T14Captura de Imágenes Microscópicas

Introducción y Contextualización Práctica

• En estudios científicos sobre lesiones y enfermedades, es esencial capturar y archivar imágenes/videos de lo observado al microscopio
• Los avances tecnológicos, internet y herramientas disponibles permiten el fácil almacenamiento, compresión y transferencia de información

Instrumentos de Captación de Imágenes en el Laboratorio

• Para capturar imágenes a través del microscopio se usan cámaras fotográficas (convencionales y digitales), dispositivos móviles, videocámaras (analógicas y digitales), escáneres o microscopios robotizados
• Se utilizan cámaras fotográficas o smartphones conectados al tercer ocular (trinocular) del microscopio con adaptadores compatibles
• Las videocámaras han sido reemplazadas por cámaras fotográficas digitales que también realizan funciones de vídeo y se conectan a ordenadores para archivar/editar

Cámaras de Video Analógicas

• Se utilizaban para capturar escenas de imágenes y realizar videos al inicio de las nuevas tecnologías
• Las primeras constaban de un sensor CCD analógico (dispositivo de carga acoplada) con células fotoeléctricas para almacenar la imagen
• El video analógico se presenta en pantallas de televisión aplicando una señal mediante líneas a gran velocidad
• La señal de video analógica es eléctrica y obtenida tras analizar la información que llega a la cámara
• Este proceso se denomina barrido progresivo o progressive scanning, abarcando la información luminosa mediante líneas de muestreo casi horizontales

Parámetros Importantes en Cámaras Analógicas

• Intervalo en blanco horizontal: el sensor se apaga y envía una señal en blanco en cada vuelta de retorno.
• Relación de aspecto: es importante la relación horizontal/vertical para captar imágenes
• Sincronización: entre el barrido horizontal y vertical.
• Resolución horizontal: la señal eléctrica varía según la luz y el color de la imagen
• Resolución vertical: se marca un intervalo de separación vertical para transmitir otra información, como subtítulos

Cámaras de Video Digitales

• En los últimos 20 años, ha habido un auge de las tecnologías que ha dado lugar al paso de la cámara de vídeo analógica a la digital
• La cámara digital convierte la señal eléctrica en bits por un proceso de digitalización (separación del tiempo, sampling), representando la amplitud con un valor discreto (conversión analógico-digital, A/D)

Ventajas de Formato Digital

• La señal emitida es menos sensible a interferencias y errores en la transmisión.
• Se puede acceder a la información de las secuencias aleatoriamente.
• Permite una edición e impresión más fácil de imágenes de la secuencia grabada.
• Captura y tratamiento de imágenes al mismo tiempo
• La señal de video digital emite señales de color, su salida es en RGB; genera el efecto aliasing, que hace visible el pixel de los bordes

Formatos y Técnicas de Compresión de Video Digital

• Video CD (VCD): 74 minutos de reproducción, menús, listas de reproducción, movimiento hacia delante y atrás.
• Super video CD: mejor calidad y resolución que el VCD.
• DVD: 133 minutos, sonido surround, audios en ocho idiomas, subtítulos en treinta y dos idiomas
• DV: para grabar videos de alta calidad
• Técnicas de compresión: AVI, MJPEG, H.261, MPEG, Sorenson Video, QuickTime

Cámaras Fotográficas Digitales

• Objetivo:
  • Formado por lentes y diafragma (gradúa la luz al sensor)
  • Se clasifica por distancia focal como angular (<35mm), normal (35-55mm), teleobjetivo (hasta 2000mm), zoom (variable) y macro (distancias cortas)
• Cuerpo de la cámara:
  • Visor: para observar y encuadrar la imagen en la pantalla
  • Pantalla: para ver la imagen antes de fotografiarla, permite ajustar la resolución y el contraste
  • Disparador: dos posiciones para enfocar y fotografiar
  • Sensor: transforma fotones en electrones (efecto fotoeléctrico)
  • Obturador: controla el tiempo de exposición al sensor
  • Procesador: adquiere la información del sensor y la convierte en datos, dependiendo del tipo de formato
  • Fotómetro: gradúa la luza través del diafragma y del obturador (automático en cámaras digitales)
  • Flash: inserta luz adicional, si es necesario
  • Tarjeta de memoria: almacena las fotografías en gigabytes (GB)
  • Batería: alimenta los componentes

