V&O Vraag Past Papers PDF

## V&O vraag 2 ### DAPI - bindt aan dubbelstrengs DNA (intercaleert in minor groove) - fluoresceert blauw licht (emissie 461nm) - indien aangestraald met UV-licht (excitatie 358nm) **DAPI** --> geschikt om DNA te kleuren **Kenmerken:** - makkelijk opgenomen in de cel (gefixeerd en in beperkte m...

## V&O vraag 2 ### DAPI - bindt aan dubbelstrengs DNA (intercaleert in minor groove) - fluoresceert blauw licht (emissie 461nm) - indien aangestraald met UV-licht (excitatie 358nm) **DAPI** --> geschikt om DNA te kleuren **Kenmerken:** - makkelijk opgenomen in de cel (gefixeerd en in beperkte mate ook levend) - goed contrast met groen-, geel- en rood-fluorescerende fluorochromen **Beperkingen:** - toxisch - niet in combinatie met blauw-fluorescerende fluorochromen - alleen geschikt voor fluorescentiemicroscopie ## V&O vraag 2 **DAPI** --> DNA staining (Image of three cells) - Nuclei - Chromosomes - Centromere probe - Nuclei - triple stain - ER antibody - Actin antibody ## V&O vraag 3 **Teken schematisch een eiwit herkend door een fluorochroom-gelabeld antilichaam** Antilichaam = antistof = antibody (Ab) = immunoglobine (Ig) ## V&O vraag 4 **Lokalisatie van enzym met:** - enzymhisto-/cytochemische methode - of - immunohisto-/cytochemische methode ## V&O vraag 5 **Detectie van twee eiwitten die colokaliseren in de cel** **Aanpak?** > Verschil directe vs indirecte immunostaining? ## V&O vraag 5 Direct vs indirect labeling **Directe vs indirecte immuunfluorescentie** (Image of two different methods of labeling) ## V&O vraag 5 Direct vs indirect labeling **anti-actine/ direct labeling** - fluorochroom-gelabelde antilichamen: - groen is FITC - contrakleur DNA (kern): - blauw is DAPI (Image of a cell) **anti-tubuline/ indirect labeling** - konijn-anti-muis Ig - muis-anti-tubuline (Image of a cell with marked tubuline) ## WC 2.4a V&O vraag 5: colokalisatie (Image of a cell with marked microtubule, actine and DNA) - groen (Alexa 488) --> tubuline - rood (Alexa 594) --> actine - blauw (DAPI) --> DNA **Opmerking** PR-verslag Cytoskelet voor ogen: naast overlay alle kleuren, ook de individuele single stains laten zien! ## V&O vraag 5: colokalisatie **Fluorochroom-gelabelde antilichamen** (Image of two methods for staining) - **indirect labeling** - geit anti-konijn Ig-Alexa 488 (groen) - konijn-anti-eiwit 1 - eiwit 1 (tubuline) - **direct labeling** - muis-anti-eiwit 2-Alexa 594 (rood) - eiwit 2 (actine) ## V&O vraag 6a: HE-kleuring **Meest gebruikte kleuring in de medische diagnostiek!** (Image of a tissue sample) - Hematoxyline is een basische kleurstof en kleurt basofiele stof (DNA en RNA), m.n. in de kern - Eosine is een zure kleurstof en kleurt acidofiele bestanddelen in de cel (aminogroepen eiwitten) ## V&O vraag 6b: PAS-kleuring (Lever) **PAS = ?** (Image of a liver tissue sample) **En wat gekleurd?** ## V&O vraag 6c: Autoradiografie (epitheel) (Image of an epithelial tissue sample) - cytoplasma - kern - ER bij kern **Inbouw van radioactief glucose (via glycosylering van eiwitten in het ER)** ## V&O vraag 6d: Enzymhistochemie **ATPase-activiteit als marker voor type II spieren** (Image of a muscle tissue) **Kleuring door fosforylering en precipitatie van een ATPase-product** - Type I cellen voor uithoudingsvermogen - Type II voor kracht en explosiviteit (veel ATPase) ## V&O vraag 6d: Enzymhistochemie (spier) **Kleuring door fosforylering en precipitatie van een ATPase-product** (Image of a muscle tissue) - Spierweefsel van een - (A.) 48- en - (B.) 88-jarige - Type I cellen voor uithoudingsvermogen - Type II voor kracht en explosiviteit (veel ATPase) - Bij 88-jarige (B.) is atrofie van type II spiervezels zichtbaar ## V&O vraag 6: HE-kleuring (spier) (Image of a muscle tissue) **Ter vergelijking:** - Kernen: blauw - Hematoxyline - Cytoplasma: roze - Eosine ## V&O vraag 6e: Enzym-gelabeld antilichaam (Image of a diagram of an indirect assay) **Eerste antilichaam:** **Tweede antilichaam:** ## V&O vraag 6e: Enzym-gelabeld antilichaam (Image of a tumor tissue) **Borsttumorweefsel** **Eerste antilichaam:** **Tweede antilichaam:** **Voordeel enzymlabeling:** - combinatie met Hematoxyline-kleuring mogelijk (overzicht weefsel) ## V&O vraag 6f: GFP-fusie-eiwitexpressie **Green fluorescent protein (GFP)** - Nobel Prize 2008: Shimumura, Shalfie, Tsien (Image of a jellyfish) **Niet meer alleen groen:** ## V&O vraag 6f: GFP-fusie-eiwitexpressie (Image of two cells where GFP is used to mark a protein) **Normally** **With GFP As Tracer** ## V&O vraag 6f: GFP-fusie-eiwitexpressie **Voorbeeld:** - Chromatinebeweging in kankercel (Image of a cancer cell) **De cel brengt een fotoactiveerbare vorm van GFP tot expressie die is gefuseerd met een histoneiwit.