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Questions and Answers
¿Qué sucede una vez que el genoma del fago se inserta en el cromosoma bacteriano?
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El vector de inserción λgt10 puede insertar fragmentos de hasta 10kb de ADN.
El vector de inserción λgt10 puede insertar fragmentos de hasta 10kb de ADN.
True
¿Qué enzima cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre dos moléculas de ADN? DNA ________.
¿Qué enzima cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre dos moléculas de ADN? DNA ________.
ligasa
Relaciona los tipos de vectores con su descripción:
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¿Cuáles son características de crecimiento de la cepa Coli (Cepa K12)?
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¿Qué método se utiliza para la introducción de DNA exógeno en una célula mediante un virus?
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La electroporación utiliza un pulso eléctrico para introducir DNA exógeno en una célula hospedera.
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La _____ de DNA permite evaluar la preparación de las cepas antes de la transformación.
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¿Cuál es el elemento principal del clonaje que contiene el gen o secuencia de DNA de interés?
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¿Qué etapa del clonaje implica la purificación del plásmido y la obtención de suficiente cantidad de inserto mediante PCR?
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Los vectores de expresión se utilizan para la expresión de proteínas recombinantes, ¿Verdadero o falso?
Los vectores de expresión se utilizan para la expresión de proteínas recombinantes, ¿Verdadero o falso?
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Los plásmidos pueden insertar hasta 15kb de DNA y son capaces de controlar su propia ______.
Los plásmidos pueden insertar hasta 15kb de DNA y son capaces de controlar su propia ______.
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Relaciona los tipos de vectores con su descripción apropiada:
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¿Cómo se dividen los genomas para la obtención de clones?
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¿En qué tipo de vectores es más fácil obtener una librería genómica de un humano?
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¿Cómo se calcula el número de clones necesarios para obtener un valor de probabilidad (P) de clonar una secuencia en particular?
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¿Qué tipo de enzima se utiliza para la fragmentación del DNA?
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¿Qué método se utiliza para separar los fragmentos de DNA en la técnica de clonación?
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Study Notes
Clonaje Molecular
- Creación de copias idénticas de una secuencia de DNA en un vector.
- Elementos principales del clonaje:
- Inserto: Gen o secuencia de DNA de interés, puede provenir del mismo organismo del vector o de otro.
- Vector: Molécula de DNA donde se introduce el inserto, comúnmente plasmídico.
Esquema General del Clonaje
- El vector es un plásmido, el inserto se obtiene a partir de otra molécula de DNA.
- Se combina el inserto y el vector para formar una nueva molécula de DNA.
- Se introduce en una célula bacteriana para su amplificación in vivo.
Etapas del Clonaje
- Diseño de estrategia de clonaje:
- Selección del inserto y el vector.
- Selección del tipo de clonaje y enzimas de restricción.
- Obtención de la molécula de DNA recombinante:
- Purificación del plásmido (vector).
- Obtención de suficiente cantidad de inserto mediante PCR.
- Digestión del inserto y el vector por enzimas de restricción.
- Introducción de los productos de ligación en la célula hospedera.
- Crecimiento de las células transformadas en medio selectivo.
- Identificación de los clones recombinantes.
Estrategia de Clonaje
- El proceso de clonaje se basa en el uso de enzimas de restricción en el vector y el inserto.
- Diseño de la estrategia de clonaje:
- Selección del inserto y el vector.
- Selección del tipo de clonaje y enzimas de restricción.
- Selección del vector:
- Origen de replicación.
- Marcador de selección.
- Sitios de reconocimiento para enzimas de restricción.
Vectores
- Tipos de vectores:
- Plásmidos: Son los más utilizados, pueden insertar hasta 15kb de DNA, tienen entre 2 y 500 copias.
- Vectores de clonaje: Contienen sitios de restricción apropiados para insertar un fragmento de DNA.
- Vectores de expresión: Se utilizan para la expresión de proteínas recombinantes.
- Vectores de lanzadera (shuttle): Contienen 2 orígenes de replicación para especies diferentes.
- Características de los vectores:
- Número de copias por célula del vector.
- Presencia de un polylinker complejo.
- Promotor.
- Primers de PCR y/o secuenciación.
- Marcador.
Bacteriófagos
- Virus que infectan bacterias.
- Complejos de ácido nucleico-proteína.
- Pueden presentar dos ciclos de vida: Clico lítico y Ciclo lisogénico.
- Familias más usadas en biología molecular:
- M13: Vectores derivados se usan para secuenciación, mutagénesis dirigida y Phage Display.
- Fago λ: Vectores derivados se usan para clonaje, expresión y genotecas.
Vectores Derivados de Fago λ
- Vectores de inserción: Insertar hasta 10kb de DNA.
- Vectores de reemplazamiento: Inserto máx de 20kb de DNA.
- Cósmidos: Vectores híbridos que combinan características de plásmidos y bacteriófagos.### Vectores de Clonaje
- Fagémidos: Vectores híbridos entre un plásmido y el bacteriófago M13, utilizados para preparar DNA de cadena sencilla a partir del origen de replicación de M13.
- Cromosomas Artificiales (BAC): Tipo especial de plásmido con un inserto entre 100.000 - 300.000 pb, con un bajo número de copias (una o dos).
- Vectores tipo YAC (Yeast Artificial Chromosomes): Provienen de levaduras, contienen todos los elementos necesarios para su mantenimiento en el núcleo de la levadura, y pueden contener insertos de hasta 1-2 Mb.
Clonaje
-
Tipos de Clonaje:
- No direccional: Extremos romos, enzima de restricción única, extremos cohesivos generados por enzimas compatibles.
- Direccional: Extremos cohesivos generados por enzimas no compatibles, extremo romo/extremo cohesivo.
- Selección de Enzimas de Restricción: Deben cortar solo una vez el vector, preferiblemente en el sitio múltiple de clonaje (MCS).
Obtención del DNA Recombinante
-
Fase 1: Preparación del vector y del inserto:
- Preparación por separado del vector y del inserto.
- Digestión con las enzimas de restricción seleccionadas.
-
Fase 2: Unión de los fragmentos de DNA:
- Mezcla del inserto y el vector digerido.
- Ligación gracias a la DNA ligasa.
- Fase 3: Tratamiento con Fosfatasa Alcalina: Tratamiento del vector digerido para minimizar el vector religado.
Introducción del DNA en la Célula Hospedero
-
Métodos de Introducción:
- Transformación: A través de la membrana bacteriana se pasa DNA exógeno.
- Conjugación: Forma natural de transferencia horizontal de material genético entre bacterias.
- Transducción: Introducción de DNA exógeno a una célula mediante un virus.
- Electroporación: Introducción de DNA exógeno en la célula hospedera mediante un pulso eléctrico.
Identificación de los Recombinantes
-
Métodos de Identificación:
- Análisis mediante restricción y electroforesis: Método más común, consiste en realizar digestiones con enzimas de restricción y analizar fragmentos mediante electroforesis en geles de agarosa.
- Técnicas de Hibridación: Utilizan sondas específicas para detectar el inserto deseado.
- Inactivación Insercional: Inactivación de un gen que confiere resistencia a antibióticos.
- α-Complementación: Utiliza el fragmento α de la β-galactosidasa para detectar clones con el vector religado.
Librerías Genómicas
- Definición: Colecciones de clones que incluyen todo el DNA genómico de un organismo dado.
- Cálculo de número de clones necesarios: Depende del tamaño del genoma y el tamaño del inserto.
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Description
Aprende sobre los elementos principales del clonaje molecular, como la creación de copias idénticas de una secuencia de DNA en un vector, el inserto y el vector.
