חדירת נגיפים לתאים: אנדוזום, ACE2 ושכפול

• הנגיף, בשלב הראשון, נקשר לקולטן ACE2 על ממברנת התא.
• לאחר הקישור, הנגיף חודר לתא דרך תהליך אינטרנליזציה, ונלכד באנדוזום.
• בתוך האנדוזום, החומציות יורדת הודות לאנזימים כמו Cathepsin L.
• אנזים זה חותך את חלבון ה-S2 הנגיפי, וגורם לשינוי מבני שמאפשר מיזוג של ממברנת הנגיף עם ממברנת האנדוזום.
• בשלב האחרון, ה-RNA הנגיפי משתחרר לציטופלזמת התא ומתחיל את תהליך ההדבקה.

כניסה דרך ממברנת התא

• הנגיף נקשר שוב לקולטן ACE2 על ממברנת התא.
• האנזים TMPRSS2 חותך את חלבון ה-S2 הנגיפי, ויוצר שינוי מבני בחלבון שמאפשר מיזוג ישיר בין ממברנת הנגיף לממברנת התא.
• החומר הגנטי של הנגיף משתחרר לאחר מכן לציטופלזמת התא ואז מתחיל תהליך השכפול.

ארבעה סוגי חלבוני fusion

• טיפוס אחד: בעיקר אלפא הליקס.
• טיפוס שני: בעיקר מבטא-שיטס.
• טיפוס שלישי: תערובת של שניהם.
• טיפוס רביעי: התגלה לא מזמן ולכן אין עליו מידע רב.
• לפעמים הרצפטור לווירוס נמצא בתוך האנדוזום ולכן הוא נכנס לאנדוציטוזה לא ספציפית, תופעה האופיינית לוירוס האבולה.
• אחרי כניסת הוירוס לתא, המטרה היא להכניס את החומר הגנטי שלו לתוך הגרעין התאי כי יש את כל המרכיבים הנחוצים לביצוע רפליקציה.

המשך כניסת הוירוס לגוף

• אם לוירוס אין מעטפת, הוא לא מבצע fusion עם ממברנת התא או האנדוזום, אלא יש להם חלבונים מיוחדים שיוצרים חורים בממברנת האנדוזום.
• הווירוס יוצא דרך חורים אלה ומתקדם בעזרת מיקרוטובולי אל ה-nuclear pore ושם חלבונים על גבי הווירוס נקשרים לשער הגרעין.
• חלבונים קשורים לשער הגרעין והמיקרוטובולי מושכים את הוירוס בכיוון ההפוך, הקופסיד של הווירוס נקרע ויש כניסה של החומר הגנטי שלו לתוך הגרעין.
• נגיפים שחומר הגנטי שלהם הוא RNA לא צריכים להיכנס אל הגרעין כי הם יכולים להתרבות בציטופלסמה.

וירוסים מסויימים גורמים ליצירת חורים

• וירוסים מסוימים גורמים ליצירת חורים באנדוזום המאפשרים יציאה של ה-RNA אל הציטופלסמה.
• במקרים מסוימים גם רנא נכנס אל תוך הגרעין כדי להתרבות.

רפליקציה ותעתוק

• בשלב הזה מתרחשת רפליקציה של דנא או רנא, תעתוק ועיבוד רנא וגם reverse transcription.

רפלקציית DNA

• שכפול ה-DNA הוויראלי תמיד מתעכב, שכן יש צורך בביטוי חלבונים הדרושים לשכפול, לכן, קיימות תוכניות המיועדות לעכב את ייצור חלבוני הקפסיד, כדי למנוע יצירת קפסידים ריקים ללא תוכן גנומי.
• וירוסים עם גנום קטן תלויים יותר בחלבוני המארח לצורך שכפול.
• עם זאת, גם הווירוסים הקטנים מקודדים חלבונים שמאפשרים להם לשלוט באנזימי התא המארח.
• בנוסף, מעורבים בתהליך חלבונים נוספים, כמו חלבונים מסייעים, הליקאזות, אקסונוקלאזות, אנזימים הקשורים לקישור לאתרי התחלת השכפול ואנזימים למטבוליזם של נוקליאוטידים.

