Chimie: Vitesse de Réaction Enzymatique

Biochimie L1-S2 U.E. Biochimie 2, Licence Sciences Biomédicales, Université Paris Cité, Cours d'Enzymologie 2 - Cinétique Enzymmatique

• Le cours porte sur la cinétique enzymatique, qui étudie les caractéristiques cinétiques des enzymes et décrit les mécanismes des réactions biochimiques catalysées par les enzymes.
• L'étude de la vitesse des réactions catalysées est menée en fonction de paramètres comme la concentration de substrat initial et la présence d'effecteurs.
• Les objectifs d'apprentissage incluent la définition des hypothèses et des conditions d'application du modèle de Michaelis-Menten, la connaissance de l'équation de Michaelis-Menten, la définition des notions de période initiale, $V_i$, $V_{max}$, $K_M$, constante de dissociation, constante d'affinité, constante catalytique, et constante de spécificité.
• Déterminer si une enzyme est michaelienne et déterminer expérimentalement les paramètres cinétiques d'une enzyme michaelienne par une méthode graphique.
• L'analyse des effets de la température et du pH sur l'activité d'une enzyme est un autre point important du cours.

Plan du Cours

• Introduction à la cinétique enzymatique
• Vitesse, ordre et molécularité d'une réaction
• Évolution de la vitesse $v$ en fonction de $[S]$
• Démonstration de l'équation de Michaelis-Menten
• Signification des paramètres cinétiques ($V_{max}$, $K_M$)
• Détermination expérimentale des paramètres cinétiques
• Dosage du substrat ou de l'enzyme
• Influence du pH et de la température

Notion de Vitesse Instantanée

• La vitesse instantanée ($v$) d'une réaction rend compte de la quantité de produit ($P$) apparue ou de substrat ($S$) disparue par unité de temps à un instant donné.
• $v = \frac{d[P]}{dt} = \frac{-d[S]}{dt}$

Mesure de la Vitesse Initiale

• La vitesse initiale ($V_i$ ou $V_0$) d'une réaction correspond à la pente de la tangente à la courbe [P] = f(t) à t = 0 (origine).
• $V_i = V_0 = \frac{d[P]}{dt}|{t=0} = -\frac{d[S]}{dt}|{t=0}$

Méthode de Mesure de la Vitesse Initiale : Spectrophotométrie

• On utilise la spectrophotométrie pour suivre les réactions biochimiques de conversion du substrat en produit.
• La substance doit absorber une longueur d'onde particulière ($λ$).
• Par exemple, le para-nitro-phénol (produit par la phosphatase acide) absorbe à une longueur d'onde de 410 nm.
• La mesure de l'absorbance au temps t permet de suivre l'évolution de la transformation.

Spectrophotométrie et Loi de Beer-Lambert

• La loi de Beer-Lambert décrit la relation entre l'absorbance ($Aλ$) d'une solution, sa longueur de trajet optique (l), son coefficient d'extinction molaire ($ε_λ$, en mol⁻¹.L.cm⁻¹), et sa concentration ($C$).
• $Aλ = ελ \times l \times C$

Notion de vitesse d'une réaction

• La vitesse d'une réaction ($v$) est définie par la variation de la concentration d'un réactif ou d'un produit en fonction du temps.
  • $v = -\frac{1}{a} \frac{d[A]}{dt} = -\frac{1}{b}\frac{d[B]}{dt} = \frac{1}{c}\frac{d[C]}{dt} = \frac{1}{d}\frac{d[D]}{dt}$.

Equation de vitesse & notion d'ordre

• L'ordre d'une réaction est un indice qui représente le nombre de termes de concentration dans l'équation de vitesse.
  • Exemple: Si la réaction est $aA + bB \rightarrow produit(s)$
    • $v = k [A]^a [B]^b$, où $k$ correspond à la constante de vitesse.

Ordre et Molécularité d'une réaction

• L'ordre d'une réaction décrit sa cinétique. Il correspond au nombre de termes de concentration dans l'équation de vitesse d'une réaction chimique.
• La Molécularité d'une réaction est le nombre de molécules qui interagissent lors de l'étape élémentaire de cette réaction.
• Les réactions élémentaires sont les plus petites et les étapes indivisibles qui composent une réaction plus complexe.
  • Exemple: $A \to produit(s)$, réaction unimoléculaire
  • Exemple: $A + B \to produit(s)$, réaction bimoléculaire

Détermination de l'ordre global d'une réaction

• L'ordre global d'une réaction est la somme des ordres partiels par rapport à chaque réactif.
• La cinétique de la réaction est étudiée en fonction de la concentration de chaque réactif.

