Ácidos Nucleicos: TEST DIFICIL

Características Estructurales y Funcionales

• Los ácidos nucleicos son macromoléculas poliméricas que almacenan, transmiten y expresan la información genética de los seres vivos.
• Se encuentran en todos los seres vivos en dos formas: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN).
• El ADN almacena la información hereditaria y controla su transmisión.
• El ARN se encarga de la expresión de esta información mediante la síntesis de proteínas.
• Una serie de enzimas específicas participan en el flujo de información desde el ADN hasta la fase final de su expresión, las proteínas.

Estructura y Composición Química

• El ADN y el ARN difieren en estructura y composición química, pero ambos están formados por nucleótidos.
• Los nucleótidos son las unidades estructurales repetitivas en los ácidos nucleicos e intervienen en la transmisión de información genética.
• Los nucleótidos son unidades monoméricas compuestas por una base nitrogenada, una pentosa y una molécula de ácido fosfórico en forma de anión fosfato.
• La base nitrogenada y el grupo fosfato están unidos a la pentosa.
• Las bases nitrogenadas son compuestos heterocíclicos planos de carbono y nitrógeno con diferentes radicales, pudiendo ser púricas o pirimidínicas.
• Las bases púricas derivan de la purina, adenina (A) y guanina (G); las bases pirimidínicas derivan de la pirimidina, citosina (C), la timina (T) y el uracilo (U).
• Adenina, guanina y citosina están presentes tanto en ADN como en ARN.
• La timina solo se encuentra en el ADN y el uracilo solo en el ARN.
• La pentosa un glúcido de cinco átomos de carbono que forma parte de la estructura de un nucleótido.
• La D-ribosa se encuentra en los nucleótidos que componen el ARN y 2-desoxi-D-ribosa en los nucleótidos que componen el ADN.
• El ácido fosfórico se presenta en los nucleótidos en forma de anión fosfato o grupo fosfato (PO43-).
• El grupo fosfático tiene una estructura tetraédrica con el átomo de fósforo en el centro.
• Tiene una carga negativa y es responsable de la carga negativa de los ácidos nucleicos.
• La unión de una base nitrogenada con una pentosa constituye un nucleósido.
• La combinación de una base nitrogenada con D-ribosa da lugar a ribonucleósidos y con 2-desoxi-D-ribosa da lugar a desoxirribonucleósidos.
• La unión se realiza mediante un enlace N-glucosídico entre el carbono C1´ de la pentosa y el nitrógeno N9 de una base púrica o el nitrógeno N1 de una base pirimidínica, con pérdida de agua.
• Para nombrar los nucleósidos se añade -osina a las bases púricas y -idina a las pirimidínicas, añadiendo desoxi- si la pentosa es desoxirribosa.
• La unión entre un nucleósido y una molécula de ácido fosfórico a través de un enlace éster origina un nucleótido.
• El enlace se da entre el carbono C5′ de la pentosa y el ácido fosfórico, con pérdida de agua.
• Los nucleótidos con 2-desoxi-D-ribosa se denominan desoxirribonucleótidos y componen el ADN.
• Nucleótidos que contienen D-ribosa se denominan ribonucleótidos y componen el ARN.
• Se nombran los nucleótidos eliminando la "a" del nucleósido y añadiendo 5′-fosfato.
• Los nucleótidos se unen mediante un enlace fosfodiéster entre el carbono C5′ de un nucleótido y el carbono C3′ del siguiente, formando cadenas polinucleótidas o ácidos nucleicos.
• Si el número de nucleótidos no es muy grande, se habla de oligonucleótidos.
• Toda cadena de nucleótidos tiene un extremo 5′ con un grupo fosfato y extremo 3′ con un radical hidroxilo (-OH).

El ADN

• El ácido desoxirribonucleico (ADN) almacena y transmite la información genética y dirige la síntesis de las proteínas.
• En eucariotas, se encuentra principalmente en el núcleo de las células como parte de los cromosomas, también en mitocondrias y cloroplastos.
• En procariotas, la mayor parte está en un solo cromosoma y, en menor proporción, en plásmidos; también algunos virus lo contienen como material genético.

