Consulenza Genetica: Diagnosi e Rischi

• La consulenza genetica è un atto medico specializzato che richiede una stretta collaborazione tra il medico specialista e il laboratorista.
• La consulenza genetica ha come finalità principale definire la diagnosi della malattia, valutarne la componente genetica e determinare il rischio di ricorrenza familiare.
• L'applicazione di un test genetico richiede il consenso informato del paziente, al quale devono essere spiegate le funzionalità, la sensibilità e la specificità del test.
• È importante informare i pazienti sulla disponibilità di strutture specifiche per l'assistenza ai malati, sia a livello riabilitativo che sociale.
• Nel caso di rischi riproduttivi consistenti, la consulenza genetica diventa prenatale, aiutando la coppia a pianificare la gravidanza e fornendo informazioni sulla diagnosi prenatale.
• La decisione di proseguire la gravidanza spetta unicamente alla coppia.
• Il consulente genetista deve fornire tutte le informazioni necessarie per consentire alla coppia di prendere decisioni informate.

Determinazione della Base Genetica della Malattia

• La diagnosi clinica, con i suoi segni caratteristici, indirizza verso una specifica malattia.
• Conoscendo più di 6000 malattie monogeniche, è possibile calcolare il rischio di ricorrenza con una certa precisione.
• Ricostruire l'albero genealogico è fondamentale per raccogliere informazioni e valutare il rischio di ricorrenza.
• L'albero genealogico parte dal probando e risale (o discende) nell'albero genealogico.
• La consanguineità è un fattore di rischio per malattie recessive ed è un'indicazione per la consulenza genetica.
• Se nota la componente genetica, si può proporre un test genetico per identificare la mutazione e valutare il rischio riproduttivo.
• Il test genetico richiede il consenso informato prima del prelievo del campione biologico.

Principali Indicazioni per la Consulenza Genetica

• Anamnesi familiare positiva per malattie mendeliane, malformazioni congenite o malattie cromosomiche.
• Età materna avanzata (>35 anni), che consente l'accesso gratuito alla diagnosi prenatale in Italia.
• Presenza di un riarrangiamento cromosomico bilanciato in uno dei due individui della coppia.
• Poliabortività o infertilità, che possono avere cause genetiche.
• Riscontro ecografico di malformazioni fetali, ritardo dello sviluppo fetale o alterato volume di liquido amniotico.
• Riscontro di alterazioni a un test di screening del 1º o 2º trimestre.
• Consanguineità, che aumenta il rischio di malattie recessive sia X-linked che autosomiche.
• Esposizione a teratogeni durante l'attività professionale o per altri motivi.

Rischi Riproduttivi nelle Malattie Mendeliane:

• Malattie autosomiche dominanti: 50% di rischio riproduttivo per l'individuo eterozigote.
• Malattie autosomiche recessive: 25% di rischio riproduttivo da due portatori sani.
• Malattie X-linked recessive: 50% di rischio per i figli maschi di una donna portatrice.

Difetti di Chiusura del Tubo Neurale:

• Sono anomalie congenite con base multifattoriale, predisposizione genetica e carenza di acido folico.
• Spina bifida: è la più comune e compatibile con la vita postnatale, ma richiede interventi chirurgici.
• Anencefalia: è incompatibile con la vita postnatale.
• La prevenzione si attua con l'assunzione di acido folico, specialmente in epoca preconcezionale per coppie a rischio.

Anomalie Cromosomiche:

• Trisomia 21: rischio di ricorrenza dell'1% aggiunto al rischio dell'età materna, rischio variabile se causata da traslocazione robertsoniana.
• Monosomia X: sindrome è sporadica.
• Trisomia 13 e 18: raramente compatibili con la vita.
• La correlazione con l'età materna si spiega con la non-disgiunzione degli ovociti bloccati nella 1ª divisione meiotica.

Cosa Sapere sui Riarrangiamenti Cromosomici:

• I riarrangiamenti cromosomici bilanciati sono: traslocazioni reciproche e robertsoniane, e inversioni paracentriche e pericentriche. Traslocazioni reciproche: scambio di tratti cromosomici tra cromosomi non omologhi.
• Traslocazioni robertsoniane: coinvolgono i cromosomi acrocentrici con saldatura delle braccia lunghe.
• Inversioni: rotazione di 180° di un frammento cromosomico all'interno dei punti di rottura.
• Rischio di ricorrenza delle traslocazioni bilanciate è circa 5%, globalmente 15%.
• I portatori hanno un rischio riproduttivo aumentato a causa di anomalie cromosomiche e poliabortività.

Cosa Si Intende Per test Genetici?

• Si intendono le analisi di specifici geni, del loro prodotto o della loro funzione.
• Nonché ogni altro tipo di indagine del DNA, RNA o dei cromosomi finalizzata ad individuare o ad escludere mutazioni associate a patologie genetiche.

Tipologie di test genetici

• Diagnostici: per individui sintomatici.
• Di identificazione dei portatori sani: per malattie con incidenza elevata.
• Presintomatici: per individui a rischio di malattie a esordio tardivo.
• Predittivi di suscettibilità: per varianti associate a malattie non monogeniche.
• Farmacogenetica: per la correlazione tra l'azione dei farmaci e il genoma individuale.

Materiali Utilizzabili per i Test Genetici:

• DNA estratto da: sangue, cellule della mucosa boccale, villi coriali, blastomeri, resti biologici.
• RNA estratto da tessuti specifici e convertito in DNA tramite RT-PCR.
• Proteine.

Analisi del Cariotipo

• Corrisponde alla ricostruzione dell'assetto cromosomico di un individuo.
• Utile per anomalie di numero e struttura con dimensioni maggiori di 4 megabasi.
• Comporta il bandeggio G (Giemsa), che evidenzia le regioni ricche in A-T e G-C.
• Il campione biologico viene posto in coltura e poi bloccato in metafase.
• I cromosomi vengono colorati e analizzati al microscopio.
• L'analisi di più vetrini è fondamentale per valutare il mosaicismo.

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization).

• Tecnica per valutare microdelezioni e microduplicazioni (<4 megabasi).
• Si basa sull'uso di sonde di DNA sintetiche fluorescenti che si legano a specifiche regioni cromosomiche.
• Permette di verificare la presenza o l'assenza di una regione di DNA nel patrimonio genetico del paziente.
• Si utilizzano sonde locus specifiche e di controllo.
• Esempio: microdelezione sul cromosoma 22.
• Può essere eseguita anche su nuclei in interfase.

CGH-array (Comparative Genomic Arrays)

• Permette di visualizzare microdelezioni e microduplicazioni (<3 megabasi) e di analizzare contemporaneamente tutte le coppie di cromosomi su un vetrino.
• Si ibrida sul vetrino il DNA del paziente marcato con una molecola fluorescente e un DNA di controllo.
• La comparazione dell'intensità del segnale indica delezioni o duplicazioni nel paziente.
• Un software analizza l'intensità del segnale e riporta graficamente il rapporto tra le due intensità.
• Non è in grado di vedere le alterazioni cromosomiche bilanciate perché essendo un'analisi comparativa (confronto la quantità di DNA del pz e del controllo) non vedo se ci sono delle traslocazioni bilanciate, robertsoniane.
• È considerato un test genetico di 1° livello per indagare quadri clinici con malformazioni congenite, ritardi mentali o di sviluppo.

QF-PCR (Quantitative Fluorescent PCR)

• Test genetico rapido per la valutazione delle principali aneuploidie alla nascita (trisomie 21, 13, 18 e dei cromosomi sessuali).
• Si basa sull'estrazione del DNA da cellule fetali e sull'analisi di specifiche regioni cromosomiche con PCR multiplex e elettroforesi capillare.
• Permette di ottenere risultati in 24-48 ore.
• Comunque bisogna attendere il cariotipo fetale.

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

• Tecnica utilizzata per valutare piccole delezioni o duplicazioni del gene CFTR.
• Valuta sbilanciamenti del DNA a livello molto fine, anche dei singoli esoni del gene.
• Può essere utilizzata per l'analisi dei geni BRCA1 e BRCA2.

Consulenza Genetica Prenatale

• In consulenza genetica prenatale devono essere riportate tutte le informazioni disponibili per la malattia in questione, sui rischi che va incontro la coppia sottoponendosi alla diagnosi prenatale a quello che il test genetico vede e non vede, e anche qualora il test genetico è positivo spiegare che spesso non è poi facile associare a quel test genetico positivo un fenotipo sicuro.
• La diagnosi prenatale si effettua quando il rischio riproduttivo della coppia è superiore al rischio di specie.
• Il rischio di specie è = 3%, che è una stima sulla popolazione generale di nascita di bambini con malformazioni o malattie genetiche. Tutti noi ci avviciniamo a una gravidanza con questo rischio riproduttivo di base di 3%.

Indagini Strumentali Utilizzate In Diagnosi Prenatale

• Ecografia del 1º trimestre: datazione precisa e benessere fetale.
• Ecografia del 2º trimestre (morfologica): valutazione morfologica del feto.
• Ecocardiografia fetale: per valutare malformazioni cardiache.
• Ecografia del 3º trimestre (flussimetria Doppler): scambio di nutrimento tra madre e feto.
• Test di laboratorio (triplo test e ultrascreening): sono test di screening predittivi per valutare il rischio riproduttivo.
• Non sono test diagnostici, e si basano sulla correlazione di specifici marcatori con l'età gestazionale.

