2회차_전기생리 1

전기생리학 개론

• 해당 강의는 전기생리학의 역사에 중점을 둡니다.
• 강의 자료 외 PPT 자료는 교수님의 추가 설명과 참고 자료를 포함합니다.
• 시험은 주로 중요한 이론과 내용을 중심으로 출제됩니다.

전기생리란?

• 생리학은 정상적인 생체 상태 유지와 그 유지에 필요한 각 부분의 역할을 연구합니다.
• 전기생리학은 뇌, 근육, 신경 등에서 발생하는 생리 현상에서 세포 내 힘의 작용을 연구합니다.
• 체내 이온 조성과 항상성 유지에 초점을 맞추고, 세포가 항상성을 유지하기 위한 작용을 연구합니다.
• 세포막은 일종의 건전지처럼 작용하며, 전압 차에 의해 전류가 흐르고, 이온 통로가 이를 돕습니다.

항상성(Homeostasis)

• 인체는 50-70%가 체액으로 구성되어 있으며, 이 체액은 물, 이온, 단백질 등으로 이루어져 있습니다.
• 항상성은 외부 자극에도 불구하고 체내 환경이 일정하게 유지되는 상태를 의미합니다.

전기생리(Electrophysiology)

• 세포 외부는 Na+, 세포 내부는 K+의 농도가 높습니다.
• 농도 차에 의해 발생하는 물질 교환 방식에 따라 막전위 차이가 다양하게 나타납니다.
• 전기생리학은 이러한 기본 원리를 연구하는 학문입니다.

전기생리학의 역사

• 1700년대 후반: Luigi Galvani와 Alessandro Volta

  • 죽은 조직을 이용한 실험을 진행했습니다.
  • Galvani는 죽은 개구리 다리에 전류를 흘려 움직임을 발견하고, 생명체가 전지의 역할을 한다고 주장했습니다.
  • Volta는 기질 간 전류 흐름을 유발하는 물질이 존재한다고 주장하며, Galvani의 의견을 반박했습니다.
  • Volta는 원초적인 전지인 볼타 전지를 발명했습니다.
  • 두 주장은 모두 일부가 옳았으며, 이는 전기생리학 발달의 근간이 되었습니다.

• 생체 내 모든 신호는 전기 신호로 해석될 수 있다는 개념이 확립되었습니다.

• 19세기에 recording electrodes and techniques가 발달했습니다.

볼타 전지의 원리

• 최초의 전지는 아연판과 은판 사이에 소금물에 적신 천을 겹쳐 동력을 발생시켜 이온들이 (-)에서 (+)로 이동하며 전기를 생성했습니다.
• 아연판과 구리판을 전선으로 연결하고 묽은 황산을 전해질로 사용하면 아연이 녹아 분리되고 전류가 흐릅니다.
• 구리판에서 수소 기체가 분리되며 전기 발생을 방해하지만, 과산화수소나 산화망간을 사용해 전류가 지속적으로 흐르도록 했습니다.

Sydney Ringer (1881-1887)

• 링거액을 개발하여 살아있는 세포 조성과 유사한 환경을 구현했습니다.
• 생체 내 환경 유지를 위해 특정 이온 농도가 필요하며, 이는 세포 활성화와 유지에 중요합니다.

Walther Nernst (1889)

• 전위차(Electrical Potential)는 이온의 움직임으로 발생합니다.
  • Nernst Equation 도입

Julius Bernstein (1902)

• 전기생리학의 토대를 확립했습니다.
• 확산 전위(Diffusion Potential)는 양이온의 확산(고농도→저농도)으로 발생합니다. membrane의 개념을 도입했습니다.
• 막을 중심으로 세포 내외 농도 차이에 의해 이온 흐름이 발생한다는 개념을 제시했습니다.
• Rheotome이라는 기계를 만들어 전류 발생을 측정했습니다.

Alan L. Hodgkin and Andrew F. Huxley (1963)

• 오징어의 거대 축삭을 이용해 활동 전위(Action Potential) 생성 기전을 연구했습니다. axon을 생리액에 담가 전류 교환을 확인했습니다.
• 특정량의 나트륨이 없으면 전류가 발생하지 않고, 50% 이상이면 활동 전위가 발생함을 기록했습니다.
• 최초로 Voltage Clamp technique를 적용했습니다.
• 전기적 반응을 통해 활동 전위를 측정할 수 있음을 밝혔습니다.

