Ácidos Nucleicos TEST Mixto

Características Estructurales y Funcionales

• Los ácidos nucleicos son macromoléculas poliméricas que almacenan, transmiten y expresan la información genética.
• Estas biomoléculas se encuentran en todos los seres vivos.

Ácido Desoxirribonucleico (ADN)

• Constituye el depósito de información hereditaria que se transmite a la descendencia.

Ácido Ribonucleico (ARN)

• Se encarga de la expresión de la información mediante la síntesis de proteínas.
• Una serie de enzimas específicas participan en este flujo de información.

Estructura y Composición Química

• El ADN y el ARN se diferencian en estructura y composición química.
• Ambos están formados por nucleótidos.

Nucleótidos

• Son las unidades estructurales repetitivas en los ácidos nucleicos.
• Intervienen en el mecanismo molecular de transmisión de información genética.
• Están constituidos por una base nitrogenada, una pentosa (glúcido de cinco átomos de carbono) y una molécula de ácido fosfórico en forma de anión fosfato.
• Tanto la base nitrogenada como el grupo fosfato están unidos a la pentosa.

Base Nitrogenada

• Son compuestos heterocíclicos planos de carbono y nitrógeno con diferentes radicales.
• Hay dos tipos de bases nitrogenadas: púricas y pirimidínicas

Bases Púricas

• Derivan de la purina y son la adenina (A) y la guanina (G).

Bases Pirimidínicas

• Derivan de la pirimidina y son la Citosina (C), la Timina (T) y el Uracilo (U).
• La adenina, la guanina y la citosina están presentes tanto en el ADN como en el ARN.
• La timina solo se encuentra en el ADN, y el uracilo, solo en el ARN.

Pentosa

• Es un glúcido de cinco átomos de carbono que forma parte de la estructura de un nucleótido.
• Hay dos tipos de pentosas: D-ribosa y 2-desoxi-D-ribosa

D-ribosa

• En los nucleótidos que componen el ARN

2-desoxi-D-ribosa

• En los nucleótidos que componen el ADN

Ácido Fosfórico

• Se encuentra en los nucleótidos en forma de anión fosfato o grupo fosfato (fórmula PO43-).
• El grupo fosfático tiene una estructura tetraédrica, con el átomo de fósforo en posición central y los cuatro átomos de oxígeno en los vértices del tetraedro.
• Tiene carga negativa y es el responsable de que los ácidos nucleicos también tengan carga negativa.

Nucleósidos

• La unión de una base nitrogenada con una pentosa constituye un nucleósido.
• La combinación de una base nitrogenada con D-ribosa da lugar a ribonucleósidos y con 2-desoxi-D-ribosa da lugar a desoxirribonucleósidos.
• La unión se realiza mediante un enlace N-glucosídico entre el carbono C1´ de la pentosa y el nitrógeno N9 de una base púrica o el nitrógeno N1 de una base pirimidínica, con pérdida de molécula de agua.
• Los nucleósidos se nombran añadiendo a la base nitrogenada:
  • La terminación -osina en el caso de las bases púricas
  • La terminación -idina en el caso de las bases pirimidínicas.
  • Si la pentosa es la desoxirribosa, se añade el prefijo desoxi- al nombre.

Nucleótidos, Oligonucleótidos, y Polinucleótidos

• La unión de un nucleósido con una molécula de ácido fosfórico en forma de anión fosfato mediante un enlace éster origina un nucleótido.
• El enlace se origina entre el carbono C5′ de la pentosa y el ácido fosfórico, con pérdida de una molécula de agua.
• Los nucleótidos que contienen 2-desoxi-D-ribosa se denominan desoxirribonucleótidos y son los integrantes del ADN.
• Los nucleótidos que contienen D-ribosa se denominan ribonucleótidos y son los integrantes del ARN.
• Los nucleótidos se nombran eliminando la a final del nombre del nucleósido del que proceden y añadiendo la terminación 5′-fosfato.
• Los nucleótidos se unen entre sí por el grupo fosfato mediante un enlace fosfodiéster entre el carbono C5' de un nucleótido y el carbono C3´ del siguiente nucleótido, dando lugar a las cadenas lineales polinucleótidas, que constituyen los polinucleótidos o ácidos nucleicos.
• Cuando el número de nucleótidos que integran la cadena no es muy grande, se habla de oligonucleótidos.
• Toda cadena de nucleótidos tiene dos extremos libres: el extremo 5′, con un grupo fosfato unido al C5' de la pentosa del primer nucleótido, y el extremo 3′, con un radical hidroxilo (-OH) unido al C3' de la pentosa del último nucleótido.

