Histologiniai tyrimai

Histologinis (Histopatologinis) Tyrimas

• "Histos" reiškia audinį, "techne" reiškia meną, amatą, mokėjimą.
• Atliekant histologinį tyrimą iš gyvūno lavono arba gyvo gyvūno paimtas audinio ar organo gabalėlis specialiai apdorojamas, ruošiami histologiniai pjūviai, kurie dažomi HE ir stebimi mikroskopu.
• Histologiniam tyrimui naudojamas šviesinis mikroskopas.
• Esant poreikiui, nefiksuoti audinių mėginiai gali būti siunčiami įvairiems laboratoriniams tyrimams, įskaitant virusologinius, bakteriologinius, mikologinius ir toksikologinius tyrimus.

Audinių Mėginių Paėmimas Histologiniam Tyrimui

• Po gaišimo gyvūlio lavonas turėtų būti kuo greičiau patalpintas į vėsią patalpą, kad būtų išvengta autolizės.
• Autolizė greičiausiai prasideda skrandyje ir žarnyne (po kelių minučių nuo gaišimo).
• Po kelių valandų autolizė prasideda kepenyse ir inkstuose, o širdyje, skeleto raumenyse ir plaučiuose – po 24 valandų.
• Autolizę sukelia ląstelių savivirška, o taip pat mikroorganizmai, sukeliantys puvimą.
• Audiniai histologiniam tyrimui imami autopsijos metu arba tuoj išskrodus lavoną, vasarą – ne vėliau kaip per 2-3 val., žiemą – per 12 val.
• Žodis "autolizė" kilęs iš graikų kalbos žodžių "autos" (pats) ir "lysis" (tirpdymas, atskyrimas).
• Paimtus audinių mėginius būtina tuoj pat fiksuoti.
• Žodis "autopsija" kilęs iš sudurtinio graikų kalbos žodžio "autopsia" – pats ir žiūrėjimas, matymas. "Biopsija" kilęs iš graikų kalbos žodžių bios – gyvybė ir žiūrėjimas, matymas.
• Audiniai tyrimui imami atsižvelgiant į organo histologinę sandarą ir juose esančius pakitimus.
• Jei mėginiai užteršti krauju ar išskyromis, jie nuplaunami fiksatoriumi.
• Prieš dedant į fiksavimo skystį, organai ir audiniai atitinkamai paruošiami: parenchiminiai organai supjaustomi ne storesniais kaip 5mm pjūviais.
• Mėginyje turi būti visos organo zonos, anatominiai barjerai – jungiamojo audinio kapsulės, įpjaunami arba pašalinami.
• Kepenų ir blužnies audinių gabaliukai imami iš bet kurios organų vietos ties organų kapsule.
• Inkstai ir antinksčiai pjaunami statmenai, kad būtų paimti visi organų sluoksniai. Skrandžio, žarnų, pūslės ir kitų tuščiavidurių organų daromi sienelių skersiniai pjūviai.
• Širdies audinių mėginiai išpjaunami plonesnėse sienelės vietose, jei pjūvyje norima matyti epikardą, miokardą ir endokardą.
• Plaučių gabaliukai išpjaunami pasirinktoje organo vietoje ties pleura. Galvos ir stuburo smegenų gabaliukai išpjaunami fiksavimui priklausomai nuo tyrimų uždavinių.
• Jei organuose yra pakitimai, pakitę audiniai imami riboje su sveikais audiniais. Jeigu pakitimas yra didelės apimties arba vystėsi stadijomis, imama keletas gabaliukų, kad tiriant galima būtų matyti visas pakitusio audinio zonas.
• Stambiems gyvūnams išpjaunami organų gabaliukai, o smulkiems gyvūnams imamas visas organas.
• Smulkūs mėginiai, laiku nepamerkti į fiksatorių, gali negrįžtamai išdžiūti.
• Audinių gabaliukai išpjaunami aštriais įrankiais, tuoj pat fiksuojami.
• Fiksuojamos medžiagos gabaliukai turi būti ne storesni kaip 5-10 mm.