Adaptación del Instrumental al Microscopio

• Se adaptan cámaras de video analógicas a microscopios trinoculares mediante la salida superior (tercer tubo) y una rosca C
• Las cámaras fotográficas digitales se conectan a los microscopios mediante una rosca Co (si son de la misma marca) o un dispositivo intermediario propio del instrumento
• Es importante conectar la cámara al ordenador mediante USB para realizar descargas más rápidas
• Se pueden utilizar cámaras fotográficas convencionales posicionando la cámara pegada al ocular del microscopio; lo dificil es ajustar la cámara para enfocar

Escáneres

• Sistemas de microscopía digital: microscopios robotizados (con cámara fotográfica) y escáneres de preparaciones (similares a microscopios, pero sin oculares ni sistema de enfoque con tornillo micrométrico/macrométrico)
• Los escaneres capturan imágenes mediante un escaneado sucesivo
• Un programa informático une las imagenes escaneadas
• Son sistemas cerrados con mecanismo antivibración
• Proceso de digitalización o escaneado:
  • Velocidad de digitalización: depende del tamaño, aumento, tamaño de la cámara, número de planos, etc.
  • Portaobjetos y tamaño máximo de la muestra: generalmente 25 x 75 mm y 1 mm de grosor.
  • Calidad del enfoque: tiempo y movimiento del foco, cálculo de distancia.
  • Digitalización en múltiples planos del eje Z: para muestras tridimensionales.
• Se observan primeramente y fotografían las zonas de interés, luego se ajusta el enfoque para escanear áreas y crear una imagen virtual
• El proceso de ensamblaje final puede ser mecánico o por software

Procesamiento de Imágenes

• Tras realizar una imagen, hay que determinar su formato, tamaño y calidad
• Conceptos clave:
  • Corrección: parámetros de color, iluminación, tamaño, etc.
  • Retoque: cambiar tonalidades, eliminar/reconstruir, añadir elementos
  • Señalizar: datos, entre otros.
• Herramientas de software: Adobe Photoshop, GIMP, Pixlr, Picture It
  • Contienen pincel, clonación, aerógrafo, recorte
  • Filtros que corrigen aberraciones, brillos, contraste, tono, saturación, iluminación, umbral
  • Superposición de capas y unirlos
• Se procesan imágenes de video en programas informáticos como Movie Maker

Almacenamiento en Archivo Digital

• Es importante archivarla y almacenarla en un espacio adecuado y accesible comprimiendo la información
• Formatos de compresión de imágenes:
  • JPEG: más utilizado, pierde información al comprimir.
  • TIFF: menor compresión, mayor calidad; para imprimir imágenes digitales.
  • RAW: archivos de mayor peso, almacena imágenes comprimidas sin perder info.
  • BMP: calidad y tamaño sin pérdida, utilizado por Windows/Ms-Dos.
  • GIF: utilizado en internet, crea archivos en kilobytes
  • PNG: similar al GIF.
  • PSD: para procesar imágenes en Photoshop.
  • PDF: Adobe, para intercambiar archivos en diferentes sistemas operativos.
• Formatos de vídeo con códec:
  • AVI: vídeos digitales.
  • MPEG: compresión de vídeos digitales.
  • MOV: vídeos/audios Apple.
  • WMV: vídeos Microsoft.
  • FLV: vídeos de internet Adobe Flash.

Programas de Software

• Existen programas o softwares de venta libre o específicos para el tratamiento de imágenes
• Adobe Photoshop: editar y transformar imágenes, recortar, eliminar, retocar, combinar y superponer
• Paintnet: editar imágenes Windows, efectos de rotación/zoom en 3D, ajustes de brillo/contraste, saturación y conversión a blanco y negro
• Picture it: retocar con nitidez, permite desenfoque, ajustar tinte y enderezar imágenes; diseñar álbumes, collages, GIFs, folletos, tarjetas y calendarios
• GIMP: editor de mapa de bits, genera fotomontajes, etc, almacena formatos diferentes y crea imágenes animadas
• Pixlr: adicionar filtros, textos, recortar, fotografiar, diseñar infografías, pósteres y reducir ojos rojos

Telepatología Estática

• Rama de la Telemedicina que transmite imágenes de anatomía patológica para consulta, docencia e investigación
  • Telepatología dinámica: transmite videos e imágenes en tiempo real
  • Preparaciones digitales: estudio mediante microscopios digitales o whole slide imaging (WSI)
  • Telepatología estática: intercambio de imágenes fijas (macroscópicas/microscópicas)
• Se ciñe a imágenes de lesiones, por lo cual son archivos grandes;
• Compresión con archivos ZIP
• Otros: LZW, Packbits, JPEG, GIF o PNG (con pérdida de calidad)

Estándares para la Transferencia de Imágenes

• Permite la transferencia de imágenes de cámaras acopladas al microscopio; los se conectan al ordenador para capturar, editar y transmitir
• Para las transferencias, es importante el tipo de imagen
• Con las imágenes digitales, es más fácil transmitir
• Los ordenadores poseen el mismo lenguaje digital que las cámaras digitales
• Al utilizar cámaras analógicas, hay que transformar la información visual en digital usando tarjetas gráficas.

