TD 1 Cours : Les Techniques Microscopiques - Biologie

🧚 TD 1 cours : les techniques microscopiques introduction pouvoir séparateur de l’oeil humain : 0,2mm taille moyenne d’une cellule eucaryote : 10µm taille moyenne d’une cellule procaryote : 1µm...

🧚 TD 1 cours : les techniques microscopiques introduction pouvoir séparateur de l’oeil humain : 0,2mm taille moyenne d’une cellule eucaryote : 10µm taille moyenne d’une cellule procaryote : 1µm microscopie optique pouvoir de grossissement : X1 000 pouvoir séparateur : 0.2µm → permet de voir la cellule et son noyau de manière générale, mais ne permet pas de voir les organites ou les molécules microscopie électronique pouvoir de grossissement : X1 000 000 pouvoir séparateur : 0.2nm → permet de voir les détails de la cellule et les molécules protocole de préparation des échantillons pour la microscopie optique fixation : arrête les processus biologiques (activité des enzymes), liquide de BOUIN, formaline, paraformaldéhyde lavage déshydratation : passage d’un environnement aqueux à un autre solvant (bains croissants d’alcool puis toluène) inclusion dans la paraffine TD 1 cours : les techniques microscopiques 1  coupe au microtome (épaisseur : 5-50µm) étalement et collage des coupes déparaffinage : toluène réhydratation : alcool puis eau coloration : exemple de l’hematoxyline-éosine : les substances acides de la cellule, comme le noyau, sont colorées par un colorant basique (hematoxyline) bleu les substances basiques de la cellule, comme le cytoplasme, sont colorées par un colorant acide (éosine) rose déshydratation montage protocole de préparation des échantillons pour la microscopie électronique presque identique à celui de la microscopie optique fixation : formaldéhyde, glutaraldéhyde étape de post-fixation avec du tetroxyde d’osmium pour le contraste déshydratation : passage d’un environnement aqueux à un autre solvant (bains croissants d’alcool puis oxyde de propylène) inclusion dans l’araldite ou l’epon → pour obtenir un échantillon plus fin, il faut le durcir davantage coupe à l’ultramicrotome pour avoir des coupes ultrafines (épaisseur : 5- 50nm) lavage des coupes utilisation de contrastants en MET si l’échantillon est naturellement opaque aux électrons (nanoparticules…) : il peut être directement observé si l’échantillon n’est pas naturellement opaque aux électrons (échantillons biologiques de petite taille, comme virus, vésicules, organites purifiés…) : il doit être contrasté avant l’observation = technique de coloration négative TD 1 cours : les techniques microscopiques 2  → utilisation d’acide phosphotungstique : attaque la grille carbonée et repose du carbone entre les particules biologiques exemple de coloration négative cryofracture / décapage → la fracture passe par les structures de moindre résistance donc au milieu de la membrane → pour observer les reliefs des structures : ombrage métallique puis moulage au carbone microscopie électronique à balayage fonctionnement : émission d’électrons produits par une cathode qui balaye la préparation puis détection en 3D des signaux provenants de l’interaction de ces électrons avec l’échantillon → les électrons ne traversent pas l’échantillon, ils “rebondissent” à sa surface TD 1 cours : les techniques microscopiques 3 TD 1 cours : les techniques microscopiques 4