Fiksatoriai ir Fiksavimas

• Fiksatoriai į audinius skverbiasi lėtai ir skirtingu greičiu.
• Didžiausia skvarba – formaldehido (1mm per val.), kiek lėčiau – acto rūgštis, gyvsidabrio chloridas, metilo alkoholis, pikrino rūgštis.
• Fiksuojant buferiniu formalino tirpalu, įprastomis sąlygomis, fiksacijai pakanka 6-8 val.
• Jei per ilgai – ilgiau nei 24 val, audiniai kietėja, tampa trapūs.
• Optimali fiksavimo temperatūra – kambario 18-24.
• Tinkamiausių fiksatorių pH svyruoja nuo 6 iki 8. Jei žemesnis pH ar aukštesnis, pažeidžiamos audinių mikrostruktūros.
• Audinių ultrastruktūros išsaugomos tik buferiniame tirpale, kurio pH artimas fiziologiniam audinių skysčiui – nuo 7,2 iki 7,4.

Audinių Mėginių Paėmimas Iš Gyvo Organizmo – Biopsija

• Priklausomai nuo pažeidimo pobūdžio, lokalizacijos, tyrimo tikslo ir naudojamų priemonių, biopsijos metu gaunama arba ląstelių masė arba nedidelis audinio gabalėlis histopatologiniam tyrimui.
• Kai kada, išpurškus adata gautą ląstelių turinį į specialią ląstelių terpę ir nucentrifugavus, galima pagaminti ląstelių parafininius blokus (miniblokai).
• Citologinis tyrimas – kai tiriama gautų ląstelių masė, be audinio/organo histologinės struktūros. Šis diagnostikos būdas yra paprastas ir greitas, gerai atpažįstama ląstelių morfologija, mažai traumuojamas pacientas.
• Priklausomai nuo audinio rūšies bei naviko lokalizacijos citologiniams bei histologiniams tyrimams gali būti naudojamos įvairios biopsijų technikos.
• Medžiaga histopatologiniam tyrimui paimama chirurginės operacijos metu arba endoskopuojant.
• Ląstelių masė gaunama adata, organų atspaudais ir eksfoliacijos būdu.
• Gauta biopsinė medžiaga fiksuoja įvairiausiais būdais.

Audinių Mėginių Fiksavimas

• Fiksuojant sustabdoma pomirtinė audinių autolizė, inaktyvuojant hidrolitinius fementus – fiksus (lot.).
• Dauguma fiksuojančių skysčių sukelia baltymų koaguliaciją – coagulatio (lot.). Audiniai fiksuojami siekiant juos išlaikyti tokioje būklėje, kokioje jie buvo organizme iki gyvulio mirties.
• Fiksavimas suteikia cheminį stabilumą, neleidžia išsiplauti sudedamosioms dalims, sustandina audinius ir tuo palengvina jų pjaustymą, sumažina audinių apimtį, padidina jų imlumą histologiniams dažams, veikia antiseptiškai ir sumažėja mikroorganizmais.
• Fiksacijos procesas dar nėra pilnai aiškus. Audinių fiksavimo klaidos pakeičia jų histologinę sandarą, sukelia artefaktus (kilęs iš lotynų kalbos žodžių "arte" – dirbtinai ir "factus" – padaryta).
• Fiksavimas – cheminių procesų seka, kurios metu audiniai išsaugomi nuo irimo ir parengiami tolesniems.
• Fiksuojant audinius svarbios baltymus stabilizuojančios reakcijos.
• Fiksuojančios medžiagos turi savybių, formuojančių jungtis tarp baltymų molekulių. Surišti baltymai formuoja gelį, įtraukiantį visas šalia esančias giminingas medžiagas, tirpūs baltymai tampa struktūriniais. Dėlto fiksuotas audinys įgyja mechaninį tvirtumą.
• Audinių fiksavimo trukmė priklauso nuo fiksuojančio skysčio sudėties ir temperatūros.
• Prieš fiksavimą audiniai neplaunami vandeniu, nes jie gali pabrinkti.
• Fiksuojančio skysčio tūris turi būti 15-20 kartų (geriausia – 30 kartų) didesnis už fiksuojamų audinių gabaliukų tūrį. Audinių gabaliukai gali būti perveriami baltais siūlais.
• Kai kada fiksuojamas visas organas, ir kad pasiskirstytų fiksatorius, jis suleidžiamas į organą.
• Siunčiant fiksuotą patologinę medžiagą, būtina užtikrinti, kad indas neatsidarys.
• Būtina parinkti tinkamą fiksatoriaus koncentraciją. Negalima ilgai laikyti audinių nefiksuotų, konsvervuojant audinius, juose susidaro ledo kristalai.
• Svarbu, kad fiksatoriaus būtų 15-20k daugiau nei audinio, nes fiksuojant pasikeičia fiksatoriaus sudėtis.
• Fiksavimo būdai: fizinis ir cheminis.
• Fiksuojantys skysčiai: paprasti ir sudėtiniai.