ADN

• El ácido desoxirribonucleico (ADN) almacena la información genética de un individuo, la transmite a los descendientes y dirige la síntesis de las proteínas.
• En los organismos eucariotas, el ADN se encuentra, principalmente, en el núcleo de las células como parte de los cromosomas, pero también menores cantidades en las mitocondrias y en los cloroplastos
• En los procariotas, la mayor parte del ADN se encuentra en un solo cromosoma y en una menor proporción en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos.
• Algunos virus contienen ADN como material genético.

Estructura del ADN

• El ADN es un polímero de largas cadenas de desoxirribonucleótidos (la pentosa es siempre desoxirribosa) de adenina, guanina, Citosina y Timina (no tiene uracilo).
• La estructura primaria de una molécula de ADN es la secuencia de bases nitrogenadas en el esqueleto de la cadena de desoxinucleótidos.
• Todas las moléculas de ADN bicatenario tienen una característica común la cantidad de adenina es igual a la de timina y la cantidad de citosina es igual a la de guanina.

Principio de Complementariedad

• Cuando algunos nucleótidos se enfrentan, se mantienen unidos mediante puentes de hidrógeno entre los grupos polares de sus bases nitrogenadas.
• Esto solo se produce entre bases nitrogenadas complementarias en función de su tamaño y estructura

Adenina y Timina

• Forman dos puentes de hidrógeno (A=T).

Citosina y Guanina

• Forman tres puentes de hidrógeno (C=G).

Doble Hélice

• La configuración en doble hélice del ADN constituye su estructura secundaria.
• El ADN está formado por dos cadenas de polinucleótidos, que forman una doble hélice alrededor de un eje central.
• Las moléculas de ADN de los seres vivos son bicatenarias (ADNds), es decir, están constituidas por dos cadenas polinucleotídicas.

ARN

• El ácido ribonucleico controla la síntesis de proteínas a partir de la información en el ADN.
• En los organismos eucariotas, se encuentra en el núcleo, citoplasma y en los ribosomas del citoplasma.
• Algunos virus solo contienen ARN, mientras que otros tipos de virus solo contienen ADN.

Estructura Del ARN

• El ARN es un polímero formado por largas cadenas de ribonucleótidos (la pentosa es siempre ribosa) de adenina, guanina, citosina y uracilo (no contiene timina).
• Algunas moléculas de ARN (por ejemplo, los ARN de transferencia) pueden contener pequeñas cantidades de otras bases nitrogenadas, que normalmente son derivados metilados de las cuatro bases mayoritarias.
• El ARN de los seres vivos es monocatenario y lineal, excepto el de algunos virus, como los reovirus, cuyo material genético es ARN bicatenario (ARNds).
• Algunas zonas de la molécula pueden tener secuencias complementarias, de manera que la cadena puede plegarse para formar regiones de doble hélice, denominadas horquillas.
• Si las regiones complementarias están separadas por una secuencia no complementaria, en el extremo de la horquilla se forma un bucle.
• En el ARN, las bases complementarias son:
  • Adenina y uracilo, entre las que se forman dos puentes de hidrógeno (A=U)
  • Citosina y guanina, entre las que se forman tres puentes de hidrógeno (C=G).

