protónico
  • Geração de ATP

Processos Catabólicos

• Respiração aeróbia:
  • Glicólise: Ocorre no citoplasma
    • Começa com uma molécula de glicose
    • Primeira etapa: Fosforilação, que torna a glicose polar
  • Ciclo de Krebs: Ocorre no citoplasma das células procariotas, ou na matriz das mitocôndrias nas células eucariotas
    • Via central para o metabolismo aeróbio
    • Sentido horário (energia), sentido anti-horário (aminoácidos)
  • Cadeia de transporte de eletrões: Ocorre na membrana celular de células procariotas e na membrana mitocondrial das células eucariotas
    • NADH e FADH doam eletrões a uma série de transportadores que liberta energia
• Fosforilação oxidativa: Dissipação do potencial eletroquímico, libertação de ATP

Síntese de ATP

• Síntese de ATP:

1. Passagem dos protões pela ATP sintase
2. Conversão de ADP em ATP: ATP sintase usa energia para catalisar a reação

Fermentação

• Fermentação:
  • Ocorre na ausência de oxigénio e de aceitadores finais externos
  • Produz menos ATP do que a respiração
  • Piruvato -> Produtos finais
  • No final, um produto redutor é obtido
  • Coenzimas regeneram-se na cadeia respiratória
• Resumo: Comparação de etapas (glicólise, Krebs, cadeia de eletrões) e aceitador de eletrões em respiração aeróbia, respiração anaeróbia e fermentação
• Resumo da respiração aeróbia: Glicólise, ciclo de Krebs e cadeia de transporte de eletrões

Biorremediação

• Biorremediação:
  • Processo biotecnológico de remoção, neutralização ou transformação de contaminantes
  • Poluente: Composto natural ou sintético nocivo
  • Dissipação do poluente no ambiente: Processo natural de redução da concentração de um contaminante

Mecanismo Físicos, Químicos e Biológicos

• Mecanismos físicos, químicos e biológicos:
  • Volatilização: Substâncias voláteis evaporam para a atmosfera
  • Fotodegradação/Degradação química: O poluente é quebrado
  • Degradação biológica: Microrganismos degradam o poluente
  • Absorção a partículas do solo: Poluente adere a partículas do solo
  • Descargas para águas naturais
• Degradação do poluente:
• Transformação química do poluente em substâncias menos tóxicas
• Biológica:
  • Mineralização (conversão de compostos orgânicos complexos em substâncias inorgânicas simples)
• Químico/biológica: - Degradação parcial (transformação de um poluente em compostos menores sem mineralização total)

Remoção de sistemas biológicos

• Utilização de sistemas biológicos para remoção de poluentes:
  • "In situ": Aplicação no local
    • Intrínseca (organismos degradam ao longo do tempo)
    • Provocada (bioestimulação e/ou inoculação)
  • "In vitro": Remoção de solo contaminado para tratamento
• Culturas biológicas:
  • Puras (um único tipo de microrganismo)
  • Mistas (múltiplos tipos de microrganismos)
• Ação dos organismos sobre o poluente: - Absorção - Alteração do estado de oxidação - Degradação parcial - Mineralização

Tratamento de águas

• Tratamento de águas residuais:
  • Eutrofização:
    • Enriquecimento excessivo de nutrientes
    • Desenvolvem-se algas que impedem passagem de O2
    • Fosfatos acumulados -> Metabolismo anaeróbio Perigo de propagação de microrganismo patogénicos, acumulação de resíduos de substâncias odoríferas ou de compostos tóxicos Estação de tratamento de águas residuais (ETAR): Objetivos: - Redução do conteúdo orgânico ou em nutrientes inorgânicos
• Determinação em conteúdo de matéria orgânica: - Carência bioquímica de oxigénio (CBO) Carência química de oxigênio (CQO)
• Carbono orgânico total (CTO) - Águas residuais domésticas: Dejetos humanos, águas de lavagem

Processos de Tratamento

• Tratamento de águas residuais:

1. Preliminar (físico): Gradagem (elementos sólidos), desarenação (areias), homogeneização
2. Primário (físico): Separação gravítica de sólidos em suspensão, gorduras
3. Secundário (biológico aeróbio/anaeróbio): Redução de CBO, N ou fosfato orgânico, remoção de microrganismos
4. Terciário (físico-químico): Redução de nitratos, fosfatos: desinfeção

Componentes de uma ETAR

• Estação de tratamento de águas residuais (ETAR):
  • Utilização de parafuso de Arquimedes para elevar a água
  • Remoção de elementos sólidos e areias (tratamento preliminar)
  • Remoção de sólidos e gorduras em suspensão (tratamento primário)
  • Tanque de lamas ativadas
    • Função de baixar o CBO, onde ocorre a respiração aeróbia -Arejamento fornece O2 aos organismos organotróficos que promovem o seu crescimento Tanque de lamas ativadas Tratamento terciário, processo digestor anaeróbico

