Biochemie: Restriktionsenzyme und DNA

Gentechnik - Definition

• Gentechnik ist die Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung der genetischen Eigenschaften von Organismen.
• "Rekombinante DNA-Technologie" wird verwendet, um Erbinformation gezielt zu verändern oder neu zu kombinieren.

Gentechnik - Anwendungsbereiche

• Herstellung von Proteinen für medizinische und technische Anwendungen
• Herstellung von transgenen Pflanzen und Tieren
• Gendiagnostik
• Somatische Gentherapie
• CRISPR/Cas9 ist seit 2018 ebenfalls ein Teil der Gentechnik.

CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

• CRISPR/Cas-Systeme schützen Bakterien und Archaeen vor Viren und Plasmiden.
• Sie nutzen crRNAs (CRISPR-RNAs), um fremde Nukleinsäuren gezielt zu deaktivieren.
• Die crRNA-Reifung ist ein wichtiger Schritt der CRISPR-Aktivierung.
• tracrRNA (activating CRISPR RNA) steuert die crRNA-Reifung durch die Aktivität von RNase III und CRISPR-assoziierten Cas-Proteinen.
• Zwei CRISPR/Cas-Loci, CRISPR1 und CRISPR2, wurden in Streptococcus pyogenes entdeckt, wobei CRISPR1 aktiv ist und CRISPR2 nicht.
• Fast alle CRISPR-Spacer zeigen Homologie zu prophage Sequenzen.
• CRISPR/Cas-Systeme in Streptococcus pyogenes zielen auf phagoartige Gene ab.
• Unterschiedliche crRNA Reifungswege lassen auf die Vielfalt der RNA-basierten Immunsysteme schließen.

CRISPR/Cas: Erworbene Immunität von Bakterien

• Spacer werden aus fremdem genetischem Material gewonnen und in den CRISPR-Bereich integriert.
• Die fremde DNA wird daraufhin gespalten.
• Es folgen die Schritte Transkription, Verarbeitung und Interferenz.
• Die CRISPR-assoziierten Proteine (Cas) fungieren als Immunabwehr.
• Die fremde DNA wird inaktiviert durch Spaltung.

CRISPR/Cas9: Gezieltes Genome Editing in eukaryotischen Zellen

• Das Werkzeug zur Genbearbeitung in eukaryotischen Zellen verwendet CRISPR/Cas9
• CRISPR/Cas9 ist ein Werkzeug, das die Ziel-DNA schneidet.
• Seit 2018 ist die Gentechnik gesetzlich geregelt, Eingriffe in die Keimbahn sind verboten.

Keine Gentechnik ist...

• klassische Züchtungsverfahren
• Extrakorporale Befruchtung
• Übertragen von Embryonen auf Leihmütter
• Zellularbiologische Verfahren, wie z.B. die Herstellung von Hybridtieren
• Herstellung von Pflanzenhybriden
• Embryoteilung und Embryotransfer bei Nutztieren

Werkzeuge der Gentechnologie

• Spender-DNA (z.B. ein bestimmtes Gen oder Nukleotidsequenz)
• Vektor- oder Plasmid-DNA (als Genfähren)
• Restriktionsenzyme (als genetische Scheren)
• Ligasen (als genetische Kleber)
• DNA-Transfermethoden
• Wirtsorganismen

Klonieren

• DNA Fragment, Plasmid, rekombiniertes Plasmid, Ligation, Einschleusen in Wirtszelle, Selektion, Klon
• Klonieren beinhaltet die Herstellung genetisch identischer Kopien eines DNA-Fragments.

Mikroorganismen in der Gentechnik

• Mikroorganismen sind kleine, schnell wachsende Organismen, deren Genome modifiziert werden können.
• Sie sind leicht zu kultivieren und eignen sich daher gut für die Gentechnik.
• Beispiele für häufig verwendete Mikroorganismen in der Gentechnik sind Escherichia coli und Bacillus subtilis.

Häufig verwendete Klonierungswirte

• Escherichia coli (gut etablierte Genetik, viele Stämme zur Verfügung, am besten untersuchter Prokaryot)
• Bacillus subtilis (leicht transformierbar, nicht pathogen, produziert Proteine, erleichterte Kultivierung)
• Saccharomyces cerevisiae (gut etablierte Genetik, nicht pathogen, kann mRNA und Proteine verarbeiten, ist leicht zu kultivieren)

Restriktionsenzyme

• Typen von Restriktionsenzymen: I, II und III
• Typ I schneidet DNA an zufälliger Stelle weit weg von Erkennungssequenz, benötigt ATP.
• Typ II schneidet DNA innerhalb oder unmittelbar vor Erkennungssequenz, benötigt kein ATP.
• Typ III schneidet DNA ca. 20-25 Basenpaare von Erkennungssequenz entfernt, benötigt ATP.
• Nomenklatur von Restriktionsenzymen (z.B. EcoRI)
• Restriktionsenzyme erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden sie an diesen Stellen.
• Palindromisch, 4, 6 oder 8 Basenpaare

Herkunft der Restriktionsenzyme

• Bakterien verwenden Restriktionsenzyme, um sich vor viralen Infektionen zu schützen (Bakteriophagen).
• Restriktionsenzyme spalten die virale DNA.