Estructura del ADN

• El ADN es un polímero de desoxirribonucleótidos (desoxirribosa) de adenina, guanina, citosina y timina (no uracilo).
• La estructura primaria de una molécula de ADN es la secuencia de bases nitrogenadas en su cadena de desoxinucleótidos.
• Todas las moléculas bicatenarias de ADN tienen la característica común de que la cantidad de adenina es igual a la de timina y la de citosina es igual a la de guanina.
• El principio de complementariedad implica uniones mediante puentes de hidrógeno entre bases nitrogenadas complementarias: adenina con timina (dos puentes) y citosina con guanina (tres puentes).
• La configuración en forma de doble hélice del ADN constituye su estructura secundaria, formada por dos cadenas de polinucleótidos enrolladas.
• Las moléculas de ADN de los seres vivos son bicatenarias (ADNds).

El ARN

• El ácido ribonucleico controla la síntesis de proteínas a partir de la información contenida en el ADN.
• En eucariotas se encuentra en el núcleo, citoplasma y ribosomas.
• Algunos virus solo contienen ARN, otros solo ADN.

Estructura del ARN

• El ARN es un polímero de ribonucleótidos (ribosa) de adenina, guanina, citosina y uracilo (no timina).
• Algunas moléculas de ARN (ARN de transferencia) contienen cantidades pequeñas de otras bases nitrogenadas, normalmente derivados metilados de las cuatro comunes.
• El ARN de los seres vivos es monocatenario y lineal, excepto en algunos virus (reovirus) con ARN bicatenario (ARNds).
• Algunas zonas de la molécula pueden contener secuencias complementarias, plegándose para formar regiones de doble hélice u horquillas.
• Si las regiones complementarias están separadas por una secuencia no complementaria, se forma un bucle en el extremo de la horquilla.
• Las bases complementarias son adenina y uracilo (A=U, dos puentes de hidrógeno), y citosina y guanina (C=G, tres puentes de hidrógeno).

Tipos de ARN

• ARN mensajero (ARNm): supone entre el 2% y el 5% y porta la información para la síntesis de una proteína.
• ARN ribosómico (ARNr): es mayoritario (~80%) y forma los ribosomas con proteínas, responsables de la síntesis de proteínas.
• ARN de transferencia (ARNt): transporta los aminoácidos a los ribosomas para su incorporación en la cadena proteica.
• ARN heterogéneo molecular (ARNhn): precursor del ARNm (pre-ARNm), se encuentra en el núcleo, y da lugar al ARNm tras maduración.Sale al citoplasma
• ARN pequeño nuclear (ARNsn): se localiza en el núcleo y se une a proteínas, ribonucleoproteínas con actividad enzimática. Interviene en la maduración del ARNm.
• ARN pequeño nucleolar (ARNsno): se localiza en el nucléolo y es el precursor de varios ARNr, teniendo un coeficiente de sedimentación de 45S, que producen los ARNr 5.8S, 18S y 28S al fragmentarse.
• ARN con función reguladora de la expresión génica: moléculas pequeñas con secuencias complementarias de regiones específicas de ARNm, bicatenarias (ARNsi) o monocatenarias (ARNmi).

Propiedades Físicas

• La desnaturalización de ácidos nucleicos implica la disociación de cadenas complementarias para generar cadenas sencillas de ADN y/o ARN mediante calor (94-96 °C en la PCR) o aumento de pH. Para secuencias ricas en G:C requieren más tiempo o temperatura.
• La renaturalización es la unión de dos moléculas de ácido nucleico a 50-65 °C (algunas sondas o cebadores pueden requerir 70-72 °C) en un minuto.
• La hibridación es la capacidad de unir o aparear dos cadenas de ADN, ARN o mixtas..
• Las parejas complementarias siempre se unen: guanina con citosina, y timina (ADN) o uracilo (ARN) con adenina. Esta en la base de la PCR e hibridación.
• La electroforesis segrega moléculas por su peso molecular y carga eléctrica en un campo eléctrico, junto con un examen de ADN, ARN o proteínas.
• Ácidos nucleicos, productos de PCR o proteínas se ubican en el extremo de un polímero/gel, y se segregan por tamaño al aplicar una diferencia de potencial.
• Las RNasas (ribonucleasas) y DNasas (desoxirribonucleasas) son enzimas nucleasas ambientales que degradan ARN y ADN, respectivamente.