שכפול גנום ה DNA

• רוב הווירוסים בעלי גנום DNA משכפלים את עצמם בגרעין התא, אך וירוסים ממשפחת הפוקסווירוסים מבצעים את השכפול בציטופלזמה לכן הם צריכים להביא איתם יותר אנזימים.
• יש וירוסים שיש להם מזלגות שכפול זהים לאלו שמתרחשים בזמן רפליקציה בבני אדם כמו נגיפי פוליאומה, פפילומה, הרפס תהליך אחרים נקרא strand displacement ובו תוך כדי סינתזה של הגדיל החדש יש יציאה של הגדיל הישן.
• בחלק מהמקרים יש דנא מעגלי ובו יש נקודת ORI שגורמת לשכפול לשני הצדדים.
• שיטה נוספת לרפליקציה נקראת rolling circle שאותה עושים נגיפי הרפס למשל.
• הדנא של הוירוסים האלה הוא בדרך כלל לינארי אבל הוא מתעגל וכך יוצר מקטעי דנא המשכיים במעגל שנקראים קונקטמרים.

המשך שכפול

• רצפי החוזרים יחתכו הדנא למולקולות נפרדות של דנא כאשר הוירוס ייארז בקופסיד.
• לנגיפי ההרפס יש שלושה ORI כנראה כדי לאפשר להם לבצע רפליקציה בסוגים שונים של תאים.

מנגנונים בין הנגיף לתא

• וירוסים מפעילים לעיתים קרובות את מנגנוני הסינתזה והשכפול של ה-DNA בתא המארח, שכן הם זקוקים להם לצורך שכפול גנומי.
• תהליך זה מתבצע לרוב באמצעות תוצרים של early gene שמבוטאים בשלבים הראשונים של ההדבקה.

רפליקציית רנא

• האנזים המשמש לשעתוק ושכפול RNA חייב להיות נוכח בתוך חלקיק הווירוס בוירוסים בעלי RNA עם גדיל שלילי.
• לעומת זאת, בוירוסים בעלי RNA עם גדיל חיובי, אין הכרח שהאנזים יהיה נוכח מראש בווריון.
• RNA dependent RNA polymerase (RdRP) הוא אנזים שיודע לשכפל רנא לרנא והוא משומש גם כדי לשכפל את הגנום של הוירוס וגם כדי לייצר מרנא.
• מבנה ה-RNA הוא מרכיב חיוני, שכן הוא מתווך אינטראקציות עם חלבונים ואנזימים, משמש כאות לאריזת הגנום, וממלא תפקידים רגולטוריים מרכזיים.
• כאשר נגיף רנא חיובי נכנס לתא הוא יכול להתחיל מיד את הטרנסלציה, לכן הוא לא צריך להביא יחד איתו RdRP.
• בתא המאחסן, הוירוס הופך להיות שלילי ורק לאחר מכן אפשר לייצר רנא חיובי חדש.
• הגדיל השלילי משמש כתבנית בלבד, בעוד שהגדיל החיובי מתפקד גם כגנום וגם כ-mRNA.
• בווירוס הפוליו (Flavivirus) הגדיל החיובי כולל כיפת 5' וזנב Poly-A, בעוד שבגנום של נגיף הפוליו (Poliovirus) מאפיינים אלו אינם קיימים.

