Biochemie: Restriktionsenzyme und DNA

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Questions and Answers

Was ist eine charakteristische Eigenschaft von Restriktionsenzymen vom Typ II?

Sie erkennen keine spezifischen DNA-Sequenzen.

Sie durchtrennen die DNA an zufälligen Stellen.

Sie schneiden DNA an spezifischen, palindromischen Sequenzen. (correct)

Sie können nur vier Basenpaare erkennen.

Welche der folgenden Abkürzungen ist korrekt für das Restriktionsenzym, das von Escherichia coli stammt?

Eco RI (correct)

Bam HI

Hind III

Sal I

Welche Erkennungssequenz hat das Restriktionsenzym Bam HI?

G‡GATCC (correct)

G‡AATTC

C‡TTAAG

A‡AGCTT

Welche Aussage über die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme ist falsch?

Sie sind immer aus sechs Basenpaaren aufgebaut. Signup and view all the answers

Welches dieser Restriktionsenzyme stammt von Haemophilus influenzae?

Hind III Signup and view all the answers

Wie schützen Bakterien ihre eigene DNA vor Bakteriophagen?

Durch Restriktionsendonukleasen Signup and view all the answers

Was ist die Funktion von DNA-Methyltransferasen in Bakterien?

Methylierung der bakteriellen DNA Signup and view all the answers

Welche Struktur haben Restriktionsenzyme?

Dimere Enzyme Signup and view all the answers

Welche Eigenschaften beschreiben Isoschizomere?

Sie haben identische Erkennungssequenzen Signup and view all the answers

Was ist das Ergebnis der Methylierung der DNA des Wirtes?

Schutz der eigenen DNA vor Restriktionsenzymen Signup and view all the answers

Was beschreibt die Erkennungssequenz GAATTC für Restriktionsenzyme?

Sie ist die spezifische Schnittstelle für ein bestimmtes Enzym Signup and view all the answers

Was passiert, wenn Enzyme mit unterschiedlichen 5'- und 3'-Überständen schneiden?

Sie produzieren keine komplementären Enden Signup and view all the answers

Warum ist die Erkennung von Basenpaaren für Restriktionsenzyme wichtig?

Um spezifisch DNA schneiden zu können Signup and view all the answers

Was beschreibt die Konjugation bei Bakterien?

Die Ausbildung von Plasmabrücken zwischen zwei Zellen zur DNA-Übertragung. Signup and view all the answers

Was ist ein Fertilitätsfaktor?

Ein Gen, das die Fähigkeit zur DNA-Übertragung bestimmt. Signup and view all the answers

Welche Art von Bakterien wird als Hfr-Stamm bezeichnet?

Bakterien mit einem integrierten Fertilitätsfaktor im Genom. Signup and view all the answers

Wie erfolgt der DNA-Transfer während der Konjugation?

Gerichtet vom fruchtbaren Bakterium zum nichtfruchtbaren Bakterium. Signup and view all the answers

Welche der folgenden Aussagen über F+-Bakterien ist korrekt?

Sie besitzen ein Fertilitätsplasmid und sind in der Lage, DNA zu übertragen. Signup and view all the answers

Was ist die Hauptfunktion von Klonierungsplasmiden?

Sie dienen der Ligation und Vermehrung neuer Sequenzen. Signup and view all the answers

Was beschreibt eine Polylinker- oder Multiple Cloning Site (MCS)?

Sie enthält viele Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen. Signup and view all the answers

Was ist Transformation in Bezug auf genetischen Austausch bei Prokaryoten?

Es bezeichnet die Aufnahme von freier DNA durch eine Zelle. Signup and view all the answers

Welche der folgenden Aussagen über Resistenzplasmide ist korrekt?

Sie enthalten Gene, die Resistenz gegen Gifte ermöglichen. Signup and view all the answers

Was ist ein Seletionsmarker?

Ein Element, das die Selektion von Zellen mit rekombinierter DNA ermöglicht. Signup and view all the answers

Was beschreibt die Konjugation bei Prokaryoten?

Den Austausch von DNA zwischen Zellen durch Zell-Zellkontakte. Signup and view all the answers

Welche Rolle spielen die lebenden R-Zellen in Griffiths Experimenten mit Pneumococcus?

