Princípios de Microbiologia - Rafael Escada PDF

Princípios de Microbiologia Dr. Rafael Escada Nota da Editora: A área da saúde é um campo em constante mudança. As normas de segurança padronizadas precisam de ser obedecidas; contudo à medida que novas pesquisas ampliam os nossos conhecimentos, tornam-se necessárias modificações adequadas. O...

Princípios de Microbiologia Dr. Rafael Escada Nota da Editora: A área da saúde é um campo em constante mudança. As normas de segurança padronizadas precisam de ser obedecidas; contudo à medida que novas pesquisas ampliam os nossos conhecimentos, tornam-se necessárias modificações adequadas. O autor desta obra verificou cuidadosamente os nomes genéricos das peças mencionadas, bem como conferiu os dados, de modo que as informações fossem precisas e de acordo com os padrões aceitos por ocasião da publicação. Todavia, os leitores devem prestar atenção às novas informações, a fim de se certificarem de que o padrão não sofreu alterações. Isso é importante, sobretudo em relação a informações novas ou que aparecem com pouca frequência. O autor e a editora não podem ser responsabilizados pelo uso impróprio ou pela aplicação incorrecta do produto apresentado nesta obra. O autor e a editora empenharam-se para citar adequadamente e dar o devido crédito a todos os detentores dos direitos autorais de qualquer material utilizado no livro, dispondo-se a possíveis acertos caso, inadvertidamente a identificação de algum deles tenha sido omissa. Nome do livro: Princípios de Microbiologia Autor: Rafael Escada Ano: 2020 ASIN: Direitos exclusivos para a língua portuguesa Copyright © 2020 por Carpe Noctem Reservado todos os direitos. Esta publicação não pode ser reproduzida, nem transmitida, no todo ou em parte, por qualquer processo eletrónico, mecânico, fotocópia, digitalização, gravação, sistema de armazenamento e disponibilização de informação, sítio Web, blogue e outros, sem prévia autorização escrita da Editora.  ÍNDICE 1º Capítulo: Introdução ao Laboratório de Microbiologia 2º Capítulo: Amigdalite 3º Capítulo: Infecção dos Tecidos Moles 4º Capítulo: Meningite 5º Capítulo: Bacteriémia e Endocardite 6º Capítulo: Infecção Urinária 7º Capítulo: Pneumonia em Doente Ventilado 8º Capítulo: Malária e Kala-Azar 9º Capítulo: Gastroenterite 10º Capítulo: Infecções de Transmissão Sexual 11º Capítulo: Principais Meios de Cultura Utilizados no L laboratório de Microbiologia 1º Capítulo Introdução ao Laboratório de Microbiologia Desinfecção e Esterilização I. Normas de Segurança e Boas Práticas no Laboratório de Microbiologia As normas de segurança em laboratórios encontram-se estabelecidas em legislação própria (decreto de lei número 84/97 de 16 de Abril de 1997) com o objectivo de assegurar a protecção dos trabalhadores contra os riscos de exposição a agentes biológicos. Esta legislação estipula: Medidas de protecção individual e colectiva Entre estas encontram-se a utilização de equipamento de segurança individual (como luvas, bata e máscara) e o aconselhamento de imunização dos trabalhadores (por exemplo em relação à vacina contra a hepatite B). Utilização de processos de trabalho, equipamento e instalações que diminuam o risco Defende-se a adopção de boas técnicas e práticas microbiológicas (tais como não pipetar à boca e usar de forma cuidadosa e restrita objectos cortantes ou perfurantes) e a existência de equipamentos específicos de segurança biológica (copos de segurança para conter aerossóis, autoclaves para inactivação pelo calor, contentores para objectos cortantes ou perfurantes, câmaras de segurança biológica, etc). Ainda estabelecida a separação dos locais de trabalho dentro do laboratório e o tipo de materiais a utilizar na construção dos laboratórios. Acções em caso de acidente  Nesta circunstância três medidas devem ser adoptadas imediatamente: -evacuar os funcionários do local do acidente; isolar o local; -alertar as autoridades competentes. Esta legislação aborda ainda a classificação, acondicionamento e tratamento dos resíduos resultantes do funcionamento dos laboratórios. II. Limpeza, Desinfecção e Esterilização Estes termos, coloquialmente utilizados como