Chromatography Summary PDF

DEEL 4: CHROMATOGRAFIE Doel: scheiden van mengsels in hun verschillende componenten, daarna kan een kwalitatieve of kwantitatieve bepaling volgen. Mengsel w verdeeld in twee fasen: - Stationaire fase: vaste stof of vloeistof die vastzit in kolom, plaat of papier Mobiele fase: gas of vloeistof die z...

DEEL 4: CHROMATOGRAFIE Doel: scheiden van mengsels in hun verschillende componenten, daarna kan een kwalitatieve of kwantitatieve bepaling volgen. Mengsel w verdeeld in twee fasen: - Stationaire fase: vaste stof of vloeistof die vastzit in kolom, plaat of papier Mobiele fase: gas of vloeistof die zich over de stationaire fase beweegt De verschillende componenten van dit staal hebben verschillende affiniteiten voor beide fasen -> hierdoor w ze gescheiden Organische componenten: verschillende snelheid ~ eigenschappen van de moleculen ~ snelheid van de mobiele fase Selectieve vertraging op SF → scheiding componenten INDELING NAAR DE AARD VAN DE MOB IELE FASE Vloeistofchromatografie (LC): o o Mobiele fase Stationaire fase → Vloeistof → Vloeistof (LLC) → Vaste stof (LSC: HPLC) Gaschromatografie (GC): o o Mobiele fase → Gas Stationaire fase → Vloeistof (GLC) → Vast (GSC) 41 Voor- nadelen: + Sneller + Scheiden van complexe mengsels − Vluchtige stoffen: Staal moet om te zetten zijn naar gasfase Analytische chromatografie: minimale hoeveelheid staal Preparatieve chromatografie: grotere hoeveelheid → opzuiveren vb. DNA11 UITWISSELINGSPRINCIPES ADSORPTIECHROMATOGRAFIE Adsorptie = vermogen om een vaste stof aan zijn oppervlak te binden De actieve plaatsen, zoals de oppervlakte silanolgroepen van de silicagel interageren met de polaire functionele groepen van de te scheiden componenten. GEBONDEN FASE CHROMATO GRAFIE Principe: polariteit → elutievolgorde afhankelijk van polariteit fasen en componenten: − Polair houdt van polair − Apolair houdt van apolair De stationaire fase is hier een ongemodificeerde silicagel NORMAL PHASE = stationaire fase is hier polair en de mobiele fase bestaat uit apolaire solventen Apolair gaat als eerste door, polair als laatste 42 REVERSED PHASE = stationaire fase is hier apolair en de mobiele fase bestaat uit polaire solventen Polair gaat als eerste door, apolair als laatste IONENUITWISSELINGSCHROMATOGRAFIE Principe: gebaseerd op affiniteit van ionen in oplossing (mobiele fase) voor tegengestelde geladen ionen op de stationaire fase SF = inerte drager (kunsthars) waarop geladen functionele groepen chemisch gebonden zijn MF = gebufferde waterige oplossing die tegenionen bevat Opeenvolgende stappen voor ionenuitwisseling: 1. 2. 3. 4. Laden ionenuitwisselaar → Ionenparen van SF met tegenionen MF Opbrengen staal → Alles blijft hangen Interactie analyt met ionenuitwisselaar → Competitie ~ grootte ion, lading, concentratie Elutie analyt door aanpassing pH, verhogen ionensterkte, toevoegen extra MF → Competitie verloren door component met laagste netto-lading KATION-UITWISSELAAR Positief geladen ionen uit een matrix opzuiveren SF: hars met negatief geladen functionele groepen, vb. sulfonaat, carboxyl, fosfaat =anionen 43 ➔ kationen worden het beste vastgehouden ziet er zo uit -> zure AZ -> vertonen geen affiniteit voor SF basische AZ -> vertonen wel affiniteit voor SF