Sie sind nicht pathogen und besitzen keine Kapsel. Signup and view all the answers

Was beschreibt Transduktion im Kontext von genetischem Austausch?

Die Übertragung von Genen durch einen Virus. Signup and view all the answers

Welche Rolle spielt die Taq Polymerase in der PCR?

Sie fügt ein A an das 3'-Ende an. Signup and view all the answers

Was charakterisiert Plasmide in Bezug auf die Haupt-DNA?

Sie replizieren sich unabhängig von der Haupt-DNA. Signup and view all the answers

Welche Funktion haben Fruchtbarkeits-(F)Plasmide?

Sie enthalten nur transfer (tra)-Gene. Signup and view all the answers

Welches Element der DNA wird bei der Klonierung häufig hinzugefügt?

Zusätzliche Restriktionsschnittstellen. Signup and view all the answers

Wodurch werden häufig Resistenzgene in Gentechnik-Plasmiden vermittelt?

Durch spezifische Plasmid-Designs. Signup and view all the answers

Was beschreibt die 'TA'-Zwischenklonierung?

Eine Technik, bei der Taq Polymerase ein A an das 3'-Ende anfügt. Signup and view all the answers

Was ist ein häufiges Merkmal von Plasmiden?

Sie sind ringförmige DNA-Moleküle. Signup and view all the answers

Wie erfolgt die Ligation von DNA-Fragmente typischerweise?

Durch enzymatische Verknüpfung. Signup and view all the answers

Was ist das Endprodukt der PCR-Amplifikation?

Ein vergrößertes DNA-Fragment mit spezifischen Stellen. Signup and view all the answers

Was passiert, wenn bei der Klonierung keine zusätzliche Schnittstelle eingefügt wird?

Es wird eine 'TA'-Zwischenklonierung verwendet. Signup and view all the answers

Was ist die Funktion des LacZ-Gens im Lac-Operon?

Es spaltet Laktose in Glukose und Galaktose. Signup and view all the answers

Welche Art von Kolonien entstehen, wenn kein Insert in das LacZ-Gen kloniert ist?

Weiße Kolonien Signup and view all the answers

Welches Molekül kann die Expression von LacZ induzieren?

IPTG Signup and view all the answers

Wie erfolgt die Blau-Weiß-Selektion?

Durch die Fähigkeit von β-Galactosidase, X-Gal abzubauen. Signup and view all the answers

Was ist ein Repressor im Kontext des Lac-Operons?

Ein Protein, das die Transkription verhindert. Signup and view all the answers

Welche Rolle spielt der Operator im Lac-Operon?

Er bindet den Repressor. Signup and view all the answers

Was beschreibt die allgemeine Transduktion?

Die Übertragung von Bakterien-DNA durch einen virulenten Bakteriophagen. Signup and view all the answers

Welche Enzyme werden durch das Lac-Operon kodiert?

β-Galactosidase und Permease Signup and view all the answers

Was ist der Hauptzweck des Lac-Operons?

Regulation des Zuckerabbaus. Signup and view all the answers

Study Notes

Gentechnik - Definition

Gentechnik ist die Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung der genetischen Eigenschaften von Organismen.
"Rekombinante DNA-Technologie" wird verwendet, um Erbinformation gezielt zu verändern oder neu zu kombinieren.

Gentechnik - Anwendungsbereiche

Herstellung von Proteinen für medizinische und technische Anwendungen
Herstellung von transgenen Pflanzen und Tieren
Gendiagnostik
Somatische Gentherapie
CRISPR/Cas9 ist seit 2018 ebenfalls ein Teil der Gentechnik.

CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

CRISPR/Cas-Systeme schützen Bakterien und Archaeen vor Viren und Plasmiden.
Sie nutzen crRNAs (CRISPR-RNAs), um fremde Nukleinsäuren gezielt zu deaktivieren.
Die crRNA-Reifung ist ein wichtiger Schritt der CRISPR-Aktivierung.
tracrRNA (activating CRISPR RNA) steuert die crRNA-Reifung durch die Aktivität von RNase III und CRISPR-assoziierten Cas-Proteinen.
Zwei CRISPR/Cas-Loci, CRISPR1 und CRISPR2, wurden in Streptococcus pyogenes entdeckt, wobei CRISPR1 aktiv ist und CRISPR2 nicht.
Fast alle CRISPR-Spacer zeigen Homologie zu prophage Sequenzen.
CRISPR/Cas-Systeme in Streptococcus pyogenes zielen auf phagoartige Gene ab.
Unterschiedliche crRNA Reifungswege lassen auf die Vielfalt der RNA-basierten Immunsysteme schließen.