sinónimos, traduzem processos pelos quais se reduz a contaminação dos materiais e superfícies de utilização hospitalar ou laboratorial. A escolha do método de descontaminação depende de diversos factores, como: - Tipo de material ou equipamento; -microrganismos envolvidos ou potencialmente envolvidos; tempo disponível para o procedimento; -risco de infecção; -nível de descontaminação pretendido. Em relação ao risco de infecção do material e nível de descontaminação necessário podemos considerar três níveis: Risco baixo – para o material não crítico, ou seja, material que só contacta com pele intacta ou que não contacta de todo com o doente requer Limpeza. Risco intermédio – em relação ao material semicrítico: material que pode estar em contacto com mucosas, contaminado com agentes virulentos ou de fácil transmissão cruzada ou antes de uso em qualquer doente imunodeprimido necessita de Desinfecção;  Risco elevado – considera-se para todo o material crítico, ou seja, material que é introduzido em locais estéreis do organismo (exs: corrente sanguínea, líquido céfalo-raquidiano), ou que contacte com soluções de continuidade da pele ou mucosas requer Esterilização; Limpeza Processo pelo qual se remove toda a sujidade, matéria inorgânica e orgânica (exs: sangue, secreções, microrganismos) de um objecto, superfície ou parte do corpo. Tem eficácia de cerca de 80% na remoção d e microrganismos. Mesmo em meio hospitalar é feita com água e sabão o u detergente coadjuvados por acção mecânica. Para o processo de limpeza ficar concluído convenientemente todas as superfícies devem ser bem secas. A limpeza é ainda um pré-requisito fundamental na desinfecção e esterilização de um local, já que facilita a acção posterior do agente desinfectante ou esterilizante na eliminação dos microrganismos e protege contra a corrosão tornando mais seguro o manuseamento de materiais/equipamento clínico. Desinfecção Processo que permite a eliminação ou redução para níveis não patogénicos de todos os microrganismos Excepção das formas bacterianas esporuladas. Tem eficácia de 90-99% na eliminação de microrganismos. Pode ser realizada com agentes físicos ou químicos. Como agente físico utiliza-se o calor. A desinfecção pelo calor obtém-se através da utilização de máquinas com ciclo de lavagem e desinfecção. Este processo é adequado para tratamento de materiais que tolerem a exposição repetida ao calor húmido a temperaturas de cerca de 80-90º C, tais como arrastadeiras, urinóis, roupas, equipamentos anestésicos, instrumentos cirúrgicos, etc. Na desinfecção química utilizam-se vários anti-sépticos ou desinfectantes entre os quais álcool etílico e isopropílico, cloro, glutaraldeído, clorohexidina, iodo, iodopovidona, etc. Estes compostos designam-se anti-sépticos quando aplicados na pele ou outro tecido vivo e desinfectantes quando aplicados em objectos. Os álcoois etílico e isopropílico são desinfectantes de acção rápida, com excelente actividade nas bactérias Gram positivas e Gram negativas, vírus e fungos. Devido à sua fraca penetração não actuam na presença de matéria orgânica, requerendo a limpeza adequada prévia de todos os materiais ou equipamentos. O cloro é o desinfectante de eleição para contaminação por vírus. Tem também uma boa actividade antibacteriana. É inactivo na presença de matéria orgânica. O glutaraldeído é um desinfectante que apresenta excelente actividade para todos os microrganismos tendo mesmo alguma actividade contra esporos. É irritante para a pele e mucosas e apresenta um elevado potencial de toxicidade pelo que deve ser manuseado com as devidas precauções (em locais ventilados e utilizando máscaras, luvas e óculos). Apenas se utiliza na desinfecção de equipamentos de endoscopia. A clorohexidina apresenta como grande vantagem a sua actividade residual durante algumas horas após a aplicação. Além disso é apenas miminamente inactivado na presença de matéria orgânica. Como desvantagens é de salientar a sua ototoxicidade, a inactivação na presença de detergentes aniónicos e a actividade algo reduzida contra fungos, micobactérias e algumas bactérias Gram negativas. É principalmente utilizada na desinfecção da pele