T16Hibridación con sonda genética

• Las técnicas de hibridación con sonda utilizan una secuencia conocida de material genético marcada para identificar regiones específicas de ADN o ARN.
• La principal utilidad de estas técnicas es determinar la presencia o ausencia de regiones particulares de ácidos nucleicos.

Aplicaciones de la hibridación con sonda:

• Estudio de patologías genéticas, como alteraciones cromosómicas.
• Identificación de enfermedades infecciosas mediante la detección del material genético del organismo infeccioso.
• Cuantificación del ARNm para estudiar la expresión genética.
• Estudios de investigación comparando secuencias de ADN para establecer patrones evolutivos.

Tipos de sondas:

• Fragmentos marcados de ácido nucleico que se unen al ácido nucleico objetivo.
• Pueden ser de doble hebra o monocatenarias, pero deben tener al menos una hebra funcional.
• Pueden ser de ADN, ARN u oligonucleótidos, capaces de unirse tanto a ADN como a ARN.
• Sondas de ADN: Obtenidas por clonación de ADN o PCR, suelen ser bicatenarias.
• Sondas de ARN: Obtenidas por transcripción de ADN clonado, suelen ser monocatenarias.
• Sondas de oligonucleótidos: Fragmentos de ADN monocatenario de 15-50 nucleótidos, sintetizados con secuencias complementarias.
• El ADN de la muestra debe desnaturalizarse antes de la hibridación.

Tipos de marcaje:

• El marcaje permite la visualización de la sonda y la evaluación de la hibridación.
• Marcación directa: Utiliza marcadores radiactivos (fósforo 32, fósforo 33, tritio, azufre radiactivo) o no radiactivos (biotina, digoxigenina, fosfatasa alcalina, luminol, peroxidasa).
• Marcación indirecta: Detecta un producto final resultante de una interacción o reacción química.
• Marcado por traslación de mellas: Se crean fragmentos cortos de ADN con ADNasa y se añaden nucleótidos marcados mediante ADN polimerasa.
• Marcado por cebado al azar: Se utilizan fragmentos de 6 nucleótidos (hexanucleótidos) y ADN polimerasa para incorporar nucleótidos marcados.
• Marcado en los extremos: Se marcan uno o varios nucleótidos terminales en fragmentos pequeños.

Fases de la hibridación:

• Preparación o extracción del material genético (sonda) y desnaturalización si es bicatenario.
• Adición de la sonda marcada a la muestra.
• Hibridación entre la sonda y el ácido nucleico objetivo por complementariedad de bases.
• Lavado para eliminar las sondas no unidas.
• Detección de la unión entre la sonda y el ácido nucleico.

Técnicas de transferencia e hibridación de ácidos nucleicos en soporte sólido (Southern Blot):

• Los ácidos nucleicos se unen a un soporte sólido como un chip.
• El ADN se extrae, se fragmenta con enzimas y se separa por electroforesis según el tamaño.
• El ADN se desnaturaliza con HCl y NaOH, se transfiere a un soporte sólido y se incuba con la sonda marcada.
• Se realiza la detección después de lavar la sonda no unida.
• Es útil para estudiar fragmentos de ADN y detectar alteraciones.

Northern Blot:

• Se estudia ARN, normalmente ARNm, el cual se extrae, se separa por electroforesis y se transfiere a un soporte sólido.
• El ARN se fija a un soporte y se hibrida con la sonda marcada.
• Se enfoca en la expresión génica para verificar la expresión de un gen específico.

Microarrays:

• Se utilizan chips sólidos de plástico, vidrio o silicona donde se producen reacciones de biología molecular.
• Los chips contienen múltiples sondas adheridas para permitir el análisis simultáneo de varios fragmentos de ácidos nucleicos, facilitando estudios de alto rendimiento.
• Arrays de expresión génica: evalúan la expresión de múltiples genes a partir de ARNm transcrito a ADNc y pueden estudiar microARN (miARN).
• Chip-on-chip: evalúan la mayoría del genoma y las regiones a las que se unen determinadas proteínas.
• CGH (Hibridación Genómica Comparada): detecta alteraciones en el número de copias del material genético.

Hibridación Fluorescente In Situ (FISH):

• La hibridación se realiza directamente sobre el tejido o extensión cromosómica.
• FISH: hibrida ADN con sondas fluorescentes (fluorocromos).
• Las sondas se unen a regiones específicas como locus determinados, centrómeros o de manera general a todo el cromosoma.
• Normalmente se utilizan células en metafase, pero también se emplean técnicas en células en interfase.

Etapas de la técnica FISH:

• Preparación y fijación de la muestra con formaldehído al 4% durante 4 horas a 4°C.
• Hibridación con la sonda marcada.
• Tinción de contraste con DAPI.
• Visualización con microscopio de fluorescencia.
• Fijación con formaldehído, Secar muestra, Deshidratar con etanol, añadir Tampón de hibridación y sonda marcada, Cámara de hibridación durante 2 horas, Tampón de lavado, Eliminar tampón de lavado, Secar muestra, Teñir con DAPI, Lavar con agua mili-Q y alcohol al 70 %, Observar al microscopio de fluorescencia

Hibridación In Situ Cromogénica (CISH) e Hibridación In Situ Cromogénica con Plata (SISH):

• La coloración se produce a través de una reacción inmunohistoquímica visible con un microscopio convencional.
• Detección de secuencias génicas virales.
• Detección de ARNm de inmunoglobulinas para valorar infiltrados de linfocitos
• Estudios de expresión génica, detectando ARNm.
• Un anticuerpo se une a la sonda marcada.
• SISH utiliza sustancias con plata como cromógeno.

Ventajas de FISH:

• Permite observar células en división, parafinadas o congeladas.
• Es rápida.
• Tiene gran especificidad y sensibilidad, permitiendo analizar un gran número de células.
• Es útil para el estudio de aneuploidías.
• Su precisión puede alterarse por la calidad de los reactivos empleados, de la sonda, de la fijación y la temperatura de desnaturalización.

Hibridación genómica comparada (CGH):

• Se hibridan dos muestras genéticas, una conocida y otra a analizar.
• Se compara la cantidad de ADN hibridado con las sondas marcadas.
• Se utiliza colorante rojo para el ADN en estudio y colorante verde para el ADN de referencia.
• Si las hebras control y de estudio están completas y son del tamaño adecuado, se obtiene un color amarillo.
• La pérdida de material genético resulta en predominio del color verde y la sobreexpresión en predominio del color rojo.
• Cuando el resultado en una CGH es amarillo, significa que todas las hebras control y de estudio están completas y con su tamaño correspondiente.

Lavado poshibridación:

• Se realiza después de la hibridación.
• Se utiliza un tampón con condiciones de rigurosidad controladas por temperatura, fuerza iónica y concentración de formamida.
• El objectivo es mantener los híbridos formados y eliminar los imperfectos.
• Para mayor rigurosidad, se debe elevar la temperatura del lavado o usar un tampón con baja concentración salina y alta concentración de formamida.

Registro de resultados y sus métodos:

• Marcaje radiactivo: Autorradiografía con rayos X para detectar puntos, manchas o bandas oscuras.
• Fluorocromos: Microscopía de fluorescencia con excitación a una longitud de onda específica para observar la emisión fluorescente.
• Haptenos: Se usan anticuerpos antihapteno marcados con fluorocromos (microscopía de fluorescencia) o enzimas (microscopía convencional con productos coloreados).