Bakterielle DNA Schutz

• Bakterien schützen ihre eigene DNA durch Methylierung von DNA-Sequenzen die von Restriktionsenzymen erkannt werden.

Restriktionsenzyme - Struktur

• Restriktionsenzyme sind Dimere mit an die DNA angepasster Struktur.

Restriktion - Sticky Ends & Glatte Enden

• Sticky Ends: Restriktionsenzyme erzeugen Enden mit überhängenden Basen. Diese Enden können miteinander komplementär verbinden.
• Glatte Enden: Erzeugen Enden ohne überhängende Basen, die Komplementarität ist sehr spezifisch.

Isoschizomere

• Unterschiedliche Restriktionsenzyme, die dieselbe DNA-Sequenz erkennen und schneiden.
• Beispiel: HindIII und Hsul.

Klonieren, kompatible Enden

• Lineare DNA Fragmente können in Bakterien nicht vermehrt werden, es müssen kompatible Enden vorliegen.

Klonieren eines Gens

• Keine zusätzlichen Restriktionsschnittstellen für Restriktionsenzyme
• Wenn kein weiterer Restriktionsschnitt gewünscht wird, dann kann man ein PCR Fragment direkt in einen Vektor einfügen
• Häufig werden TA-Zwischenklonierung verwendet.

Ligation

• Enzyme verwenden DNA-Ligase verknüpfung von DNA Fragmenten, um komplexe Sequenzen zu bilden.

Plasmide

• Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die sich unabhängig vom Chromosom replizieren.
• Sie enthalten häufig Resistenzgene und wichtige Merkmale für die Gentechnik, wie z.B. Klonierungsorte, ORIs und Selektionsmarker.
• Typen von Plasmiden: Fruchtbarkeits-, Resistenz-, Klonierungs-, Expressionsplasmide

Plasmid zum Klonieren

• Der Ursprung der Replikation (ORI) ist die spezifische Sequenz von Nukleotiden, die für den Start der Replikation verantwortlich sind.
• Selektionsmarker ermöglichen die Auswahl von Zellen, die die rekombinierte DNA tragen (Transformanten).
• Polylinker oder Multiple Cloning Site (MCS) ist ein Bereich, der viele Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen enthält.

Bildung eines rekombinanten Vektors

• Vektoren sind DNA-Moleküle, die die Einfügung fremder DNA ermöglichen.
• Rekombinantes Plasmid entsteht, wenn fremd DNA mit dem Plasmid rekombiniert wird.
• Klebrige Enden sind in einem rekombinierten Plasmid essentiell

Genetischer Austausch bei Prokaryoten

• Transformation (Aufnahme freier DNA)
• Konjugation (Übertragung von DNA zwischen Zellen)
• Transduktion (Übertragung von Genen durch ein Virus)

Transformation

• Aufnahme von fremder DNA durch eine Zelle
• Griffiths Experimente mit Pneumococcus (bakterielle Genetik)
• Prozesse der Transformation (Kompetenz, DNA Zugabe, Inkubation, Hitzeschock, Kultivierung, Selektion)
• Die Fähigkeit von Zellen, fremde DNA aufzunehmen.

Blau-Weiß Selektion: Das Operon-Model

• Funktionseinheit für DNA von Prokaryoten
• Modell für Genexpressionsregulation
• Kodiert für Proteine, die den Laktoseabbau ermöglichen
• Methode zur Identifizierung von Zellen die das gewünschte Gen tragen

PCR (Polymerase Kettenreaktion)

• In-vitro-Methode zur Vervielfältigung von DNA-Sequenzen

• Typischer Reaktionsansatz beinhaltet DNA Template, Primer, Desoxynukleotide (dNTPs), Puffer, H₂O und DNA Polymerase

• Schritte der PCR: Denaturierung, Hybridisierung, Polymerisierung

• Die PCR ermöglicht die Vervielfältigung von spezifischen DNA-Abschnitten.

• Nachweis der PCR-Reaktion durch Elektrophorese

  • Elektrophorese ermöglicht die Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe.

Elektrophorese

• Verfahren zur Trennung von Molekülen basierend auf ihrer Größe und Ladung.
• DNA Fragmente werden nach Größe getrennt (Kathode, Anode)
• Gelvisualisierung durch UV-Licht, um DNA Fragmente zu identifizieren.