Las Endonucleasas de Restricción

• Las endonucleasas de restricción son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas (4-8 pares de bases) en ADN bicatenario y producen un corte en la doble cadena, fragmentando la molécula.
• A las secuencias de ADN específicas que reconocen se las denomina dianas de restricción.
• Enzimas de restricción tipo I: reconocen su diana y efectúan un corte a una distancia aleatoria de hasta 1000 pb, generando patrones de fragmentos no específicos.
• Enzimas de restricción tipo II: reconocen la diana y cortan en puntos específicos, generando patrones de fragmentos específicos y reproducibles ,son las llamadas tijeras moleculares.
• Enzimas de restricción tipo III: reconocen dos secuencias invertidas en la misma cadena y cortan fuera de la diana a corta distancia (25-30 pb).
• Se nombran las enzimas de restricción con tres letras en cursiva (género, las primeras dos letras de la especie) y un número romano (orden de aislamiento).
• El corte realizado por la enzima produce extremos romos (en el mismo punto) o cohesivos (en puntos distintos, dejando regiones monocatenarias complementarias).
• Permiten crear moléculas de ADN recombinante, con extremos cohesivos.
• Permiten obtener patrones de restricción para la identificación de muestras, estudios filogenéticos y la detección de anomalías/mutaciones.

Las Mutaciones y los Polimorfismos

• Una variación en la secuencia del ADN puede ser heredada o adquirida.
• Las variaciones no provocan ninguna alteración en el código genético.
• Los polimorfismos o SNP actúan sobre un nucleótido del genoma, afectando como mínimo a un 1% de la población, siendo responsables del 90% de las alteraciones genómicas.
• Modifican la respuesta de las personas a los fármacos o a la susceptibilidad de contraer algunas enfermedades.
• Los microsatélites son partes del ADN sin función conocida, muy variables (polimorfas) entre las personas, conteniendo fragmentos de 1-6 nucleótidos dispersos.
• Las mutaciones son las variaciones que alteran la secuencia base de un gen. Tipos de mutaciones:
• Cromosómicas: modificación estructural de cromosomas.
• Puntuales: cambio de una base en un triplete de nucleótidos, generando un aminoácido diferente (missense mutation) o un codón de terminación prematura (nonsense codon).
• Mutación del marco de lectura: inserción o deleción de nucleótidos que provoca una variación en el marco de lectura.

Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

• La obtención de ácidos nucleicos purificados se realiza en tres fases: pretratamiento, extracción y purificación.
• Pretratamiento de la muestra: sangre, biopsias o tejidos son sitios seguros para la extracción sin contaminantes. Se requiere un pretratamiento para obtener suspensiones celulares.
• Extracción de los ácidos nucleicos: se obtiene un lisado celular homogéneo, donde los ácidos nucleicos se encuentran libres; implica la lisis celular y la inactivación de nucleasas celulares (proteínasa K, pepsinasa...).
• Purificación de los ácidos nucleicos: se separan los ácidos nucleicos de los componentes del lisado.

Técnicas de Extracción de ADN

• Soluciones comerciales que lisan células, precipitan proteínas y ADN en extracción de ADN de sangre periférica.
• Las muestras se transportan de forma inmediata al laboratorio.
• Se añaden a las muestras identificadas con el Cl genérico de biobanco.
• La muestra debe diluirse en PBS para ser analizada con médula ósea.
• Para la extracción de ADN en biopsias y tejidos (biopsias fijadas en formol tamponado al 10%), se requiere el empleo de cilindros eppendorf, o la microdisección.
• Las células se recogen con aguja o cuchilla y se depositan en tubos con proteína K y su buffer.
• Se desparafina con xileno y alcoholes.
• En el protocolo de procesado de sangre, los tubos se disponen con un líquido igual al volumen de las muestras.
• Tras la la centrifugación (500g a 30 minutos a temperatura ambiente):
• Se recoge el anillo celular entre las fases con la pipeta.
• Se cuantifica la cantidad de células mediante la cámara de Neubauer.
• Se centrifuga a 200 g, 5 min a temperatura ambiente para la decantación
• En las células variables, se resuspende en medio de congelación hasta que se llega a una cantidad de 108 células/ml.
• A continuación se transfieren al criotubo para someterse a un baño de isopropanol durante 1-7 días, para almacenarlas en tanques de nitrógeno.
• El ARN: se resuspende en Tri Reagent y se conserva a -70 °C; el ADN se conserva el precipitado seco a -70 °C.
• Proteínas se destruyen con fenol, cloroformo y los ácidos nucleicos se concentran con isopropanol o etanol.
• Si fuera insuficiente el número de ácidos nucleicos, se le añade un carrier.