Aspectos Adicionales a Considerar en la Trasferencia de Imágenes

• Es importante añadir elementos a los ordenadores para precisión como memoria RAM y disco duro
• La capacidad de almacenaje de escritura no es igual que la de la información gráfica
• Las fotografías pueden utilizar 1.406 K de memoria
• Un video de noventa minutos utiliza alrededor de 185 Gigabytes

Caso Práctico 1: Ventajas de los Instrumentos de Captación

• Cámaras de video analógicas:
  • Fácil adaptación a microscopios trinoculares/multicabezales para observar campo de visión, encuadre y enfoque
  • Ajustables a televisores para imágenes de calidad
  • Fáciles de conectar con adaptadores en forma de T
  • Sistema económico, actualmente en desuso debido a las cámaras de video digitales
• Cámaras de video digitales:
  • Mayor resolución respecto a las cámaras analógicas; observan imágenes en tiempo real
• Cámaras fotográficas digitales:
  • Mayor resolución, incluso tras comprimir
  • Conexión fácil al ordenador con menor perdida
  • No requieren tarjetas digitalizadoras
  • Capturan imágenes microscópicas de fotografías macroscópicas, radiografías y textos

Caso Práctico 2: Desventajas de los Instrumentos de Captación

• Cámaras de video analógicas:
  • Baja resolución por el sistema PAL (768 x 576)
  • Requieren el uso de tarjetas digitalizadoras
  • En ocasiones, la adaptación al microscopio impide ver la imagen (tubo de la imagen mal acoplado o exceso de claridad)
• Cámaras de video digitales:
  • Necesitan suficiente memoria del ordenador con prestaciones de calidad (velocidad y resolución)
• Cámaras fotográficas digitales:
  • No capturan secuencias de video
  • Coste elevado
  • Adaptación difícil al microscopio
  • Necesitan estar conectadas al monitor para evitar imágenes "a saltos"
• Al igual que las cámaras de vídeo analógico, las de vídeo digital necesitan suficiente memoria en el ordenador y, por tanto, este debe ofrecer unas prestaciones de calidad.

Aplicaciones en el Laboratorio Clínico y Anatomopatológico

• La telepatología estática es de las técnicas más utilizadas para transmitir imágenes de muestras patológicas (lesiones, enfermedades) para su estudio, interpretación y diagnóstico
• Actividades más comunes: estudio muestras quirúrgicas, biopsias, citologías y autopsias (anatomía patológica), citogenética, bancos de sangre, ADN, microbiología y estudios de hematología/orina (patología clínica)
• Las cámaras fotográficas digitales capturan imágenes dentro de la cámara de analógica a digital
• Software específico para la captación y gestión de las imágenes como Aurora mScope, que también asocia los escáneres de preparaciones microscópicas.
• Las más utilizadas son de la marca Nikon y Olympus.
• En ocasiones, la adaptación al microscopio impide ver la imagen (tubo de la imagen mal acoplado o exceso de claridad)

Resumen y Resolución del Caso Práctico

• Las cámaras fotográficas convencionales y digitales, videocámaras y escáneres son adecuados para capturar imágenes del microscopio
• Respecto al almacenaje, se utilizan los formatos: JPEG, RAW, PNG, PDF… para imágenes, y AVI, MPEG, MOV, entre otros, para vídeos
• Los software para el tratamiento de imágenes, como Adobe Photoshop, GIMP y Pixlr, contienen variadas herramientas
• Además, es importante el uso de la telepatología estática para el intercambio de imágenes y estudio de las enfermedades.

Sistemas de Captura de Imágenes en Microscopía

• Coupled charge device (CCD):
  • Fotorreceptor almacena los electrones mediante sensores de silicio
  • Construye una imagen matricial, también denominada mapa de bits de la imagen observada.
• Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS):
  • Dirige la luz el material semiconductor
  • Es menos sensible al sistema de captura anterior
• Photomultiplicator (PMT):
  • Conduce la luz por un fotomultiplicador
  • Se utiliza en microscopía confocal