Erwin Neher and Bert Sakmann (1991)

• Patch Clamp technique 개발
• 세포 내 작고 빠른 반응을 증폭하여 측정할 수 있습니다.
• 근육 섬유의 nicotinic acetylcholine receptor에서 single ion channel의 current를 측정하여 세포막에 Ion channel이 존재함을 입증했습니다.
• 이온 연구의 토대 마련

Patch Clamp

세포에 두 전극(recording 전극, 자극 전극)을 사용하여 측정합니다.

구성 요소: 현미경, 세포 내외 전극, 막 전위 증폭기, 신호 발생기 등

Single Ion Channel

이온 채널 하나만 분리하여 열리고 닫히는 미세한 반응을 관찰할 수 있습니다.

David Julius and Ardem Patapoutian (2021) (2023 기출)

• TRPV1 (1997), TRPM8 (2002), Piezo (2010) 채널을 발견했습니다.
• TRP channel 은 비선택적 양이온 채널로, 상황에 따라 다른 양이온을 통과시킵니다.
• TRPV1: 뜨거운 감각(매운맛)을 유발하는 물질에 반응하는 채널로, 캡사이신에 반응하여 고추 채널이라고도 합니다.
  • 염증 또는 통증 발생 시 활성화됩니다.
• TRPM8: 차가운 상태(메탄올, 멘솔 등)에서 열리는 채널로, TRPV1과 반대 작용을 합니다.
• Piezo: 체액의 흐름이나 기계적 자극에 반응하는 채널로 압력을 인지합니다.
• 통증 기전 해석 및 고유수용기 반응 인지에 기여합니다.

이온 채널이란?

• 이온 채널은 transmembrane으로 구성된 단백질입니다(막 투과 단백질).
• 특정 이온에 대한 선택성을 가집니다.
• 기계적 또는 화학적 자극에 반응합니다.
  • 기계적 자극: Stretch-gated (예: Piezo)
  • 화학적 자극: Ligand-gated
• 화학적 개방 채널은 chemical 인식 위치를 가집니다.
  • 예: hormone, neurotransmitter
• 이온 채널을 이용한 약물 개발 및 질환 연구가 진행 중입니다.

Single Voltage-Gated Sodium Channel

• 나트륨이 외부에서 내부로 이동할 때 그래프 높이를 통해 이동하는 이온의 개수 계산이 가능합니다.

Patch Clamp

• 기준 전극(reference electrode)은 전해질에 담근다.
• 기록 전극(recording electrode)은 세포 옆에 두고 막을 당겨 구멍을 냅니다.
  • 구멍을 통해 이온 이동을 측정합니다.

전기생리학의 진화

Xenopus Oocytes(난모세포)

• 처음에는 맨눈으로 볼 수 있는 개구리알(2-3mm)을 사용했습니다.
• 미세 조절이 가능해지면서 세포주(cell line)를 사용하기 시작했습니다.
• Xenopus의 oocyte에 mRNA를 삽입하고 ligand를 처리하여 변화를 기록했습니다.
• 포유류에 적합한 세포를 찾기 위해 개구리알을 사용했습니다.

Cell Lines

• 기존의 큰 대상이 세포 수준으로 작아짐
• 세포 내 DNA 과발현 또는 sRNA 방법을 사용하여 특정 조직 세포주에서 유전자 활성 또는 억제를 연구합니다.

Patch-Clamp Recording

• 실제 조직과 유사하게 작동하도록 직접 조직을 채취합니다.
• 세포막에 가느다란 유리관을 삽입하여 진공 상태를 만들고, 내부에 이온 흐름이 없도록 차단한 후 이온 채널을 기록합니다(Micropipette 사용).

Single Cell Patch

• 세포内外 환경을 조절하기 쉬운 방법으로, 세포 하나만 기록합니다.
• 거의 모든 세포에서 사용할 수 있습니다.
• 세포 네트워크 연결을 유지하여 반응을 확인하는 방법으로 신경 연구 분야에서 주로 사용합니다.

실험 기구

• Anti-vibration table: 무진동 테이블
• Faraday cage: 공기 중 진동, 전류 흐름 제거
• Micromanipulator: 유리관의 미세한 움직임 조절
• Pipette pressure: 주사기로 membrane을 잡고 진공 상태를 만듦
• Amplifier 증폭기: 작은 신호를 증폭하여 관찰
• Headstage: 전류를 증폭하고 내보내는 것을 반복
• Electrode
• Stimulator
• 현미경
  • single cell patch는 렌즈가 아래에 있고 빛이 위에 있습니다.
  • slice patch는 렌즈가 위에 있고 빛이 아래에 있습니다.