Tipos de ARN

• Existen varios tipos, y se pueden clasificar según su estructura y función:

Tipos principales

• ARN mensajero (ARNm): supone entre el 2% y el 5% del ARN total de una célula y está constituido por múltiples moléculas lineales de diferentes tamaños, cada una de las cuales porta la información para la síntesis de una proteína.
• ARN ribosómico (ARNr): es el mayoritario en las células (aproximadamente el 80%) y combinado con proteínas forma los ribosomas, orgánulos citoplasmáticos responsables de la síntesis de proteínas.
• ARN de transferencia (ARNt): transportan los aminoácidos hasta los ribosomas para su incorporación en la cadena proteica que se está sintetizando.

Regulación de la Expresión Génica

• Moléculas pequeñas con secuencias complementarias de regiones específicas de ARNm.
• Algunas son bicatenarias (ARNsi) y otras monocatenarias con regiones complementarias que forman una horquilla (ARNmi).
• Estas moléculas se unen a las regiones complementarias del ARNm y bloquean la traducción a proteína o activan enzimas que degradan el ARNm.

Otros Tipos de ARN

• ARN heterogéneo molecular (ARNhn): mezcla de largas moléculas lineales precursoras del ARNm (pre-ARNm), se encuentra en el núcleo de la célula y tras un proceso de maduración da lugar al ARNm, que sale al citoplasma.
• ARN pequeño nuclear (ARNsn): un conjunto de pequeñas moléculas de ARN que se localiza en el núcleo y se unen a proteínas, dando lugar a ribonucleoproteínas con actividad enzimática, intervienen en la maduración del ARNm.
• ARN pequeño nucleolar (ARNsno): se localiza en el nucléolo y es el precursor de varios ARNr, tiene un coeficiente de sedimentación de 45S y cuando se fragmenta da a lugar a los ARNr 5.8S, 18S y 28S.

Propiedades Físicas

• Las características físicas principales en relación a los métodos de biología molecular.

Desnaturalización de Ácidos Nucleicos

• Está basada en la disociación de cadenas complementarias de ácidos nucleicos encargadas de generar cadenas sencillas de ADN y/o ARN.
• Puede llevarse a cabo a través del calor (94-96 °C en la PCR) o por aumento de pH.
• Para secuencias con uniones G: C, es posible requerir más tiempo o temperatura elevar desnaturalización.

Renaturalización

• Es la unión de dos moléculas de ácido nucleico.
• Se necesita una temperatura de 50-65°C.
• Ciertas sondas o cebadores pueden requerir una temperatura más elevada (70-72°C)
• Un tiempo de renaturalización de un minuto es usual.

Hibridación

• Capacidad de juntar o generar el apareamiento de dos cadenas de ADN, ARN o mixtas, que coproducen ácido nucleico de doble cadena.
• Los ácidos nucleicos se unen mediante parejas complementarias: guanina con citosina, y timina (ADN) o uracilo (ARN) con adenina.
• Esta es la base de los métodos de PCR e hibridación.

Electroforesis

• Está basada en la segregación de moléculas en un campo eléctrico según el peso molecular y la carga eléctrica.
• Se suele llevar a cabo junto al exámen del ADN, el ARN o las proteínas
• Los ácidos nucleicos, productos de PCR o proteínas se ubican en el extremo de un polímero o gel sometido a una diferencia potencial y se segregan.
• Esto permite que moléculas de menor tamaño se alejen más del punto de partida que las de mayor tamaño.

DNasas y RNasas

• Las ribonucleasas (RNasas) y las desoxirribonucleasas (DNasas) son enzimas nucleasas del entorno y que degradan.
• Las RNasas se hidrolizan en ARN, mientras que las DNasas lo hacen en ADN. Alteran e inhiben exámenes moleculares.

Endonucleasas de Restricción

• Son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de ADN bicatenario (entre 4 y 8 pares de bases).
• Producen un corte en la doble cadena en esa secuencia o cerca de ell, fragmentando la molécula
• Las secuencias de ADN específicas que reconocen se denominan dianas de restricción

Tipos de Enzimas de Restricción

• Tres tipos de enzimas de restricción.

Enzimas de Restricción Tipo I

• La enzima reconoce su diana de restricción y efectúa un corte en una región anterior o posterior de la diana a una distancia aleatoria de hasta 1000 pb.
• No generan patrones específicos de fragmentos y no tienen gran utilidad.