en zullen langer blijven plakken ANION-UITWISSELAAR Negatief geladen ionen uit een matrix opzuiveren (in eluaat) SF: hars met positief geladen functionele groepen, vb. amino-ethyl (di, tri) = kationen o o o o o o Verwijderen ionen uit water Ontharden van water Verwijderen storend ion uit oplossing Hemoglobinevarianten Iso-enzymen Scheiding aminozuren VERDELINGSCHROMATOGRAFIE = partitiechromatografie Gebaseerd op het verschil in relatieve oplosbaarheid van de componenten in de SF en MF. Zowel de polariteit van de SF en MF als de polariteit van de componenten heeft een rol. Kan heel specifiek gescheiden worden. SF= dunne film vloeistof op vaste drager MF = vloeistof (LLC) of gas (GLC) 44 AFFINITEITSCHROMATOGRAFIE Hier maakt men gebruik tussen specifieke interactie tssn biochemische verbindingen Mogelijke drager: inert, vb. agarose, polyacrylamide, gecrosslinkte dextraan(sephadex) Toepassingen: o o o o o Scheiden proteïnen uit mengsel Scheiden antilichamen uit mengsel Scheiden van cellen met verschillende oppervlakte suikers op lectine kolom Afscheiding van low en very low density lipoproteïnen Afscheiding v geglycolyseerd hemoglobine uit biologisch staal met fenylboronaatdrager GELFILTRATIE = moleculaire zeef = size exclusionchromatography = gel permeatie Gebaseerd op de afmeting van het molecuul SF = macromoleculaire gel met poriën van bepaalde afmeting = anorganische vaste substantie met poriën vb. Sephadex, polyacrylamide, agarose, poreus glas 45 Toepassingen: o o o Bepalen van moleculaire gewichten Scheiden van grote en kleine moleculen Ontzouten van eiwitoplossingen: verwijderen v laag moleculair gewicht zouten STAALVOORBEREIDING Meeste van de stalen moeten een voorbehandeling krijgen MEESTAL EXTRACTIE o o o Isoleren doelwitcomponenten Concentreren Verwijderen interfererende componenten : − Eiwitten → Enzymen, denaturatie − Vetten → Lipasen − Conjugaten → Verhitten bij lage pH, enzymen VLOEISTOF – VLOEISTOF EXTRACTIE Polariteit: - Likes likes like Extractiebuisje of – trechter VASTE FASE EXTRACTIE = Voorbereiding: opzuiveren bepaalde analieten uit een mengsel om deze erna met een andere methode te analyseren o o o ➔ Analoog aan principes chromatografie: Selectieve verdeling over SF en MF Normal – en reversed phase Ionenuitwisselingschromatografie 46 STAPPEN: 1. Selectie kolom: specifiek om bepaalde componenten af te zonderen 2. Conditionering kolom: MF laten doorlopen en kolom vochtig maken 3. Lading staal: deels blijven hangen en deels doorlopen 4. Wasstap: alles wat niet gebonden is verwijderen 5. Elutiestap: alles wat wel gebonden is losmaken 6. Droogdampen: concentratie verhogen 7. Eventueel derivatisatie: chemische modificatie om stoffen bruikbaar te maken voor verdere analyse TOEPASSINGEN: - Klinische chemie - Minikolommen voor zuiveren DNA, RNA, GM STANDAARDISATIE Voor kwantitatieve bepalingen: standaard met gekende concentratie Interne standaard (meest accuraat) = component is verschillend van de te analyseren component maar wel gelijkaardig ➔ Wordt toegevoegd aan het staal en aan de verdunningsreeks = spiken ➔ Signaal interne standaard vergelijken met signaal staal = fluctuaties opsporen ➔ Bij analyses met variabele condities ➔ Nettoretentietijd ongeveer gelijk aan die van analyt ➔ Identieke