e mucosas. O iodo e a iodopovidona apresentam boa actividade contra todos os microrganismos incluindo alguma actividade contra esporos bacterianos. No entanto podem provocar reacções de hipersensibilidade cutânea e alterar as provas de função tiróidea, devendo ser evitados em recém-nascidos. São também usados principalmente como desinfectantes da pele e mucosas. Descontaminação da pele e mucosas Este procedimento, que se considera um subtipo de desinfecção, tem também como objectivo reduzir a quantidade de microrganismos presentes num dado local anatómico. Realiza-se habitualmente: - nas mãos do prestador de cuidados de saúde (médico, enfermeiro...);na pele do doente onde se vai realizar um procedimento invasivo (colheita de sangue, administração de fármaco injectável, etc);  - na desinfecção pré-operatória do médico e doente. - também efectuada através do uso de substâncias anti-sépticas ou desinfectantes, utilizando-se principalmente o álcool etílico, álcool isopropílico com etilsulfato de mecetrónio (Sterilium ®), clorohexidina e os compostos iodados (iodo e iodopovidona). As indicações destes produtos variam consoante o procedimento a efectuar: Higienização das mãos do prestador de cuidados antes de procedimentos invasivos – álcool isopropílico com etilsulfato ou clorohexidina; Desinfecção da pele do doente antes de: Aplicação de injectáveis ou colheita de sangue – álcool etílico; Colheita de sangue para hemocultura, algaliação ou desinfecção da pele no campo Operatório – iodopovidona; Inserção de catéteres endovenosos centrais ou realização de biopsias percutâneas, punções lombares, etc – iodopovidona ou clorohexidina; Desinfecção das mucosas do doente: Mucosa oral – clorohexidina ou iodopovidona em solução oral; Mucosas genitais – iodopovidona. Esterilização Processo pelo qual são eliminados todo o tipo de microrganismos incluindo bactérias esporuladas. Para ser eficaz é necessário que a carga microbiana inicial seja baixa devendo os materiais ser previamente submetidos a um processo de lavagem e secagem. A eficácia na remoção de microrganismos é de 100%.  Os agentes esterilizantes podem ser físicos (ex: calor húmido ou seco), ou químicos (ex: óxido de etileno ou ortoftaldeído). Os processos físicos são preferíveis por serem inócuos, não poluentes e de custo mais baixo, sendo os processos químicos reservados para os materiais termo-sensíveis. Os métodos de calor utilizam temperaturas mais elevadas e/ou tempos de actuação mais longos do que quando utilizados na desinfecção. III. Principais Meios de Cultura Utilizados no Laboratório de Microbiologia Os meios de cultura são utilizados para o crescimento e identificação de bactérias e fungos. Podem ser classificados de duas formas distintas: em relação às suas características físicas (sólidos, semi-sólidos ou líquidos) ou quanto à permissividade e informação que fornecem sobre os microrganismos que neles proliferam; na última classificação consideram-se: Meios selectivos (exs: MacConkey, ANC, Sabouraud); Meios não selectivos (exs: gelose de sangue, gelose de chocolate); Meios diferenciais (ex: MacConkey). Alguns dos meios mais utilizados são: Gelose de Sangue – meio não selectivo utilizado mais frequentemente. Constituído por gelose enriquecido com sangue de cavalo ou carneiro a 45º C. Permite o crescimento de praticamente todas as bactérias e leveduras, a observação da presença ou ausência de hemólise e a distinção do tipo de hemólise. Meio de MacConkey – meio selectivo e diferencial para isolamento de bacilos Gram negativos. Particularidades da sua constituição:  Grande quantidade de sais biliares permitindo apenas o crescimento de bactérias habituadas a estes produtos do metabolismo, como as Enterobacteriáceas e Pseudomonas (Gram negativos) e Enterococcus (Gram positivos – a excepção à selectividade do meio); Presença de lactose e indicadores de pH, permitindo a distinção entre colónias fermentadoras da lactose (cor rosada) e não fermentadoras da lactose (transparentes ou de cor amarela); Meio ANC – meio selectivo para bactérias Gram positivas. Apresenta uma constituição semelhante à gelose de sangue mas com adição de dois antibacterianos (ácido nalidíxico e colistina) que impedem o crescimento de Gram negativos (com excepção de Gardnerella vaginalis e alguns Bacteroides spp.). Gelose de Chocolate – meio nutritivo utilizado na cultura de microrganismos fastidiosos como Neiserria spp. e Haemophilus spp. Assim denominado por ter aparência de chocolate, já que contém sangue aquecido a 80º C. Semelhante à gelose de sangue mas enriquecido com diversos factores incluindo os factores X e V necessários ao crescimento de Haemophilus spp. Não permite distinção de padrões hemolíticos. Meio de Sabouraud – meio selectivo para leveduras. Podem ser adicionados antibacterianos aumentando a sua selectividade. Meio Líquido de Todd-Hewitt – meio líquido mais utilizado. À semelhança dos restantes meios líquidos é usado com o intuito de permitir o enriquecimento do produto biológico em causa facilitando o posterior crescimento dos microrganismos nos meios sólidos e a sua identificação. Meio de Muller-Hinton – meio não selectivo utilizado principalmente para o estudo da susceptibilidade aos anti-microbianos. IV. Técnicas de Sementeira e Condições de Incubação As técnicas de sementeira diferem consoante as características físicas do meio e do produto a semear. Assim em meios líquidos os produtos sólidos são mergulhados directamente no meio enquanto os produtos líquidos são semeados com o auxílio de seringa, pip eta ou ansa. Em meios sólidos em tubo inocula-se com ansa apenas em superfície ou em superfície e em profundidade. Em meios sólidos em placa utilizam-se três métodos: Por quadrantes ou em roseta – coloca-se uma pequena porção de produto num quadrante e procede-se à sementeira com a ansa em todos os quadrantes da placa; Por espalhamento com zaragatoa – utiliza-se no teste de susceptibilidade aos anti-microbianos (TSA) por difusão em placa; Para quantificação de colónias – utiliza-se para a urina; técnica igual aos quadrantes mas empregando ansa calibrada. Em relação às condições de incubação é necessário considerar: Atmosfera – certos microrganismos apenas crescem ou crescem preferencialmente em atmosferas capnofílicas (alto teor de CO2), microaerofílicas (baixo teor de O2) ou anaeróbias (ausência de O 2); Temperatura – para a maioria dos microrganismos a temperatura óptima de crescimento é 37ºC; no entanto, alguns preferem temperaturas mais baixas ou elevadas (desde 4ºC a 42ºC); Humidade – a maioria dos microrganismos tem um desenvolvimento óptimo com humidade igual ou superior a 70%. Estrutura Celular Bacteriana e Coloração de Gram S emelhança das células eucariotas, as células procariotas apresentam citoplasma delimitado por um membrana citoplasmática constituída por uma bicamada fosfolipídica. A envolver esta membrana existe uma parede celular cuja estrutura, componentes e funções permitem classificar a maioria das bactérias em Gram positivas ou Gram negativas.  As bactérias Gram positivas apresentam uma parede celular espessa, composta por múltiplas camadas de peptidoglicano, um polímero de aminoácidos e polissacáridos. Esta parede pode incluir outros componentes, nomeadamente ácido teicóico e lipoteicóico e polissacáridos complexos (fig. 1). A parede celular das bactérias Gram negativas é mais complexa, apresentando duas porções distintas. Externamente à membrana citoplasmática encontra-se uma fina camada de peptidoglicano sem ácido teicóico ou lipoteicóico. Após esta existe a membrana externa. As duas porções estão separadas pelo espaço periplásmico, onde existem várias enzimas, fundamentais para o metabolismo e virulência do microrganismo, e proteínas transportadoras de metabolitos. A membrana externa é assimétrica sendo o folheto interno composto por fosfolípidos e o folheto externo essencialmente constituído por uma molécula anfipática designada lipopolissacárido (LPS) ou endotoxina (fig.1). Objectivo da coloração de Gram Esta coloração, desenvolvida originalmente por Christian Gram em 1884, é usada para diferenciar determinados microrganismos e classificar as bactérias com base na sua forma, tamanho, organização (“arranjo”) e “reacção de Gram”. Permite o diagnóstico presuntivo de determinados agentes infecciosos e a avaliação da