Enzimas de Restricción Tipo II

• Reconocen la diana de restricción y cortan puntos específicos, generalmente dentro de la misma diana.
• En consecuencia, estas enzimas generan patrones específicos y reproducibles de fragmentos, ya que siempre que se enfrentan a la misma molécula cortan por los mismos puntos.
• Son herramientas fundamentales en biología molecular.

Enzimas de Restricción Tipo III

• Reconocen dos secuencias invertidas dentro de la misma cadena y cortan fuera de la diana de restricción, pero a una distancia corta (25-30 pb).

Nomenclatura

• Las enzimas de restricción se nombran, normalmente, con tres letras y un número romano.
• Las tres letras se escriben en cursiva y corresponden al nombre científico de la bacteria de la que se han obtenido.
• La primera letra es la inicial del género; las otras dos, las primeras letras de la especie.
• El número romano indica el orden en que se ha aislado la enzima en la misma especie.
• En ocasiones, cuando la enzima se ha aislado de una cepa concreta de una especie bacteriana, se añade una cuarta letra mayúscula que la representa.

Tipos de Corte

• El corte realizado por una enzima de restricción puede ser de dos formas distintas, que se caracterizan por los extremos generados:

Extremos Romos

• El corte se produce en el mismo punto en las dos cadenas, generalmente en el centro de la diana de restricción.

Extremos Cohesivos

• El corte se produce en puntos distintos de ambas cadenas, normalmente en los extremos de la diana de restricción.
• Esto genera en cada extremo sendas regiones monocatenarias cortas y complementarias entre sí.
• Esto hace que sean muy reactivos al poderse adherir a fragmentos de ADN que tengan secuencias de bases complementarias.

Aplicaciones en Biología Molecular

• Dos aplicaciones de las enzimas de restricción son de especial importancia:

Permite Crear Moléculas de ADN Recombinante

• La propiedad de las endonucleasas de restricción de cortar dejando extremos cohesivos o reactivos (regiones monocatenarias cortas de bases desapareadas) es muy útil
• La insulina humana de uso terapéutico es producida en gran escala por bacterias gracias a la tecnología del ADN recombinante.

Permite Obtener Patrones de Restricción

• Conocer el patrón de restricción de una muestra de ADN permite:
  • La identificación de muestras pertenecientes a un mismo individuo.
  • La realización de estudios filogenéticos (relación evolutiva entre organismos)
  • La detección de posibles anomalías en el diagnóstico prenatal
  • La detección de mutaciones (si se produce una mutación que afecta a una diana de restricción, el patrón de restricción que se obtendrá será diferente).

Mutaciones y los Polimorfismos

• Una variación en la secuencia del ADN puede ser heredada o adquirida.
• Estas variaciones no provocan ninguna alteración en el código genético (zonas no codificantes o no varían el aminoácido).
• Estas variaciones no tienen la capacidad de provocar alteraciones graves.

Poimorfismo o SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

• Es la variación de la secuencia de ADN que actúa solo sobre un nucleótido del genoma.
• Los SNPs deben afectar, como mínimo, a un 1% de la sociedad.
• Son los responsables del 90% de las alteraciones genómicas en las personas.
• Se manifiestan en un promedio de 100-300 bases en el genoma.
• Estas variaciones modifican la respuesta de las personas a los fármacos o a la susceptibilidad de contraer enfermedades.

Microsatélites

• Son partes del ADN que no tiene ninguna función (sabida) y son muy variables (polimorfas) entre las personas.
• Son diferentes fragmentos de 1-6 nucleótidos, que pueden medir hasta cien pares de bases.
• Se hallan de forma dispersa por el genoma eucariota.
• Debido a su pequeño tamaño se las conoce como micro-satélites.

Mutaciones

• Son las variaciones que alteran la secuencia base de un gen.