Protocolo de Extracción de ADN

• Se incorporan 8 y 10 ml de sangre a tubo Falcon con solución de lisis.
• Se añaden RNAsas, rompiendo los glóbulos rojos,invirtiendo el tubo durante 5 min a temperatura ambiente.
• Se centrifuga y se suprime y aspira el sobrenadante por vacío
• Se resuspenden las células en liquido residual
• Se agita el vórtex 20 segundos y se incuba a 37 °C por 20 minutos.
• Se añaden 10 ml de lisis y RNAsas para resuspenderlas para añadirles 3.33 ml de solución de precipitado.
• Se refrigeran en hielo durante 4 minutos antes de centrifugar (2000 g, 6 minutos.
• El sobrenadante (con ADN) se decanta tras centrifugar (2000 g, 6 minutos).
• Se decanta decantando el sobrenadante a tubo falcón.
• el proceso de mezclado se realizara la muestra mediante inversión.
• Se suspende se vuelve a centrifugar con (2000 g; 1 minuto), se extrae y suprime con aspiración de vacío colocándolo luego sobre papel.
• Se realiza lavado con etanol 70% y se invierte diversas luego se centrifuga (2000 g; 1 minuto y se decanta cuidadosamente.
• Se vuelve a voltear durante 10-15 minutos.
• A razón de 4 ml, se emplea una solución hidratantee, se lleva a incubadora, temperatura en 65C.
• Después de 1-2 horas y durante la noche a temperatura ambiente, el ADN total quedará totalmente disuelto.
• El ciclo finaliza tras desnaturalizar la proteinasa K 95 C por 10 min y almacenar a una temperatura en -20 C.

Extracción de ARN

• El ARN es muy sensible a la acción de las ARNasas. Normas para evitar la degradación:
• Usar guantes de látex y no respirar cerca de los tubos de ARN.
• Limpiar las superficies con soluciones comerciales inactivadoras de ARNasas.
• Usar pipetas y micropipetas estériles, con puntas de filtro.
• Usar material tratado previamente con inhibidores de AR-Nasas.
• Usar material resistente al cloroformo y a la alta velocidad de la centrifugación y solución de lisis con agente caotrópico que inactive ARNasas como el isotiocianato de guanidino.
• Usar reactivos y agua destilada libres de ARNasas. Los protocolos se basan en la técnica del denol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Fases de la extracción de ARN:
• El ARN queda intacto, mientras que las células y sus componentes se fracturan.
• El cloroformo segrega la solución en fase acuosa (con ARN) y orgánica.
• El isopropanol recupera por precipitación el ARN en fase acuosa.

Cantidad y Calidad del ARN

• La calidad se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa-formaldehído, presentando bandas fuertes de ARN 28s y 18s (la primera el doble de intensa que la segunda si es de buena calidad).
• La cantidad se mide en espectrofotometría a 260-280 (valor Referencial de 1,8 a 2,0 si está limpio de impurezas).

Sistemas Automatizados de Extracción de Ácidos Nucleicos

• Varias metodologías se han automatizado y optimizado con el diseño de robots automáticos de extracción y kits de reactivos específicos. Ventajas de la automatización:
• Garantiza la obtención de ácidos nucleicos altamente purificados.
• Minimiza la contaminación por proteínas.
• Aporta rapidez, ya que permite obtener ácido nucleico purificado en menos de una hora.
• Los kits comerciales permiten tanto el empleo manual como automatizado, existiendo máquinas especializadas en alguno de ellos. Técnicas de extracción por kit:
• Intercambio iónico en una fase sólida o resina.
• Columnas con membranas de sílice para la adsorción de ácidos nucleicos.
• Bolas magnéticas o Ultrafiltración.