qualidade de determinadas amostras biológicas. Materiais e procedimento Após preparação, secagem e fixação (pelo calor ou metanol) do esfregaço: Roxo de metilo (Primeiro corante) – 30 segundos; Lugol (“mordente” ou fixante) – 60 segundos; Limpeza com Álcool ou Acetona (descorante) e Água; Fucsina (Segundo corante) – 30 segundos; Limpeza com Água e Secagem; Observação ao microscópio óptico. Princípio Os microrganismos classificam-se como Gram positivos ou negativos com base nas diferenças da composição e arquitectura da parede celular. As bactérias Gram positivas, devido à espessa camada de peptidoglicano (20-80 nm), retém a coloração inicial (roxo de metilo).não sendo afectadas pela descoloração com solução alcoólica. As Gram negativos, com uma fina camada de peptidoglicano (5-10 nm), não têm a capacidade de reter o roxo de metilo, que é removido pela descoloração com álcool, permitindo a coloração pela fucsina (o segundo corante). Classificações possíveis através da observação de um esfregaço corado pelo método de Gram Reacção de Gram: Positiva (roxo) ou Negativa (rosa / encarnado). Forma: cocos, bacilos, coco-bacilos. Disposição: em cadeia (estreptococos), em cacho (estafilococos), etc. VI. População Microbiana Indígena no Homem Os termos flora microbiana normal, indígena e comensal são sinónimos, sendo utilizados para descrever todos os microrganismos encontrados habitualmente em diversos locais anatómicos de indivíduos saudáveis. Estes microrganismos encontram-se na pele e mucosas de todos os seres humanos pouco após o nascimento e mantêm-se até à sua morte. Os locais anatómicos mais colonizados por esta flora são a pele (com particular incidência na pregas e dobras), as mucosas do tubo digestivo (principalmente mucosa oral e cólon), o sistema respiratório (mucosas nasal e faríngea), a uretra e a vagina. Neste capítulo abordar-se-à a flora cutânea, oral, gastrointestinal, nasal e faríngea. Benefícios da flora indígena Estimulação precoce do sistema imunitário; Prevenção da colonização por microrganismos patogénicos; Síntese de substâncias essenciais (ex: vitamina K). Inconvenientes da flora indígena Potencial disseminação para locais previamente estéreis; Desenvolvimento excessivo de microrganismos potencialmente patogénicos após: Alteração das condições locais; Terapêutica anti- microbiana; imunossupressão. Pele Microrganismos mais frequentes: Staphylococcus coagulase negativos, difteróides anaeróbicos (como Propionibacterium acnes), Micrococcus spp., Corynebacterium spp., etc. Outros: Bacillus spp., Enterobacteriáceas, Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Candida spp., Pityrosporum spp., etc. Além da flora descrita acima, nas axilas e períneo de cerca de 10-15% dos indivíduos saudáveis podemos encontrar ainda Staphylococcus aureus. Mucosa Oral Flora muito diversa chegando a ter mais de 200 espécies diferentes de bactérias Gram positivas e Gram negativas e fungos. Entre os mais frequentes temos Streptococcus spp., Candida spp. e várias bactérias anaeróbias. Mucosa Gastrointestinal A densidade da flora indígena no tracto gastrointestinal vai aumentando progressivamente desde o estômago até ao cólon. Assim na mucosa gástrica podemos ter apenas alguns lactobacilos tolerantes ao ácido ou Helicobacter pylori. Por outro lado no íleo e cólon existe um grande número de bactérias; a maioria (cerca de 95-99%) são anaeróbios, principalmente Bacteroides spp., mas também existem Streptococcus spp., Enterococcus spp., Enterobacteriáceas (Escherichia coli, Klebsiella spp., etc), Clostridium spp., entre outras. Mucosa Nasal e Faríngea A mucosa nasal de cerca de 30% dos indivíduos saudáveis alberga S. aureus. Em termos gerais a mucosa nasofaríngea é habitualmente portadora de microrganismos altamente patogénicos como Streptococcus pneumoniae (ou Pneumococcus), Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis (agentes de infecções respiratórias) ou Neisseria meningitidis (agente de meningite). Também se pode encontrar Candida spp. VII. Normas de Colheita e Transporte de Produtos Biológicos Considerações gerais  A avaliação de um produto biológico em Microbiologia depende de diversos