Fiksatorius

• Fiksatorių skirstymas pagal tirpiklį: vandeniniai, bevandeniai, be formalino ir sudėtiniai – mišiniai.
• Dėmesio - fiksatoriuje gali ištirpti kai kurios audiniuose esančios organinės medžiagos.
• Dažniausia naudojami fiksatoriai: Formalinas.
• Fluorescencinė mikroskopija.
• Gliutaraldehidas
• Spiritas – etanolis arba metanolis.
• Acetonas.
• Sublimatas (HgCl2).
• Sudėtiniai tirpalai arba mišiniai.
• Fiksatorių pH.
• Fiksacijos šalutinis efektas.

Audinių Mėginių Dekalcinavimas (Jei Reikia)

• Pašalinti iš kaulų arba audinių, kuriuose yra sukalkėjimų, kalkes, t.y. sukalkėjusias vietas.
• Dekalcinavimui naudojamos mineralinės (druskos, azoto) arba organinės rūgštys (skruzdžių) rūgštys, o taip pat elektrolizės metodas.
• Dekalcinuojama gerai fiksuota medžiaga, geriausia 25 % formaline.
• Dekalcinuojamo skysčio tūris turi būti 25-30 kartų didesnis nei audinio gabalėlių tūris.
• Dekalcinavimas baigtas, jei gabalėlis yra elastingas ir į jį lengvai lenda preparavimo adata.
• Dekalcinuotus gabalėlius galima pjaustyti šaldomuoju mikrotomu arba įlieti celoidiną. Įliejimas į parafiną nėra labai tinkamas.

Audinių Mėginių Suformavimas (Trimingavimas) Ir Talpinimas Į Kasetes

• Prieš audinių mėginius įmirkant ir užliejant parafinu ar kitą medžiaga, jie yra paruošiami – nupjaunami nereikalingi kraštai, paliekamos reprezentatyvios vietos atsižvelgiant į atitinkamo organo ar audinio struktūrą.
• Paruošti gabalėliai dedami į kasetes. Ant kiekvienos kasetės užrašoma informacija apie mėginį, identifikacinis numeris.

Audinių Mėginių Paruošimas Pjaustymui

• Prieš pjaustant mikrotomu, fiksuotus tiriamos medžiagos gabalėlius reikia: plauti vandeniu, pašalinti vandenį (dehidratuoti) ir užlieti stingstančiomis medžiagomis.

Audinių Mėginių Plovimas

• Plaunant iš tiriamų audinių pašalinamas fiksažas ir fiksuojančio skysčio nuosėdos.
• Priklausomai nuo fiksavimo būdo, fiksuoti gabalėliai plaunami vandenyje arba spirite.
• Formaline fiksuoti gabalėliai paprastai 24 val. valandas plaunami tekančiame vandenyje (vandentiekio), o fiksuoti mišiniuose su pikrino rūgštimi - 70°- 80° spirite.

Audinių Mėginių Dehidracija

• Prieš užliejant stingstančiomis medžiagomis, iš gabalėlių pašalinamas vanduo (laivas vanduo).
• Kad audiniai nesideformuotų, vanduo šalinamas didėjančios koncentracijos spiritu (dažniausiai etilo alkoholiu).
• Absoliutus spiritas gaunamas iš 96° spirito, užpylus juo bevandenį vario sulfatą arba negesintas kalkes (CaO).

Audinių Mėginių Skaidrinimas

• Šiame etape pašalinama dehidruojanti medžiaga – palaipsniui pakeičiama tokia medžiaga, kuri maišosi su standinančiomis medžiagomis.
• Skaidrinimui dažniausia naudojamos Ksilenas, Chloroformas, Toulenas, Benzenas ir Kedro aliejus

Histologiniai tyrimai apima audinių mėginių fiksavimą, apdorojimą ir analizę. Autolizė prasideda kepenyse ir inkstuose. Audinių mėginiai turi būti nedelsiant panardinami į fiksatorių, kad būtų išvengta artefaktų.