Tipos de Mutaciones

• Mutación cromosómica: modificación estructural de uno o varios cromosomas.
• Mutación puntual: es el cambio de una base por otra en un triplete de nucleótidos (codón), que proviene de la codificación de un aminoácido diferente (missense mutation) o de la producción de un codón de terminación prematura de la síntesis de una proteína (nonsense codon).
• Mutación del marco de lectura: (frameshift mutation) es la inserción o deleción de nucleótidos que provoca una variación en el marco de lectura.

Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

• Se realiza mediante un protocolo técnico continuado, dividido en tres fases:
• Pretratamiento de la muestra
• Extracción de los ácidos nucleicos
• Purificación de los ácidos nucleicos

Pretratamiento de la Muestra

• Los ácidos nucleicos se pueden obtener de cualquier muestra biológica.
• La sangre, las biopsias o los tejidos son los sitios más seguros.
• En muchas ocasiones se requiere un pretratamiento específico para obtener las suspensiones celulares sobre las que se realizará la extracción.
• Las suspensiones celulares están formadas por células libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno de un medio líquido.

Extracción de Ácidos Nucleicos

• Consiste en la obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en el que los ácidos nucleicos se encuentran libres de las estructuras celulares.
• El proceso implica dos procesos:
• Lisis celular: para liberar los ácidos nucleicos. Sirve para inactivar las nucleasas y separar los ácidos nucléicos del resto celular. Su rotura puede ser mecánica, tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos) o por digestión enzimática.
• Inactivación de nucleasas celulares (ADNasas y ARNasas): para evitar la degradación de los ácidos nucleicos.

Purificación de los Ácidos Nucleicos

• Consiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes del lisado.

Técnicas de Extracción de ADN

• Para la extracción de ADN en sangre periférica. existen soluciones comerciales preparadas para lisar células, precipitar proteínas y ADN, e hidratar
• Las muestras de sangre y médula ósea provienen de diferentes servicios clínicos (análisis clínicos, hematología) y se recoge por los informes, y se transportan inmediatamente al laboratorio para que las muestras sean procesadas

Biopsias y Tejidos

• Aunque pueden ser biopsias, citologías o tejidos frescos, usualmente, son biopsias fijadas en formol tamponado al 10% en parafina.

Extracción del ADN en Biopsias y Tejidos

• Se emplean cilindros eppendorf o se hace por microdisección en base a cortes de 5p de bloques de parafina.
• Las células se recogen con aguja o cuchilla (microscopio óptico), y se depositan en tubos con proteína K y su buffer.
• Finalmente, se desparafina con xileno y alcoholes.

Protocolo de Procesado de Sangre

• El protocolo de procesado de sangre es el siguiente:
• Los tubos se disponen con un líquido igual al volumen de las muestras
• Se procesarán con ficoll
• Si se quieren congelar las células, los filtros serán de 0,45 micras
• Mediante la pipeta Pasteur, se incorpora la muestra al tubo
• Centrifugación (500g a 30 minutos a temperatura ambiente), segregando los tubos falcon, mediante 50 ml con 10-50' de PBS.
• Se recoge el anillo celular entre las fases con la pipeta, se vierte las células sobre el PBS, y se procede a la segregación de ADN y ARN.
• Se cuantifica la cantidad de células mediante la cámara de Neubauer.

Decantación

• Se centrifuga a 200 g, 5 min a temperatura ambiente. Según el análisis que se lleve a cabo:

Células variables

• Se resuspende en medio de congelación hasta los 108 células/ml.
• Las células se transfieren al criotubo
• Se someten a un baño de isopropanol, (temperatura de 70°C y entre 1-7 días.)
• Se almacenan en tanques de nitrógeno.

ARN

• Se resuspende en Tri Reagent y a una temperatura de -70 °C.

ADN

• Se conserva el precipitado seco a -70 °C.