factores, mas principalmente da qualidade da amostra biológica. Para assegurar a qualidade desta é necessário que se cumpram determinadas normas de colheita e transporte: Durante todo o processo de colheita e manuseamento do produto deve usar-se sempre luvas, bata e outro equipamento de segurança pessoal quando necessário; A amostra deve ser constituída por material colhido do verdadeiro local da infecção, com o mínimo de contaminação por flora dos tecidos adjacentes; Deve-se colher o material biológico mais adequado para o isolamento do(s) agente(s) microbiano(s) em causa e, sempre que possível, antes da administração de anti microbianos; Todos os recipientes de colheita e transporte têm que se encontrar esterilizados; Os recipientes para recolha de produtos biológicos não devem encher- se para além dos seus 2/3 de capacidade; A identificação das amostras deve ser feita nos próprios recipientes, nunca na tampa ou invólucro de papel ou plástico envolvente; As amostras devem ser identificadas com os seguintes dados: nome do doente, serviço, tipo de produto biológico, data e hora de colheita; Cada amostra biológica deve ser acompanhada por uma requisição de microbiologia a qual contém habitualmente um inquérito sumário que deve ser completamente preenchido sob pena de o exame ser prejudicado; As amostras biológicas devem ser transportadas o mais depressa possível ao laboratório de Microbiologia, a fim de evitar a proliferação da flora microbiana indígena ou de colonização; Quando não for possível transportar de imediato as amostras biológicas ao laboratório, estas devem ser conservadas de acordo com as condições aconselhadas (refrigeração, meio de conservação, etc), variáveis com o tipo de produto biológico. Critérios de rejeição de amostras biológicas Amostras/requisições incorrectamente (ou não) identificadas; Dados de identificação das amostras e requisições não coincidentes; Recipientes e/ou requisições visivelmente conspurcados com matéria orgânica; Recipientes partidos e/ou a extravasar produto biológico; Amostras inadequadas para o exame microbiológico pedido; Urina Preferir a primeira urina da manhã, colhendo a amostra segundo a técnica do jacto médio. Na mulher: Lavar as mãos, região periuretral, genitais externos e períneo com água e sabão; Enxaguar muito bem com água ou soro fisiológico, de preferência esterilizados, e sempre com movimentos de frente para trás; Afastar os grandes lábios com uma das mãos; Desperdiçar uma pequena quantidade de urina (o “primeiro terço” do jacto urinário); Recolher uma porção de urina (“jacto médio”) para um recipiente esterilizado; Desperdiçar a restante quantidade de urina (“último terço”); Ter cuidado para não tocar com a abertura do recipiente nos genitais externos, coxas e roupa. No homem: Lavar as mãos com água e sabão; Recolher o prepúcio, expondo a glande; Lavar a glande, sobretudo na região do meato uretral, com água e sabão; Enxaguar muito bem com água ou soro fisiológico, de preferência esterilizados; Desperdiçar uma pequena quantidade de urina; Recolher uma porção de urina (“jacto médio”) para um recipiente esterilizado; Desperdiçar a restante quantidade de urina; Ter cuidado para não tocar com a abertura do recipiente nos genitais externos, coxas e roupa. No doente algaliado: Clampar a algália durante 10-15 minutos; Desinfectar a área a puncionar (borracha do tubo colector) como se fosse pele; Aspirar com seringa esterilizada; Enviar a própria seringa ou colocar o seu conteúdo num recipiente esterilizado. Observações: Não puncionar o tubo de plástico ou saco colector da algália nem desconectar a algália para recolher a urina; Evitar a algaliação propositada para colheita de urina; Nunca enviar sacos colectores de urina para exame microbiológico; A urina poderá ser colhida por punção suprapúbica tratando-se, neste caso, de uma amostra de excelente qualidade; Quer no caso de colheita em doente algaliado, quer no caso de colheita por punção suprapúbica, especificar sempre estes procedimentos ao preencher a requisição de microbiologia;  Independentemente do modo de colheita de urina, se não for possível enviar de imediato a amostra refrigerar a