Sucessão Microbiana

• Sucessão microbiana durante a compostagem:
  • Fase de latência
  • Fase mesófilica, libertação de calor
  • Fase termofílica, morte de bactérias
  • Fase de arrefecimento, termófilos esporulam novamente
  • Fase de maturação, bacterias nitrificantes

Digestor Anaeróbico

• Digestor anaeróbio de lamas:
  • Vantagens:
    • Uso de CO2 como aceitador final de eletrões
    • Produção de metano Lamas ativadas: Mistura de primário obtive/ obtém/arejou/reciclou tempo Lamas são cápsulas. Usados no tratamento de água por ter mais processos

Desenvolvimento Microbiano

• Desenvolvimento microbiano:
  • Fatores que controlam o desenvolvimento microbiano:
    • Temperatura, oxigénio, atividade da água, pH, nutrientes, pressão
  • Efeitos da temperatura:
    • Diminuição do movimento
      • Desnaturação proteica
• Efeito do pH: Acidez/basicidade estimula acidofilos
• Efeito da atividade da água: Não tem nenhum solo
• Efeito do oxigênio: Anaeróbio

Indústria Alimentar

• Indústria alimentar
  • Microrganismos benéficos transformam alimentos, nocivos contaminam-nos
  • Alimentos ricos em celulose/pectina (apodrecimento), proteínas (putrefação) ou lípidos (ranço)
  • Métodos de conservação de alimentos: Valores extremos para atividade da água, pH e temperatura
• Análise de controlo de qualidade bacteriológica:
• Microrganismos indicadores de contaminação (indicam contaminação fecal, duram mais que os patogénicos)
• A motivos de indicador de urarem microorganismo indicadores são: Porque os microrganismos patogénicos

Características dos microorganismos indicadores

• Microrganismos indicadores
  • Estão presentes na água poluída ausentes na água sem contaminação Presentes quando patogénicos estão presentes
• Nº de indicadores acima do nº de patogénicos Normalmente, os indicadores são inócuos para o Homem São de fácil identificação

Reprodução Celular

• Reprodução
  • Procariotas: assexuada, por fissão binária
  • Eucariotas: assexuada (mitose)

Etapas Mitose

• Etapas da Mitose(assexuada) -Interfase G1 (2N): a célula tem dois conjuntos de cromossomas- homólogos são idênticos entre si- se houver algum problema um cromossoma, existe sempre outro cromossoma idêntico. Desvantagem: gastamos recursos -Interfase S: Divisão de cada cromossoma em 2 cromatídeo -Prófase: A membrana nuclear desintegra-se -Metáfase: Alinham-se
• Anáfase: Um cromatídeo de cada cromossoma move-se para polos opostos
• Telófase: Um cromatídeo de cada cromossoma atinge cada polo da célula
• Citocinese: 2 células filhas geneticamente idênticas à célula mãe
• As células evoluem através de mutações

Reprodução Sexuada

• Reprodução meiose
• Etapas
• Emparelhamento dos cromossomas homólogos, sobrecruzamento dos cromatídeos- "crossing over"- e afastamento dos cromossomas homólogos e a membrana nuclear desorganiza-se
• A divisão tem de ocorrer com grande precisão para que nenhum cromatídeo ganhe ou perca genes- se o processo não ocorrer corretamente dão se mutações
• O alinhamento vai existir
• Há controle da qualidade na meiose durante estes processos
• Mutações cromossómicas estruturais(Inversão, Duplicação, Deleção, Translocação)

Crescimento Populacional

• Crescimento populacional microbiano: O aumento do número de células da população ao longo do tempo:

• Crescimento populacional(quantificar o crescimento/ determinar a taxa de crescimento)

• Contagem/ Biomasa/ Proteinas

• Contagem Direta/ Microscópio Conhecido de amostra

Células Viáveis

• Colônia
• Não Colônia
• Amostras/ diluições/ Repetições e tabelar

Determinação da Biomasa

• Peso húmido: Pesa se filtra/ lavam-se as células/ pese - peso por litro de cultiva
• Turbidimetria

Através da densidade ótica por medir-se a luz que dispersa. O processo e rápido ou seja e um teste Células ou proteína

Ciclo de Crescimento Bacteriano

• Fase de adaptação (μ ~ 0) -Condições de crescimento -Fase de crescimento do inoculo -Composição do meio de cultura -Condições da incubação -Estado das células

• Fase experimental(μ = μmax) -Binaramente

• Características genéticas

• Condições de incubação

Outras FASES

• Fase estacionária (μ ~ 0): -Não consegue aumenta Algumas células experimenta divisão , mas também algumas morrem

• Fase de morte (μ < 0): Morte celular esgotamento das reservas energéticas ou algum problema