Ordre partiel d'une réaction

• L'ordre partiel d'une réaction par rapport à un réactif donné est déterminé expérimentalement en mesurant les vitesses initiales de la réaction à différentes concentrations du réactif.

Analyse de l'évolution de la vitesse initiale en fonction de divers paramètres

• Les données expérimentales pour l'évolution de la vitesse initiale sont analysées en fonction de différents paramètres:
  • Concentration du substrat
  • Température
  • pH
  • Concentration d'inhibiteurs

Deux catégories d'enzymes

• Enzymes michaeliennes : Leur courbe $v_i = f([S])$ est une hyperbole.
• Enzymes allostériques : Leur courbe $v_i = f([S])$ est sigmoïde

Influence de [S] sur la vitesse initiale de la réaction catalysée

• La vitesse initiale varie en fonction de la concentration de substrat ($[S]$)
• La courbe de [P] en fonction du temps présente un plateau à l'équilibre
• La vitesse initiale est maximale ($V_{max}$) lorsque $[S]$ est très grande, signifiant que tous les centres actifs sont saturés.

Modèle de base de la cinétique enzymatique (réaction à un substrat et un produit (Uni-Uni))

• La réaction enzymatique implique des états:
  • E + S $\overset{k_1}{\rightarrow}$ ES
  • ES $\overset{k_2}{\rightarrow}$ P + E

Le complexe ES

• Le complexe ES est un intermédiaire dans la réaction enzymatique.
• [ES] est un intermédiaire stable
• $V_{max}$ = $k_{2}[E]{tot}$ où $[E]{tot}$ est la concentration totale de l'enzyme.

Hypothèse du quasi-équilibre (démonstration de Michaelis et Menten)

• La transformation du substrat en produit ne modifie pas l'équilibre entre E+S et ES.
• $k_1[E][S]=k_{-1}[ES]$
• $K_S = \frac{[E][S]}{[ES]}= \frac{k_{-1}}{k_1}$
• $V_i = \frac{k_2[E]_t[S]}{K_M + [S]}$

Hypothèse de l'état stationnaire (démonstration de Briggs et Haldane)

• La concentration du complexe intermédiaire ES reste constante au cours du temps en régime stationnaire.
• $\frac{d[ES]}{dt} = 0$

Phases de la réaction enzymatique

• Phase pré-stationnaire : formation initiale de ES
• Phase stationnaire : [ES] constante, vitesse maximale obtenue
• Phase post-stationnaire : [S] et [P] non-négligeables

Relations entre les concentrations des différentes formes de l'enzyme et du substrat

• [E]totale = [E] + [ES]
• [S]totale = [S] + [ES]

Hypothèse du quasi-équilibre & Définition de $K_M$

• $K_M= \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}$, constante de Michaelis
• La valeur de $K_M$ est un indice de l'affinité de l'enzyme pour son substrat.

Hypothèse de l'état stationnaire & Définition de $K_M$

• $\frac{d[ES]}{dt}=0$, la concentration de l'intermédiaire ES reste constante.
• $K_M = \frac{k_{-1}+k_2}{k_1}$.
• $K_M = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1} = K_S$

Récapitulatif : les deux démonstrations

• Deux démonstrations donnent la même équation de vitesse, mais les hypothèses sont différentes.

Récapitulatif : conditions d'application du modèle de Michaelis-Menten

• L'étude est effectuée en période initiale.
• [P] est négligeable ($[P] \simeq 0$).
• $k_2$ est négligeable devant $k_{-1}$ et $k_1$.

Equation de vitesse $v_i = f([S])$

• L'équation de Michaelis-Menten donne la relation entre la vitesse initiale $v_i$ et la concentration de substrat $[S]$.
• $V_i = \frac{V_{max}[S]}{K_M + [S]}$, où $K_M$ est la constante de Michaelis et $V_{max}$ la vitesse maximale.

Unités des constantes de vitesse

• Les unités des constantes de vitesse varient en fonction de l'ordre de la réaction.