mesma; Na suspeita de pielonefrite é sempre aconselhável colher, simultaneamente, sangue para hemoculturas. Sangue para hemocultura Desinfectar o local de punção venosa, por exemplo, com solução alcoólica iodada, de modo circular e do interior para a periferia; Deixar secar completamente antes de puncionar; Desinfectar, do mesmo modo, o local de punção do frasco de hemocultura; Utilizar seringa esterilizada para colher o sangue; Colocar o sangue colhido no frasco, sem trocar de agulha; Nunca fazer apenas uma hemocultura por doente. O número considerado ideal é de 3 hemoculturas por doente num período máximo de 24 horas e mínimo de 1 hora. Cada punção venosa deve corresponder, apenas, a uma hemocultura. Observações: Se for necessário palpar a veia após desinfecção usar uma luva esterilizada ou desinfectar os dedos que vão fazer a palpação; Volume de sangue a colher (consoante as indicações do laboratório) – habitualmente: 10 – 30 mL no adulto; 1 – 5 mL na criança; Evitar colher sangue para hemocultura através de cateter venoso ou arterial (este poderá estar colonizado com microrganismos falseando positivamente um resultado); Evitar, sempre que possível, os locais de punção nos membros inferiores ou na região inguinal;  A colheita de hemoculturas não deve ser condiciona da pela existência de pico febril, já que este não é o momento em que a concentração bacteriana no sangue é mais elevada e este procedimento pode atrasar a colheita e identificação do/s microrganismo/s. Nunca refrigerar a amostra. Manter a amostra à temperatura ambiente até enviar ao LM. Exsudado purulento No caso de se tratar de um exsudado purulento superficial (ex: abcesso) desinfectar cuidadosamente a pele do local de punção com solução alcoólica iodada e realizar o desbridamento dos tecidos necrosados. Deixar secar completamente antes de puncionar. Sempre que possível colher a amostra com seringa. Colocar a amostra num recipiente esterilizado e enviar de imediato ao laboratório. Fora do horário normal de funcionamento do mesmo, injectar a amostra biológica num meio de transporte. No caso de lesão superficial pode também recorrer- se à biopsia da mesma. Não esquecer que as colheitas por seringa são de qualidade superior em relação às efectuadas por zaragatoa, não só porque aumenta a sensibilidade do exame microbiológico como, também, porque os produtos colhidos por zaragatoa não permitem a realização de um exame microscópico directo fiável (após coloração) e são de valorização mais discutível. Se apenas for possível efectuar a colheita por zaragatoa, como é o caso de certos exsudados purulentos, exsudados oculares, exsudados umbilicais e exsudados auriculares (nestes, nos casos em que impossível efectuar colheita por punção transtimpânica), deve fazer-se com uma zaragatoa seca ou humedecida em soro fisiológico esterilizado colocando-a dentro de um tubo esterilizado seco adequado. Enviar de imediato ao laboratório. Fora do horário normal de funcionamento do laboratório de Microbiologia, colocar a zaragatoa em meio de transporte e manter a amostra à temperatura ambiente até a enviar. 4. Expectoração A colheita deve ser preferencialmente efectuada sob supervisão de um médico, enfermeiro ou técnico de análises clínicas. Se o paciente tiver dificuldade em expectorar pode ser necessário recorrer à nebulização, hidratação, cinesiterapia ou drenagem postural. Preferir a primeira expectoração da manhã após a higiene da boca; Instruir o doente para obter uma amostra de qualidade (não saliva), se necessário após tosse profunda. Desprezar a amostra se tiver restos alimentares e/ou saliva; Recolher a amostra para um recipiente esterilizado de boca larga; Quando as amostras não podem ser de imediato enviadas ao laboratório devem ser refrigeradas. Na suspeita de pneumonia é sempre aconselhável colher, simultaneamente, sangue para hemoculturas. 5. Fezes Exame Bacteriológico: Aproveitar uma porção de fezes com muco, pús e/ou sangue. A amostra deve ser colocada num meio de transporte. Habitualmente, a tampa desse meio tem uma colher agregada, que pode ser usada para retirar a porção de amostra a analisar (aproximadamente do tamanho de uma avelã se não tiver consistência líquida). Podem ser efectuadas até três colheitas por doente, correspondendo a dejecções diferentes consecutivas ou, de preferência, a dejecções em dia s diferentes consecutivos.  