모니터로 관찰하는 Recording 준비 과정

• 활동 전위를 생성할 수 있는 흥분성 세포(근세포, 심근세포, 신경세포)를 사용합니다.

Searching for Cell

1. Test pulse: 전극이 물과 세포 사이에 떨어져 있는지 확인하기 위해 외부로 전류를 흘려 Test pulse를 확인합니다.(사각형 모양) $$V=IR$$ 활용
2. Glass pipette 안쪽에는 세포 안과 동일한, 밖은 세포 밖과 동일한 solution을 넣어줍니다.
3. Electrode cell attachedGlass pipette이 세포막에 점점 가까이 가면 저항이 올라 전류가 줄어듭니다.
4. Suction to seal가까이 가다 세포를 짚으면 음압을 걸어 membrane을 당기면 gigaseal이 형성됩니다.
   • Gigaseal: GQ(기가옴) 범위의 저항을 갖는 membrane
5. On cell mode전류가 사라진 것을 보게 되는데, 이때가 tight sealing 됨을 알 수 있다.
   • Tight sealing 상태에서는 유리관 끝과 세포막 사이의 틈이 없이 만나 glass pipette을 통해서만 이온 교환 조절할 수 있는 상태가 됩니다.

• sealing 확인 하는 방법 sealing 값의 저항값이 GQ(기가옴) 단위로 올라가기 시작
• Glass pipette 안의 solution을 0(zero)으로 보정한다.

Whole-Cell Mode

• 살짝 음압을 더 주게 주면 세포막이 터지면서 미세한 구멍이 난다. 이제 전류가 세포 안과 이동 가능. 뚫리고 난 다음에 Rₛ (series resistance) 저항값을 계산한다. 그러면 이 세포의 저항값을 읽을 수 있다.Whole-cell일 때의 저항은 세포 안에서의 저항값에 해당한다. 세포 size와 세포의 저항값, 이동하는 이온의 양을 유추할 수 있다.

과정

이온 채널이 있는 membrane patch를 잡아들이는 방법은 다음과 같습니다.

Whole-Cell Recording (일반적)

• 세포질이 pipette 안쪽과 연속적이다/터진 구멍으로 이온이 출입합니다.
• 이온이 오가는 전체적인 반응을 보고 싶으면 이 단계로 진행하면 된다

Inside-Out Configuration

• 세포 안으로 들어오는 이온을 recording하고 싶을 때 tight sealing이 됐을 때 구멍을 만들지 않고 조금 더 빨아당겨서 잡아 뜯는다. membrane이 똑 떨어진다.
• 세포막 안이었던 것이 밖으로 뒤집어졌다.(inside-out)(세포 벽이 세포 안처럼 환경을 만들어주기 위해 칼슌을 낮춤)

Outside-Out Configuration

• 목적에 의해 세포 외부로 이루어지는 과정이 알고 싶을 때 Whole-cell patch를 만든 후 한 번 더 뗀다 이온을 흘려 측

• 뜯긴 부분이 봉합되면서 바깥쪽이 그대로 바깥에 있는 상태가 된다

• pipette 안이 세포 안과 같은 역할을 한다

Perforate Patch

• 세포의 일부에서 미세한 이온 움직임을 recording하고 싶을 때 → electrode의 직경은 1-2인데 세포에서 큰 면적을 차지한다 측정합니다.
• electrode 안에서 채취하고자 하는 특정 이온 채널 중 하나의 채널인 약물(Nystatin, amphotericin gramicidin, B-escin 등)을 사용합니다.

Voltage Clamp(전압 고정) 분석법의 예시

• voltage clamp: voltage는 고정, current만 발생하는 것을 측정합니다.
• --이온 채널의 특징 이해

① I-V Curve

• 전압을 고정시키고 전류를 측정하여 전압-전류 관계를 분석
• 특정 전압에서 이온 채널이 얼마나 잘 열리는지 확인 가능
• --어떠한 이온이 통과하는지 파악

② mEPSC, eEPSC eEPSC: 전기 자극에 의해 유발되는 전류mEPSC: 세포 자체에서 발생하는 전류 Glutamate receptor에서 Glutamate가 release될 때 일어나는 currrent로, 전류가 전기자극에 대한 반응이면, 세포 자체

• current가 아닌 potential 측정 시 EPSP로 바뀜
• --특정 이온 채널 기록 시 이용