CRISPR/Cas: Erworbene Immunität von Bakterien

Spacer werden aus fremdem genetischem Material gewonnen und in den CRISPR-Bereich integriert.
Die fremde DNA wird daraufhin gespalten.
Es folgen die Schritte Transkription, Verarbeitung und Interferenz.
Die CRISPR-assoziierten Proteine (Cas) fungieren als Immunabwehr.
Die fremde DNA wird inaktiviert durch Spaltung.

CRISPR/Cas9: Gezieltes Genome Editing in eukaryotischen Zellen

Das Werkzeug zur Genbearbeitung in eukaryotischen Zellen verwendet CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9 ist ein Werkzeug, das die Ziel-DNA schneidet.
Seit 2018 ist die Gentechnik gesetzlich geregelt, Eingriffe in die Keimbahn sind verboten.

Keine Gentechnik ist...

klassische Züchtungsverfahren
Extrakorporale Befruchtung
Übertragen von Embryonen auf Leihmütter
Zellularbiologische Verfahren, wie z.B. die Herstellung von Hybridtieren
Herstellung von Pflanzenhybriden
Embryoteilung und Embryotransfer bei Nutztieren

Werkzeuge der Gentechnologie

Spender-DNA (z.B. ein bestimmtes Gen oder Nukleotidsequenz)
Vektor- oder Plasmid-DNA (als Genfähren)
Restriktionsenzyme (als genetische Scheren)
Ligasen (als genetische Kleber)
DNA-Transfermethoden
Wirtsorganismen

Klonieren

DNA Fragment, Plasmid, rekombiniertes Plasmid, Ligation, Einschleusen in Wirtszelle, Selektion, Klon
Klonieren beinhaltet die Herstellung genetisch identischer Kopien eines DNA-Fragments.

Mikroorganismen in der Gentechnik

Mikroorganismen sind kleine, schnell wachsende Organismen, deren Genome modifiziert werden können.
Sie sind leicht zu kultivieren und eignen sich daher gut für die Gentechnik.
Beispiele für häufig verwendete Mikroorganismen in der Gentechnik sind Escherichia coli und Bacillus subtilis.

Häufig verwendete Klonierungswirte

Escherichia coli (gut etablierte Genetik, viele Stämme zur Verfügung, am besten untersuchter Prokaryot)
Bacillus subtilis (leicht transformierbar, nicht pathogen, produziert Proteine, erleichterte Kultivierung)
Saccharomyces cerevisiae (gut etablierte Genetik, nicht pathogen, kann mRNA und Proteine verarbeiten, ist leicht zu kultivieren)

Restriktionsenzyme

Typen von Restriktionsenzymen: I, II und III
Typ I schneidet DNA an zufälliger Stelle weit weg von Erkennungssequenz, benötigt ATP.
Typ II schneidet DNA innerhalb oder unmittelbar vor Erkennungssequenz, benötigt kein ATP.
Typ III schneidet DNA ca. 20-25 Basenpaare von Erkennungssequenz entfernt, benötigt ATP.
Nomenklatur von Restriktionsenzymen (z.B. EcoRI)
Restriktionsenzyme erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden sie an diesen Stellen.
Palindromisch, 4, 6 oder 8 Basenpaare

Herkunft der Restriktionsenzyme

Bakterien verwenden Restriktionsenzyme, um sich vor viralen Infektionen zu schützen (Bakteriophagen).
Restriktionsenzyme spalten die virale DNA.

Bakterielle DNA Schutz

Bakterien schützen ihre eigene DNA durch Methylierung von DNA-Sequenzen die von Restriktionsenzymen erkannt werden.

Restriktionsenzyme - Struktur

Restriktionsenzyme sind Dimere mit an die DNA angepasster Struktur.

