unidad 4

• Cinética enzimática es el estudio cuantitativo de las reacciones catalizadas por enzimas.
• Describe la velocidad de las reacciones enzimáticas y cómo se ven afectadas por diversos factores.
• Estos factores incluyen la concentración de la enzima y el sustrato, el pH, la temperatura y la presencia de inhibidores o activadores.
• La cuantificación de estos factores ayuda a diferenciar y analizar las reacciones enzimáticas.

Reacción enzimática básica

• La reacción enzimática se representa como E + S ⇌ ES → E + P, donde:
  • E es la enzima, S es el sustrato, ES es el complejo enzima-sustrato y P es el producto.
  • Las constantes k1, k-1 y k2 representan las velocidades de reacción en cada paso.

Factores que afectan la cinética enzimática

• Temperatura: Aumenta la energía cinética de las moléculas, lo que puede acelerar la reacción.
  • La temperatura estable para la mayoría de las enzimas se encuentra entre 45-55°C.
  • Sin embargo, a temperaturas elevadas, la enzima (siendo una proteína) puede desnaturalizarse, perdiendo su actividad catalítica.
• pH: Cada enzima tiene un pH óptimo en el cual su actividad es máxima, generalmente entre 5 y 9.
  • Valores extremos de pH pueden desnaturalizar la enzima.
• Concentración del sustrato: A medida que la concentración del sustrato aumenta, la velocidad de la reacción (V) se incrementa hasta alcanzar una Vmáx, donde la enzima está saturada.

Relación entre la velocidad de reacción y la concentración de sustrato

• A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de reacción aumenta casi linealmente con el aumento de la concentración del sustrato.
• A altas concentraciones de sustrato, la velocidad de reacción se acerca a un valor máximo (Vmáx) donde la enzima está saturada.

Conceptos clave y ecuaciones

• Vmáx: Es la velocidad máxima de reacción cuando la enzima está saturada con el sustrato.
• Constante de Michaelis (Km): Es la concentración de sustrato necesaria para obtener la mitad de la velocidad máxima de la reacción.
• La afinidad entre el sustrato y la enzima: Una enzima con alta afinidad se saturará más rápido y alcanzará su Vmáx a una concentración de sustrato más baja, lo que resulta en un Km menor.
• La ecuación de Michaelis-Menten describe la relación entre la velocidad de reacción (V), la Vmáx, la concentración de sustrato [S] y la Km: V = (Vmáx [S]) / (Km + [S]).
• Un estado estacionario se alcanza cuando la velocidad de formación del complejo ES es igual a la velocidad de su descomposición.
• Este principio es fundamental para derivar la ecuación de Michaelis-Menten.

Relevancia clínica: Hipersensibilidad al alcohol

• La hipersensibilidad al alcohol puede ocurrir debido a la acumulación de Acetaldehído en el cuerpo.
• La deficiencia de la enzima Acetaldehído deshidrogenasa puede deberse a dos formas, Km baja y Km elevada.
• Las personas con la forma de Km bajo tendrán una mayor afinidad por el acetaldehído, lo que provocará su acumulación y causará vasodilatación, taquicardia y enrojecimiento facial.

Taller: Tipos de regulación enzimática

• Cantidad de enzimas: Regulación por inductores, correpresores y ubiquitinación.
• Modulación alostérica: Inhibición por producto, retroalimentación, encrucijada metabólica, homotropismo y heterotropismo.
• Modificación covalente: Metilación, ADP-ribosilación, acetilación, modificaciones lipídicas y fosforilación/desfosforilación.
• Zimógenos: Precursores enzimáticos inactivos que requieren activación.

Inmovilización de enzimas

• Las enzimas en solución ofrecen métodos excelentes, selectivos y sensibles para la determinación de sustratos, activadores e inhibidores.

• Las enzimas en solución son solubles en medio acuoso, no pueden reutilizarse y tienen estabilidad limitada.

• Preparación de disoluciones con frecuencia.

• La inmovilización de enzimas es el proceso por el que se confina la enzima en un soporte adecuado para obtener una forma insoluble de la misma que retiene su actividad catalítica.

• La inmovilización de enzimas presenta la posibilidad de reutilizar la enzima y aumenta la estabilidad del preparado.

Métodos de inmovilización de enzimas

• Retención fisica
  • Adsorción
  • Atrapamiento o inclusión
• Inmovilización química
  • Unión covalente
  • Entrecruzamiento

Inmovilización por adsorción

• Se produce por interacción física, no específica (puentes de hidrógeno interacciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.
  • Es el método más sencillo
  • De aplicación general
  • Coste moderado
  • Estabilidad limitada, se requiere un control riguroso de las condiciones de trabajo para evitar pérdidas de enzima por desorción.
• Soporte: Alúmina, carbón activo, vidrio o resinas cambiadoras.

Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa

• Se produce por la formación de un polímero altamente entrecruzado en presencia de la enzima.
  • Se requiere controlar las condiciones de polimerización para que no se produzcan alteraciones en la molécula enzimática
  • Puede perder proteína lentamente
  • Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas
  • De aplicación general Tipos de soportes: Gel de poliacrilamida o polímeros conductores

Métodos químicos no polimerizantes- unión covalente

• Se produce por la formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soporte pero no entre las moléculas de enzima.
  • El tipo de soporte determina la química de la inmovilización
• Activación para obtener grupos funcionales reactivos. Soporte:
  • Poliacrilamida (-CONH₂)
  • Carboxymetilcelulosa (-COOH)
  • Poliestireno, nylon (-NH₂)
  • Celulosa, agarosa, sephadex (-OH)
  • Vidrio poroso (-Si(OH)₃)
• Unión a través de las cadenas lateralesde los aminoácidos de la secuencia polipeptidica de la proteína:
  • Lisina (-NH₂)
  • Cisteína (-SH)
  • Tirosina (-OH-Ph)
  • Serina (-OH)
  • Aspartato o Glutamato (-COOH)
  • Histidina (-Nimidazol)
• Se debe asegurar que el centro activo de la enzima no es afectado por los reactivos empleados en el proceso.
  • Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidor competitivo durante el proceso de inmovilización.

Entrecruzamiento

• Se produce por la formación de enlaces covalentes intermoleculares (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte
  • Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura
  • Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el acceso del sustrato al centro activo, conllevando a Pérdidas de actividad tras la inmovilización altas
• Se emplea Reactivos bifuncionales más utilizados.
  • Glutaraldehido
  • Diazobenzidina
  • Hexametileno-bis(iodoacetamida)
  • Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato