DNA-Aufnahme in Bakterien

Aufnahme von DNA in Bakterien

• Konjugation bezieht sich darauf, wenn sich Bakterien aneinander lagern.
• Während der Konjugation wird eine Zellplasmabrücke ausgebildet.
• Bakterien tauschen während der Konjugation Plasmide aus.
• Bei der Transduktion werden Phagen verwendet, um DNA in eine Bakterienzelle zu übertragen.
• Die DNA der Bakterien kann in die Phagen eingebaut werden.
• Bei der Transformation wird DNA durch die Zellwand aufgenommen.
• Die Transformation findet häufig im Labor statt.

Plasmide

• Plasmide sind ringförmige DNA.
• Sie ermöglichen eine rasche Übertragung von Informationen von einer Bakterienzelle zur nächsten.
• Sie werden oft genutzt, um Resistenzen zu übertragen.
• Plasmide können als Vektor dienen.
• Sie haben Schnittstellen für Restriktionsenzyme.
• Mit einem Markergen kann man überprüfen, ob die Übertragung der DNA erfolgreich war.
• Ein Promotor ermöglicht das Ablesen fremder DNA in der Wirtszelle.

Restriktionsenzyme

• Restriktionsenzyme sind Enzyme (Proteine), die doppelsträngige DNA schneiden können (ds DNA).
• Virale DNA kann mit Hilfe von Restriktionsenzymen zerstört werden, was die eigene DNA mittels Methylierung schützt.
• Restriktionsenzyme werden in der Gentechnik eingesetzt, um fremde DNA in ein Plasmid einzubauen.
• Es gibt Restriktionsenzyme, die "sticky ends" und solche, die "blunt ends" erzeugen.
• Kombiniert man ein Plasmid mit fremder DNA, so entsteht ein rekombinantes Plasmid.
• Fremde DNA kann im Bakterium vermehrt werden.

Markergene

• Bakterien nutzen Plasmide, um Resistenzen zu übertragen.
• Im Labor verwendet mann Marker-Gene, um Zellen zu selektionieren, die das rekombinante Plasmid aufgenommen haben.
• Bakterien ohne Plasmid sterben auf einem Nährmedium mit Antibiotikum.

PCR (Polymerase-Kettenreaktion)

• Die PCR ist eine Methode, um geringe DNA-Mengen zu vermehren (z.B. in der Forensik).
• Die PCR erfordert eine Veränderung der Temperatur, Primer, Nucleotide aller vier Basen und Enzyme.
• Im ersten Schritt der PCR wird die DNA-Doppelhelix durch Erhitzen auf 94°C getrennt.
• Im zweiten Schritt werden Primer bei ca. 50°C angelagert.
• Einzelsträngige DNA (ss DNA) verbindet sich wieder zu doppelsträngiger DNA (ds).
• Da viel Primer im Gemisch vorhanden ist, erfolgt meist die Verbindung mit Primern.
• Im dritten Schritt wird das Gemisch auf ca. 75°C erhitzt.
• Die Taq-Polymerase baut die komplementären Nucleotide an die DNA an.
• Die DNA wird überall dort verdoppelt, wo Primer gebunden haben.
• Der Anbau erfolgt von 5' nach 3'.
• Die PCR-Vorgänge werden 20 bis 30 Mal wiederholt.
• So erhält man mehrere Millionen Kopien eines DNA-Abschnitts.
• Die PCR ist nicht für die Vervielfältigung der gesamten DNA geeignet.
• Es entstehen potenziell mehr Fehler, da keine Reparatur und Korrektur erfolgt.

Elektrophorese

• Ein Agarosegel wird mit einer leitenden Flüssigkeit bedeckt.
• DNA-Proben werden in das Gel gegeben.
• DNA wandert zum Pluspol, aufgrund der negativ geladenen Phosphate.
• Das Gel hat Poren, welche die Wanderung beeinflussen.
• Die Geschwindigkeit der Wanderung hängt ab von der Stärke des elektrischen Felds, der Ladung, der Größe und der Form des Moleküls.
• Lange DNA wandert langsamer.
• Die Elektrophorese dient der Auftrennung nach Größe.
• Bei der Elektrophorese wird immer auch ein Marker mitgeführt.

DNA Sequenzierung

• Die DNA-Sequenzierung dient der Bestimmung der Reihenfolge der Basen in der DNA.
• Die DNA-Sequenzierung basiert auf der Methode nach Sanger.
• Die DNA-Kette wird künstlich unterbrochen.
• Didesoxinucleotide (ddNTPs) werden eingesetzt, die am 3'-C-Atom ein H-Atom aufweisen.
• Der Einbau von ddNTPs führt zu einem Kettenabbruch, da keine Replikation mehr möglich ist.
• Für die DNA-Sequenzierung sind ein DNA-Einzelstrang und Primer notwendig.
• Außerdem werden ssDNA, Nucleotide, markierte dd-Nucleotide und Polymerase benötigt.
• Es erfolgt eine Synthese des zweiten Strangs.
• Wenn ein dd-Nucleotid eingebaut wird, kann die DNA nicht verdoppelt werden, was zu einem Kettenabbruch führt.
• Der Kettenabbruch erfolgt jedoch nicht immer an derselben Stelle.
• Es entstehen unterschiedlich lange Fragmente.
• Diese Fragmente können in der Elektrophorese aufgetrennt werden.
• Ein Detektor erfasst verschiedene Farbstoffe.
• Daraus ergibt sich die DNA-Sequenz.