Comment déterminer si une cinétique enzymatique est michaelienne

• La méthode la plus courante est de comparer les rapports des concentrations de substrat correspondants à des valeurs de vitesse différentes.
• $v_i$ = 0.1 $v_{max}$
• $v_i$ = 0.5 $v_{max}$
• $v_i$ = 0.9 $v_{max}$

Signification du paramètre cinétique $V_{max}$

• $V_{max}$ représente la vitesse maximale de la réaction enzymatique lorsqu'elle est saturée en substrat.
• $V_{max}$ dépend de la concentration de l'enzyme ($[E]_t$).
• $V_{max}$ est proportionnel à $k_2[E]_t$.

Signification du paramètre cinétique $K_M$

• $K_M$ correspond à la concentration de substrat ([S]) qui donne à l'enzyme la moitié de sa vitesse initiale maximale ($V_{max}$).
• La valeur de $K_M$ est un indicateur de l'affinité de l'enzyme pour son substrat; plus $K_M$ est faible, plus l'enzyme a une forte affinité pour son substrat.
• $KM$ est indépendante de la concentration de l'enzyme

Définition de la $K_S$

• $K_S$ est la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat (ES).
• $K_S$ est le rapport de dissociation du complexe ES
• $K_S = \frac{[E][S]}{[ES]}$

Signification du paramètre cinétique $K_M$ (Quasi-équilibre)

• Quand $k_2$ est négligeable devant $k_{-1}$, alors $K_M = K_S$.

Détermination expérimentale de $V_{max}$ et $K_M$ : Représentation de Michaelis-Menten

• La représentation de Michaelis-Menten est une courbe qui représente la vitesse initiale $v_i$ en fonction de la concentration de substrat $[S]$.
• Une autre représentation, la représentation de Lineweaver-Burk, est linéarisé.

Détermination expérimentale de $V_{max}$ et $K_M$ : Représentation de Lineweaver-Burk

• La représentation en double inverse (Lineweaver-Burk) permet une meilleure détermination de $V_{max}$ et $K_M$

Dosage du substrat ou de l'enzyme

• Si [S]<< KM : le dosage s'effectue en régime linéaire, et la Vitesse ($v_i$) est proportionnelle à [S].
• Si [S]>> KM : le dosage s'effectue en régime linéaire, et la Vitesse ($v_i$) est proportionnelle à [E]

Activité catalytique (z)

• L'activité catalytique mesure l'efficacité d'une enzyme.
• Elle correspond au taux de conversion du substrat en produit par unité de volume et par unité de temps.

Unités d'activité catalytique (z)

• L'unité internationale (UI) est l'unité historique pour l'activité des enzymes.
• Le Katal (kat) est l'unité officielle de l'activité enzymatique, qui correspond à la quantité d'enzyme transformant 1 mole de substrat par seconde.

Activité catalytique spécifique (Zsp)

• L'activité catalytique spécifique mesure l'activité d'une enzyme par rapport à la masse de protéines.
• $Z_{sp} = \frac{z}{m_{prot}}$

Activité molaire spécifique (Zm)

• L'activité molaire spécifique Zm est définie comme le nombre de molécules de substrat converties en produit par unité de temps et par mole d'enzyme.
• $Z_m = \frac{z}{n_{enzyme}}$

Constante catalytique (kcat)

• La constante catalytique $k_{cat}$ correspond au nombre de molécules du substrat converties en produit par chaque site actif par unité de temps lorsque l'enzyme est complètement saturée.

Calcul de la $k_{cat}$ à partir de la $V_{max}$

• $k_{cat} = \frac{V_{max}}{[E]_t}$

Constante de spécificité

• La constante de spécificité est le rapport entre les constantes catalytiques et de Michaelis-Menten ($K_{cat}/K_M$).

Caractéristiques de quelques enzymes

• Variabilité des constantes de Michaelis-Menten et catalytiques chez divers enzymes.

Influence du pH

• La plupart des enzymes ont une activité maximale à un pH optimal.
• L'activité enzymatique diminue de part et d'autre de ce pH optimal.
• Le pH optimal dépend de l'enzyme.

Influence de la température

• Augmentation de la vitesse de la réaction (agitation moléculaire)
• Désactivation progressive de l'enzyme (dénaturation thermique)
• Il existe différents types d'enzymes (humains et thermophiles), ayant des températures optimales différentes pour leur activité.