Screening Genetici Non Invasivi

• Si basano sull'analisi del DNA fetale libero circolante nel plasma materno.
• Dal plasma materno si isola il DNA, il quale è poi sequenziato per identificare anomalie cromosomiche.
• Si usa un approccio di sequenziamento di nuova generazione.
• Tali test in realtà valutano il rischio a posteriori, e sono test predittivi: essi misurano solo alcune frazioni del DNA.

Test Diagnostici Prenatali Invasivi

• Tali test implicano dei rischi per la donna. Le tecniche più utilizzate sono l'amniocentesi e la villocentesi.
• Amniocentesi: si esegue tra la 16° e la 18 settimana, consiste nell'aspirazione di liquido amniotico sotto guida ecografica ed il rischio è < 1%. È indicata quando il rischio riproduttivo della coppia è < 25%. L’analisi mira alla valutazione del cariotipo fetale.
• Villocentesi: si esegue tra la 10° e la 12° settimana, con aspirazione dei villi coriali che sono analizzati per stimare il cariotipo. Il rischio è tra il 2-3 %.
• Cordocentesi: ormai soppiantata.
• In alcuni centri si possono avere dei problemi: sia insufficienza del campione, mosaicismi sia risultati genetici che non danno sicurezze complete.

Analisi del DNA e del cariotipo

• Si procede con un prelievo dei villi coriali, con la tecnica più adatta per individuare le mutazioni puntiformi. Si amplifica il tratto DNA e si valuta il nucleotide.
• Nel caso di mosaicismi: il referto riguarda un feto affetto, non potendo sapere dove si trova la linea cellulare mutata.
• Individuare il mosaicismo si fa analizzando 3 differenti metafasi, sapendo che se la linea non è selvatica (cioè reale) la linea cellulare è diversa alla selvatica in tutti i vetrini (è un reale mosaicismo)

Malattie Genomiche: Definizione e Quadro Clinico

• Le malattie genomiche includono le sindromi cromosomiche da microdelezione e microduplicazione, e hanno come caratteristica in comune d'essere causate da micro-riarrangiamenti del genoma.
• I micro-riarrangiamenti sono alterazioni del cromosoma di dimensioni variabili da qualche centinaia di kilobasi a 4 milione di basi, e sono generalmente tutte al di sotto del limite di risoluzione del cariotipo.
• alterazioni strutturali che coinvolgono delle regioni di DNA < 4 megabasi non vengono rilevate dal cariotipo standard.
• test genetico principale per valutare eventuali anomalie cromosomiche di numero, ma anche di struttura purché esse siano anomalie che coinvolgano regioni di DNA con dimensioni > di 4 milioni di basi.
• Test genetico utile:: FISH.
• arrayCGHI .
• Il quadro clinico è causato dall'alterazione, cioè la aploinsufficienza di uno o più geni nella regione coinvolta dal micro-riarrangiamento. Il gene che viene alterato (delezione o duplicazione), è un gene dosaggio-sensibile.

Basi sui Meccanismi Patogenetici

• Meccanismo: le LCR adiacenti condividono ≥ 95% di sequenza strutturale predisponendo la regione cromosomica a riarrangiamenti strutturali.
• La consanguineità è un fattore di rischio per le malattie recessive ed è un'indicazione per la consulenza genetica.
• Viene chiamato ricombinazione omologa non allelica perché avviene tra regioni o segmenti di DNA che non sono alleli, ma che hanno un'elevata identità di sequenza (non sono omologhi al 100%). Viene chiamata NAHR. Questa NAHR può avvenire sia tra 2 cromosomi che sono tra di loro omologhi tra tipi di cromatidi dell stesso cromosoma.

Esempi di Sindromi correlate:

• La regione dei breakpoint è una regione di DNA in cui la sequenza è quasi identica al 100% → la rottura avviene in quei sottoblocchi dove l'identità di sequenza è praticamente 100%. Spesso anche in questi tratti possono essere variabili. Quì sono frequenti disomomorfismi e segni ascrivibili a diverse malattie.
• Sindrome di Prader-Willi e Sindrome di Angelman: > 75% dei pz affetti hanno una micro-delezione in una regione del braccio lungo del cromosoma 15.

Test Genetici per le Malattie:

• Sono le analisi di specifici geni; dei loro prodotti o della loro funzione.
• Tipi: diagnostici, di identificazione dei portatori sani, presintomatici, farmacogenica.
• Materiali: DNA estratto da cellule del sangue, muscosa, cellule amniotiche, RNA etc.