סוגי וירוסים

• וירוס הקורונה שייך למשפחה שנקראת nidovirales שבהם יש רצף ארוך של רנא אבל הוא מחלקים לאזורים וכל אחד יכול לעבור ביטוי באופן אינדיבידואלי.
• הוירוס הזה הוא חיובי לכן חלקו מתורגם ישירות לרנא-תלוי-רנא פולימראז.
• הפולימראז לאחר מכן מייצר עותקים חלקיים של הגנום (subgenomic RNAs) שלא חייבים להיות בדיוק מאותו גדיל או מאותו גנום, מה שתורם לקומבינציות האפשריות השונות של וירוסים.
• נגיפי קורונה מיוחדים גם בגלל העובדה שיש להם אקזו-נוקלאז ולכן יש להם בקרה עם טעויות, בקרה שלא קיימת כמעט אצל נגיפי רנא אחרים.
• נגיף רנא שלילי, כאמור, חייב להביא איתו RdRP כי הוא לא יכול להיות מתורגם ישירות אלא צריך קודם להפוך לחיובי/מרנא. רק מהרנא החיובי אפשר לייצר גנום שלילי חדש.
• יש מאזן מבוקר בין יצירה של מרנא שמופק לחלבוני הקפסיד לבין יצירה של הגנון החדש.
• מצד אחד הגנום לא יכול להיות מיוצר לפני שאין את כל חלבוני הקפסיד ומצד שני יש חשש שהחלבוני ייבנו לקפסיד טרם יצירת הגנום ולכן הוא יהיה ריק.
• מי שמבקר את שני התהליכים יחד הם חלבוני הגרעין (N proteins). בנגיף ה-VSV החלבונים נקשרים לרנא ומונעים מהרנא פולימראז לקפוץ בין מקטעים שונים, כך שמתקבל הגנום השלם.
• נגיף ה-influenza הוא נגיף רנא שמתרבה בתוך הגרעין. יש לו שמונה סגמנטים שכל סגמנט מייצר חלבון אחר, פרט לשניים שעוברים ספלייסינג לשני חלבונים – סך הכל 10 חלבונים.
• האינפלואנזה משתמש ב-cap של מרנא של התא המארח על ידי חיתוך שלו באמצעות אנזים מתאים.
• ה-cap הזה משומש כפריימר כדי לאפשר לוירוס לייצר לעצמו מרנא והוא גם מעלה את היעילות של יצירת המרנא בגלל תכונות הcap שלו.
• לתופעה זו קוראים cap snatching.
• בקצה הרנא הנגיפי יש רצפים של U שמונעים מהרנא פולימראז להמשיך לסנתז כי הם מעוגנים לרנא עצמו.
• למרות שהרנא פולימראז תקוע, הוא מנסה להתקבל אבל מחליף אחורה, כך שמתקבל שהוא מסנתז כמה פעמים את האזור הזה ויוצר רצפים חוזרים של A שמתפקדים כ-POLY-A.
• אם בשלב הזה יש חלבוני N, הרנא פולימראז לא מצליח להחליק אחורה, לכן לא מיוצר מרנא והוא ממשיך ליצירה של הגנום כולו.
• ברנא דו-גדילי יש פולימראז אבל הוא לא קשור ל-RNA עצמו.
• המשמעות היא שהפולימראז מופעל בנפרד מה-RNA ומתחיל לעבוד כאשר הנגיף נכנס לתא המארח.
• למשל בוירוס ה-Reovirus הפולימראז אף פעם לא יוצא מהקפסיד והרנא נכנס לשם כדי לייצר מרנא.
• הקפסיד יישארו שלם ברובו והתפרק רק חלקית כדי לאפשר לנוקלאוטידים להיכנס. יצירה של גנום תתרחש רק בקפסיד חדש.
• פולימראזות (RNA (RdRP מאופיינות בשיעור שגיאות גבוה מכיוון שאין להן מנגנוני תיקון מובנים.
• במהלך סינתזת RNA מתרחשת טעות אחת לכל 104-103 נוקלאוטידים, כך שבגנום באורך 10,000 בסיסים תתרחש בהכרח מוטציה אחת לפחות.
• כאשר נוצרות אלפי נגיפים חדשים, כל עמדה בגנום עשויה לעבור שינוי.
• יוצאת הדופן היא סדרת Nidovirales, שמכילה אקסונוקלאז (ExoN) המאפשר תיקון שגיאות, ובכך תורמת ליכולת הנגיפים להכיל גנומים גדולים בהרבה בהשוואה לנגיפי RNA אחרים.
• לדוגמה, בפוליו זוהו שיירים גנומיים השולטים בדיוק תהליך השכפול, ומידע זה נוצל לפיתוח חיסונים יעילים.

השיעור בוחן את המנגנונים שבהם נגיפים חודרים לתאים, כולל תפקיד האנדוזום וקולטן ACE2. הוא מתעמק בשלבים שלאחר הכניסה, כגון שכפול חומצות גרעין ויראליות, וכיצד התא המארח משפיע על תהליכים אלה. בנוסף, נחקור את ההבדלים בין נגיפי DNA ל-RNA.