fysische/chemische eigenschappen als analyt Externe standaard (eenvoudiger) = component die identiek is aan de te analyseren component ➔ Wordt niet toegevoegd a/h staal ➔ Apart geïnjecteerd ➔ Condities moeten identiek zijn! ➔ Voor kwalitatieve bepalingen 47 DUNNE LAAG CHROMATOGRAFIE (TLC) Uitvoering → papierchromatografie TLC/DLC: sneller, betere resolutie, meer detectiemogelijkheden Principe → adsorptiechromatografie MF: Eluens in elutietank SF: Adsorbentia: silicagel + eventueel fluorescentie-indicatoren Stappen: 1. Voorbereiden elutietank en afsluiten voor evenwicht tussen vloeistof en gas 2. Aanbrengen staal/spotten 3. Zichtbaar maken van de vlekken: o o o Verbindingen die fluoresceren: Detectie onder UV Verbindingen die UV absorberen: Aantonen op plaat met fluorescentieindicator Sproeireagens met kleur 4. Meten Rf-waarde Kwantitatieve aspecten van TLC: − − Niet zo geschikt Spotverwijdering: concentratie meten met SFM, identificatie met MS Praktisch nut TLC: − − − Snelle screening om een mengsel te scheiden Semikwantitatief Preparatieve TLC: grote platen , grotere hoeveelheden en spotverwijdering CONVENTIONELE LSC LSC: liquid solid, vloeistof vast, vloeistof kolom chromatografie Principe o o o o Voorloper HPLC Open kolom – zwaartekracht Alle uitwisselingsprincipes Stappen: ~SPE (=solid phase extraction, vaste fase extractie) Scheidingstechniek waarbij een vloeibare mobiele fase migreert doorheen een kolom gepakt met een vast dragermateriaal. 48 Stappen: 1. 2. 3. 4. 5. Kiezen kolom (glas, diameter, vulmateriaal) ➔ Packing gelijkmatig en deeltjesgrootte uniform Bevochtigen kolom Opbrengen staal (bv. Silicagel) ➔ Klein volume (< capaciteit kolom), kolomvulling mag niet verstoord worden Elutie: toevoegen MF ➔ Stroomsnelheid traag Opvangen fracties in porties en detectie (chemisch of fysisch) Soorten Isocratische elutie → 1 oplosmiddel Gradiëntelutie (pH, polariteit, …) → Verschillende oplosmiddelen o o Afwisselend Continu Isocratische elutie (A) vs Gradiëntelutie (B) Gradiëntelutie geeft een betere spreiding HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) − − − Scheiding van mengsel in verschillende componenten Kwantitatieve én kwalitatieve bepaling Scheiding gebaseerd op oplosbaarheid, grootte, polariteit, adsorptie of vluchtigheid PRINCIPE Een vloeibare mobiele fase migreert doorheen een kolom gepakt met een vast dragermateriaal. Deze mobiele fase staat door middel van pompen onder hoge druk zodat er een redelijke stroomsnelheid is. Verschillen met LSC − − − − − Dunne kolom Zeer kleine deeltjesgrootte Hoge druk nodig Scheiding in enkele minuten Analytische chemie / hoge resolutie 49 ONDERDELEN APPARATUUR POMPSYSTEEM Kleine partikels hebben hoge druk nodig zodat ze door de kolom gaan ➔ ➔ ➔ ➔ Resolutie stijgt en de analyse verloopt sneller Debiet, stroomsnelheid: 0,01-10 ml/min. Constante, reproduceerbare flow en druk Ontgassingssysteem Isocratische mode: 1 solvent of mengsel van solventen = 1 reservoir o o Eenvoudige scheidingen, scheidingen van componenten met gelijkaardige structuur Meeste HPLC scheidingen Gradiëntelutie = solventprogrammatie o Complexe scheidingen SOLVENTENRESERVOIR Zorgt ervoor dat de mobiele fase continu op de kolom wordt aangebracht 50 INJECTOR Stalen: ng-2mg (in solvent) o