Clonaje Molecular: Fundamentos

Clonaje Molecular

• Creación de copias idénticas de una secuencia de DNA en un vector.
• Elementos principales del clonaje:
  • Inserto: Gen o secuencia de DNA de interés, puede provenir del mismo organismo del vector o de otro.
  • Vector: Molécula de DNA donde se introduce el inserto, comúnmente plasmídico.

Esquema General del Clonaje

• El vector es un plásmido, el inserto se obtiene a partir de otra molécula de DNA.
• Se combina el inserto y el vector para formar una nueva molécula de DNA.
• Se introduce en una célula bacteriana para su amplificación in vivo.

Etapas del Clonaje

• Diseño de estrategia de clonaje:
  • Selección del inserto y el vector.
  • Selección del tipo de clonaje y enzimas de restricción.
• Obtención de la molécula de DNA recombinante:
  • Purificación del plásmido (vector).
  • Obtención de suficiente cantidad de inserto mediante PCR.
  • Digestión del inserto y el vector por enzimas de restricción.
• Introducción de los productos de ligación en la célula hospedera.
• Crecimiento de las células transformadas en medio selectivo.
• Identificación de los clones recombinantes.

Estrategia de Clonaje

• El proceso de clonaje se basa en el uso de enzimas de restricción en el vector y el inserto.
• Diseño de la estrategia de clonaje:
  • Selección del inserto y el vector.
  • Selección del tipo de clonaje y enzimas de restricción.
• Selección del vector:
  • Origen de replicación.
  • Marcador de selección.
  • Sitios de reconocimiento para enzimas de restricción.

Vectores

• Tipos de vectores:
  • Plásmidos: Son los más utilizados, pueden insertar hasta 15kb de DNA, tienen entre 2 y 500 copias.
  • Vectores de clonaje: Contienen sitios de restricción apropiados para insertar un fragmento de DNA.
  • Vectores de expresión: Se utilizan para la expresión de proteínas recombinantes.
  • Vectores de lanzadera (shuttle): Contienen 2 orígenes de replicación para especies diferentes.
• Características de los vectores:
  • Número de copias por célula del vector.
  • Presencia de un polylinker complejo.
  • Promotor.
  • Primers de PCR y/o secuenciación.
  • Marcador.

Bacteriófagos

• Virus que infectan bacterias.
• Complejos de ácido nucleico-proteína.
• Pueden presentar dos ciclos de vida: Clico lítico y Ciclo lisogénico.
• Familias más usadas en biología molecular:
  • M13: Vectores derivados se usan para secuenciación, mutagénesis dirigida y Phage Display.
  • Fago λ: Vectores derivados se usan para clonaje, expresión y genotecas.

Vectores Derivados de Fago λ

• Vectores de inserción: Insertar hasta 10kb de DNA.
• Vectores de reemplazamiento: Inserto máx de 20kb de DNA.
• Cósmidos: Vectores híbridos que combinan características de plásmidos y bacteriófagos.### Vectores de Clonaje
• Fagémidos: Vectores híbridos entre un plásmido y el bacteriófago M13, utilizados para preparar DNA de cadena sencilla a partir del origen de replicación de M13.
• Cromosomas Artificiales (BAC): Tipo especial de plásmido con un inserto entre 100.000 - 300.000 pb, con un bajo número de copias (una o dos).
• Vectores tipo YAC (Yeast Artificial Chromosomes): Provienen de levaduras, contienen todos los elementos necesarios para su mantenimiento en el núcleo de la levadura, y pueden contener insertos de hasta 1-2 Mb.

Clonaje

• Tipos de Clonaje:
  • No direccional: Extremos romos, enzima de restricción única, extremos cohesivos generados por enzimas compatibles.
  • Direccional: Extremos cohesivos generados por enzimas no compatibles, extremo romo/extremo cohesivo.
• Selección de Enzimas de Restricción: Deben cortar solo una vez el vector, preferiblemente en el sitio múltiple de clonaje (MCS).

Obtención del DNA Recombinante

• Fase 1: Preparación del vector y del inserto:
  • Preparación por separado del vector y del inserto.
  • Digestión con las enzimas de restricción seleccionadas.
• Fase 2: Unión de los fragmentos de DNA:
  • Mezcla del inserto y el vector digerido.
  • Ligación gracias a la DNA ligasa.
• Fase 3: Tratamiento con Fosfatasa Alcalina: Tratamiento del vector digerido para minimizar el vector religado.

Introducción del DNA en la Célula Hospedero

• Métodos de Introducción:
  • Transformación: A través de la membrana bacteriana se pasa DNA exógeno.
  • Conjugación: Forma natural de transferencia horizontal de material genético entre bacterias.
  • Transducción: Introducción de DNA exógeno a una célula mediante un virus.
  • Electroporación: Introducción de DNA exógeno en la célula hospedera mediante un pulso eléctrico.

Identificación de los Recombinantes

• Métodos de Identificación:
  • Análisis mediante restricción y electroforesis: Método más común, consiste en realizar digestiones con enzimas de restricción y analizar fragmentos mediante electroforesis en geles de agarosa.
  • Técnicas de Hibridación: Utilizan sondas específicas para detectar el inserto deseado.
  • Inactivación Insercional: Inactivación de un gen que confiere resistencia a antibióticos.
  • α-Complementación: Utiliza el fragmento α de la β-galactosidasa para detectar clones con el vector religado.

Librerías Genómicas

• Definición: Colecciones de clones que incluyen todo el DNA genómico de un organismo dado.
• Cálculo de número de clones necesarios: Depende del tamaño del genoma y el tamaño del inserto.