** **We zien 'time-resolved' beweging van de geactiveerde GFP-histonen.** **Groene achtergrond is 'lekkage' van de GFP-fluorescentie** **Rode fluorescentie: splicing compartments** ## 5-minutenpraatje (V&O vraag 3) **Motoreiwitten in de cel** (Image of a cell with marked microtubuli, microfilament and vesicles) - Cell membrane - Microfilament - Microtubule - Kinesin - Dynein - Myosin - Vesicle ## 5-minutenpraatje (V&O vraag 3) (Image of a cell with marked microtubuli, various organelles and vesicles) - Membrane vesicles - ER (marked with (-) - Golgi (marked with (-) - MTOC - Lysosome (marked with (+) - Mitochondrion (marked with (+) - **Cytosolic dyneins** - **Cytosolic kinesins** <start_of_image>- Golgi-apparaat door dyneins naar de 'minus-end' van microtubuli --> centrum van de cel - ER door kinesins naar de 'plus-end' van microtubuli - ER vormt een web dat reikt tot aan de celperiferie ## V&O vraag 1 **Samenstelling, voorkomen en functie cytoskeletcomponenten** (Image of a cell) - Plasma membrane - Microfilaments - Mitochondrion - Intermediate filaments - Endoplasmic reticulum - Microtubule - Vesicle ## V&O vraag 1 HERHALING - Fluorescentie-microscoop - Actine = groen (Image of a cell) - Confocale microscoop - (optical section) - Actine = rood - Tubuline = groen **anti-actine/ direct labeling** - muis-anti-actine - Actine **WC Microscopische technieken** ## V&O vraag 1 VERDIEPING **Type intermediaire filamenten is celtype-afhankelijk** (Image of a cell) - In gebruik bij bepaling herkomst tumormetastase - Keratine = groen **Animal Cell Micrograph** - Nucleus - Keratin Intermediate Filament Network - Figure 2 ## V&O vraag 2 **Aan welke cytoskeletelcomponent bindt phalloidine?** **Waarom is phalloidine toxisch voor cellen?** (Image of two mushrooms) - Amanita phalloides ## V&O vraag 2 - **Phalloidine bindt aan actinefilamenten.** - **Na binding van phalloidine zijn de actine-gestuurde functies in de cel verstoord.** - **Phalloidine niet opgenomen door de darm; daardoor toxisch effect toch bescheiden. Maar ...** ## Groepsopdracht 1 **Schrijf het incubatieschema op van de stappen die moeten worden genomen om te kijken of, en waar, 2 eiwitten co-lokaliseren*.** **Bespreek per stap waarom dit moet gebeuren.** * zie V&O vraag 5 van WC Microscopische technieken ## Groepsopdracht 1 REAGENTIA **Immunofluorescentieproef tubuline (eiwit 1) en actine (eiwit 2)** **Reagentia:** - **Antilichamen:** - konijn-anti-tubuline - geit-anti-konijn Ig-groen fluorochroom - muis-anti-actine-rood fluorochroom - **Kernkleuring:** - welke? en welke kleur? - **Fysiologische zoutoplossing** - Wasbuffer - Blokbuffer - Permeabilisatiebuffer - 4% paraformaldehyde - Inbedmedium ## Groepsopdracht 1 INCUBATIESCHEMA - Was cellen in PBS en fixeer met formaldehyde - Was in PBS en incubeer (permeabiliseer) met PBS-TX100 - Incubeer met blocking buffer - Incubeer met: - konijn anti-eiwit 1 (tubuline) Ab - Was met TBS-Tween (TBST) - Incubeer met blocking buffer - Incubeer met: - muis anti-eiwit 2 (actine) Ab-Alexa594 (rood) en - geit anti-konijn Ig Ab-Alexa488 (groen) - Contrakleuring: was, incubeer met DAPI, was met TBS - Inbedden: cellen in inbedmedium ## Groepsopdracht 2 **a. Wat is er anders?** - **Detectie actine:** - phalloidine-Alexa594 ipv. - direct geconjugeerd antilichaam! - **Antilichamen:** - muis ipv. konijn-anti-tubuline - konijn-anti-muis Ig-Alexa488 ipv. - geit-anti-konijn Ig-Alexa488 ## Groepsopdracht 2 **b. Wat zijn de specifieke details van de oplossingen?** - **Fysiologische zoutoplossing:** - PBS: 140mM NaCl + 10mM Na-fosfaat pH7.5 - TBS: 150mM NaCl + 100mM Tris pH7.5 - **Fixatiebuffer:** 4% paraformaldehyde in PBS - **Permeabilisatiebuffer:** 0.25% Triton X-100 in PBS - **Wasbuffer:** 0.05% Tween 20 in TBS (TBST) - **Blokbuffer:** 0.5% melkpoeder in TBS (TBS-BMP) - **Inbedmedium:** ProlongGold - **Kernkleuring:** welke? en welke kleur? DAPI, blauw