o Vloeistof → rechtstreeks Vast → oplossen en filtreren/centrifugeren KOLOM Packing van de kolom: Ontwikkelen van pelliculair korrelmateriaal = porous layer beads: Harde glazen kern (30-40 μm) met daarrond een dunne laag adsorbens of ionenuitwisselaarshars Micropartikels : Nog kleinere partikels (5-10 μm) Droog: deeltjes van >20 μm Slurry packing: deeltjes van < 20 μm, onder druk Analytische kolommen kunnen gepackt zijn met een variëteit aan stationaire fasen -> grote waaier aan uitwisselingprincipes mogelijk: 1) 2) 3) 4) 5) 6) Adsorptie Normal phase en reversed phase Ionenuitwisseling Vloeistof-vloeistof Affiniteit Gelfiltratie 51 DETECTIESYSTEEM Selectief (voor een bepaald soort componenten) Universeel (voor alle componenten) Eluaat in analytische HPLC: afvalvat (-> einde meting) Eluaat in preparatieve HPLC: fractiecollector (eluaat gaat nog door voor meting op ander toestel (bv: spectrofotmeter)) TOEPASSINGEN Toepassingen (serum en urine): geneesmiddelen, drugs, vitamines, hormonen, metabolieten in lage concentraties LSC VS HPLC GASCHROMATOGRAFIE Mobiele fase = gas Veel gebruikte techniek in analytische laboratoria 52 PRINCIPE Een gaschromatografie bestaat uit een oven met daarin een kolom. Dit is een lange dunne buis waardoor een gas stroomt. Hierbij w een heel klein monstervolume in de gasstroom geïnjecteerd. De vloeistof verdampt. Er ontstaat een dampwolkje dat door de gasstroom wordt meegenomen. In de kolom wordt het monster dan gescheiden in verschillende componenten. Aan het einde van de kolom komen de bestanddelen er één voor één uit langs de detector. ONDERDELEN APPARATUUR MOBIELE FASE: Verschillende gassen kunnen gebruikt w: - Stikstofgas Helium Waterstofgas Strenge eisen op gebied van zuiverheid -> beperken van storende nevenreactie Geen invloed op verdelingscoëfficiënt K (geen interactie tussen analyt en mobiele fase) INJECTIESYSTEEM o o o Zwakste schakel in systeem: reproduceerbaarheid afhankelijk van analist, vandaar vaak gebruik autosampler Specifiek voor analysemonster en afh. van gebruikte kolom Inlaten staal, verdamping staal en menging met draaggas 53 KOLOM Gepakte kolommen: S-fase is dun laagje op korrelvormig poreus dragermateriaal Capillaire kolommen: S-fase is homogene film op binnenkant van een capillaire buis (drager) OVEN o o o Oven–Temperatuur is bepalend voor retentietijd Kolom in oven (tot 400°C) GC gevoelig voor temp.-schommelingen controle tot op 0,1°C STATIONAIRE FASE Voorwaarden: lage vluchtigheid, thermische stabiliteit, chemisch inert DETECTIE Bij voorkeur onmiddellijk na kolom o o o Resultaat -> Chromatogram Zowel kwantitatieve als kwalitatieve analyse! Soorten: − TCD (thermische geleidingsdetector) − FID (vlam ionisatie detector) − GC-MS (massaspectrometer) TOEPASINGEN Toxicologie, forensisch onderzoek, voedselindustrie, farmaceutische industrie… TECHNOLOGISCHE ONTWIKKELINGEN DHPLC (DENATURING HPLC) 54 Kolom: ➔ Apolaire stationaire fase (dus reversed phase) ➔ Polaire mobiele fase ➔ Staal zelf : DNA(polair) + TEAA -> apolair Temp↑ en elutie: ➔ Door de temperatuur te verhogen en meer mobiele fase toe te voegen zal de heteroduplex minder stabiel worden en los geraken van de kolom 1 piek -> geen mutatie 2 of 4 pieken -> wel mutatie Toepassing: mutaties in DNA opsporen 55