Métodos

• Destruit las proteínas, la usan sustancias como el fenotol y el cloroformo
• Para concentrar los ácidos nucleicos, la usan sustancias como l isopropanol o etanol
• Si el número de ácidos nucleicos es insuficiente, para añadir un carrier o portador inerte, como el glucógeno

Protocolo de Extracción de ADN en Sangre Periférica

• Se incorporan entre 8 y 10 ml de sangre a un tubo Falcon de 50 ml, y contiene 30 ml de solución de lisis, a la que se añaden RNAsas.Se mezcla el contenido y rompen los glóbulos rojos.
• Se centrifuga (2000 g, 5 min). Se suprime el sobrenadante quedando el pellet de leucocitos y unos 200-400 de líquido residual
• El vórtex se agita para resuspender las células presentes en el líquido residual.
• Se vuelven a añadir 10 ml de lisis y RNAsas para resuspender las células. Se agita el vórtex( 20 segundos incuba a 37C Por 20 minutos)
• Se refrigeran en hielo durante 4 minutos.
• Se incorporan 3.33 ml de solución de precipitado y las células ya empleadas Se agita el vórtex los 20 segundos para mezclar la solución de precipitados y las célulastras ella se centrifuga (2000 g
• En este punto, el precipitado presenta forma de pellet compacto marrón oscuro El sobrenadante (contiene el ADN),
• Se transfiere a un tubo Falcon estéril de 50 ml con 10 ml propano100 %. A continuación, se mezcla la muestra mediante la inversión50 veces :
• Tras ell se manifestara de (nube de ADN )
• se volverá a centrifugar(2000 g, 1 minuto) para que el ADN Tome forma de pellet blanco

Se suprime el sobrenadante ,y el tubo se sobre papel absorbente para secarlo . El pellet se lava con 10 ml de etanol al 70 %:

• Se centra fuga (2000 g, un minuto)
• Se retira la etanol con cuidado El tubo lo centrifuga durante 10-15 eliminando los restos de etanol Se emplea 4 ml de solución hidratante y se incuba en el baño (con agitación a 65 hasta quedar la temperatura ambiente , el ADN quedara totalmente disuelto . Incubación de 48 a 55 C Desnaturalización de la proteinasa K a 95 C durante 10 minutos El ADN se hasta que se analice Temperatura (-20C)

Extracción de ARN

• ARN es muy sensible a la acción de las ARNasa degrada por ello
• Precauciones generales:
• ARNasa enzimas presentes en Material y superficies ( hongos y células )
• Esterilización del material pierde actividad (recobra la actividad después)
• No requiere de magnesio y etda
• Consecuencias:
• Usan guantes para las látex evita contaminación las bacterias de la piel
• Recomienda respirar evitar cerca tubos (arn) Los soluciones limpias con ARNasas Pipetas y micropipetas ( esterilización y puntos filtro)
• Emplear material Tratamiento inhibidores de ARNasas
• Material resistente (cloroformo y centrifugación)
• Las soluciones de la lizis

Agente carotrópicos Inactiva ARNasas (isotocinato y guanidino)

• Todos los reactivos empleados en el proceso del agua estilada deben estar libres de ARNasa

Los Protocolos de Extracción

Denol (cloroformo y Isosocinato de guanidina

• Tres extracción de ARM
• Primera fase ARN que las células y se fracturan
• El cloroformo separa las soluciones en un fase (acuosa Y orgánica)
• El Isopropanol en fases acuosas
• La Cantidad y la calidad

Factores Que Deben Valorarse en el ARN

Calidad

ARN (evidencia de electroforesis y gel agarosa- formeladehído) buen condiciones ARN (bandas ,bandas fuertes ) si el ARN este algo gradado degradado 2:1/totalmente manchada

Cantidad

• Medida espectofotometría a 260-280 (valor referencial, los entre valores el ARN está limpio)

Los Sistemas Automatizados de Extracción de Ácidos Nucleicos

Las metodologías de extracción automatizado diseño robóticos extracción kits reactivos (específicas muchas ventajas automatatización :

• Garantizar la obtención de ácidos(muy purificados

• Minimiza la contaminación (por proteínas)

• Rapidez

• Aporta rapidez acido(en menos de una hra )

Kits de las marcas

• comerciales (manual o automatizados) Muchas maquinas trabaja variados kit

Las 4 técnicas de extracción son :

• Intercambio iónico (en una fase sólida o resina)
• Memorias de silicio -absorcion-a
• Bolas magnéticas
• Ultrafiltración