Restriktion - Sticky Ends & Glatte Enden

Sticky Ends: Restriktionsenzyme erzeugen Enden mit überhängenden Basen. Diese Enden können miteinander komplementär verbinden.
Glatte Enden: Erzeugen Enden ohne überhängende Basen, die Komplementarität ist sehr spezifisch.

Isoschizomere

Unterschiedliche Restriktionsenzyme, die dieselbe DNA-Sequenz erkennen und schneiden.
Beispiel: HindIII und Hsul.

Klonieren, kompatible Enden

Lineare DNA Fragmente können in Bakterien nicht vermehrt werden, es müssen kompatible Enden vorliegen.

Klonieren eines Gens

Keine zusätzlichen Restriktionsschnittstellen für Restriktionsenzyme
Wenn kein weiterer Restriktionsschnitt gewünscht wird, dann kann man ein PCR Fragment direkt in einen Vektor einfügen
Häufig werden TA-Zwischenklonierung verwendet.

Ligation

Enzyme verwenden DNA-Ligase verknüpfung von DNA Fragmenten, um komplexe Sequenzen zu bilden.

Plasmide

Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die sich unabhängig vom Chromosom replizieren.
Sie enthalten häufig Resistenzgene und wichtige Merkmale für die Gentechnik, wie z.B. Klonierungsorte, ORIs und Selektionsmarker.
Typen von Plasmiden: Fruchtbarkeits-, Resistenz-, Klonierungs-, Expressionsplasmide

Plasmid zum Klonieren

Der Ursprung der Replikation (ORI) ist die spezifische Sequenz von Nukleotiden, die für den Start der Replikation verantwortlich sind.
Selektionsmarker ermöglichen die Auswahl von Zellen, die die rekombinierte DNA tragen (Transformanten).
Polylinker oder Multiple Cloning Site (MCS) ist ein Bereich, der viele Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen enthält.

Bildung eines rekombinanten Vektors

Vektoren sind DNA-Moleküle, die die Einfügung fremder DNA ermöglichen.
Rekombinantes Plasmid entsteht, wenn fremd DNA mit dem Plasmid rekombiniert wird.
Klebrige Enden sind in einem rekombinierten Plasmid essentiell

Genetischer Austausch bei Prokaryoten

Transformation (Aufnahme freier DNA)
Konjugation (Übertragung von DNA zwischen Zellen)
Transduktion (Übertragung von Genen durch ein Virus)

Transformation

Aufnahme von fremder DNA durch eine Zelle
Griffiths Experimente mit Pneumococcus (bakterielle Genetik)
Prozesse der Transformation (Kompetenz, DNA Zugabe, Inkubation, Hitzeschock, Kultivierung, Selektion)
Die Fähigkeit von Zellen, fremde DNA aufzunehmen.

Blau-Weiß Selektion: Das Operon-Model

Funktionseinheit für DNA von Prokaryoten
Modell für Genexpressionsregulation
Kodiert für Proteine, die den Laktoseabbau ermöglichen
Methode zur Identifizierung von Zellen die das gewünschte Gen tragen

PCR (Polymerase Kettenreaktion)

In-vitro-Methode zur Vervielfältigung von DNA-Sequenzen
Typischer Reaktionsansatz beinhaltet DNA Template, Primer, Desoxynukleotide (dNTPs), Puffer, H₂O und DNA Polymerase
Schritte der PCR: Denaturierung, Hybridisierung, Polymerisierung
Die PCR ermöglicht die Vervielfältigung von spezifischen DNA-Abschnitten.
Nachweis der PCR-Reaktion durch Elektrophorese
- Elektrophorese ermöglicht die Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe.

Elektrophorese

Verfahren zur Trennung von Molekülen basierend auf ihrer Größe und Ladung.
DNA Fragmente werden nach Größe getrennt (Kathode, Anode)
Gelvisualisierung durch UV-Licht, um DNA Fragmente zu identifizieren.

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Description

Dieses Quiz behandelt die Eigenschaften und Funktionen von Restriktionsenzymen, insbesondere vom Typ II. Fragen umfassen ihre Erkennungssequenzen, Herkunft und Schutzmechanismen der bakteriellen DNA. Ideal für Studierende der Biochemie, Molekularbiologie oder genetischen Forschung.