Geralmente, manter a amostra à temperatura ambiente até enviar ao laboratório. Perante um quadro clínico de colite acompanhada de febre é sempre aconselhável colher, simultaneamente, sangue para hemoculturas. Exame Parasitológico A amostra deve ser colocada num recipiente próprio sem meio de transporte. O recipiente adequado possui, habitualmente, uma colher agregada à tampa que pode ser usada para retirar a porção de amostra a analisar. Deve obter-se até três amostras por doente colhidas, de preferência, em dias alternados. Refrigerar as amostras até as enviar ao laboratório. 6. Líquido Céfalo-Raquidiano (LCR) A colheita é feita, habitualmente, por punção lombar: Desinfectar cuidadosamente a zona de punção, por exemplo, com solução alcoólica iodada; Colher 2-3 mL para um tubo esterilizado; É recomendada a colheita em três tubos que devem ser numerados, sendo o último utilizado para exame microbiológico; Nunca refrigerar a amostra; aconselhável efectuar, simultaneamente, colheitas de sangue para hemocultura. Exsudado nasal Com o polegar de uma das mãos levantar a ponta d o nariz; Colher com uma zaragatoa seca ou humedecida em soro fisiológico esterilizado, introduzindo a zaragatoa ao longo do septo nasal, rodando-a gentilmente contra a mucosa nasal;  Colocar a zaragatoa em tubo seco esterilizado adequado; Repetir o procedimento para a outra narina com outra zaragatoa. Fora do horário normal de funcionamento do laboratório de Microbiologia, colocar a zaragatoa em meio de transporte adequado e manter à temperatura ambiente. Exsudado faríngeo Pedir ao doente para respirar fundo com a boca aberta; Baixar a língua com uma espátula; Colher com zaragatoa seca a partir faringe posterior ou amígdalas, tendo o cuidado de não tocar nas paredes da cavidade bucal, língua ou úvula; Colocar a zaragatoa dentro de um tubo esterilizado seco adequado. Fora do horário normal de funcionamento do laboratório de Microbiologia a zaragatoa deve ser colocada em meio de transporte adequado e mantida à temperatura ambiente. No caso de suspeita de Corynebacterium diphteriae ou Neisseria gonorrhoeae, esse facto deve ser expressamente destacado na requisição, uma vez que é necessário cultura em meios especiais não utilizados por rotina. VIII. Lavagem Higiénica, Asséptica e Cirúrgica das Mãos As mãos são consideradas o principal veículo de transmissão de microrganismos causadores de infecção no Homem. Assim, a lavagem/higiene correcta das mãos é uma das medidas mais importantes de controlo de infecção. Podemos considerar dois tipos de flora microbiana nas mãos, sendo que ambas podem originar infecções cruzadas:  Flora transitória – localiza-se apenas na superfície da epiderme e é adquirida na sequência de um contacto com o ambiente; qualquer microrganismo pode fazer parte desta flora, sendo os mais frequentes alguns bacilos Gram negativos (ex: E. coli e Pseudomonas spp.) e cocos Gram positivos (ex: S. aureus) – os agentes mais frequentes de infecção adquirida em meio hospitalar ou nosocomial; estes microrganismos sobrevivem por curtos períodos nas mãos, têm um elevado potencial patogénico e são facilmente transmitidos por contacto directo; a lavagem das mãos com água e sabão é muito eficaz na sua remoção; Flora residente – multiplica-se na pele podendo encontrar-se nas camadas mais profundas; muito semelhante à flora cutânea em geral; raramente causa doença excepto quando é introduzida traumaticamente nos tecidos mais profundos; para a sua remoção é necessária a utilização de anti- sépticos. Métodos de higiene/lavagem de mãos: Lavagem higiénica ou social; Desinfecção ou lavagem asséptica; Lavagem ou desinfecção cirúrgica. Lavagem higiénica Tem como objectivo remover toda a flora transitória e está indicada nas seguintes situações: contacto com objectos próximos de doentes, infectados ou não (ex: roupas da cama); contactos superficiais com doentes não infectados (ex: medir tensão arterial);  contacto com objectos provavelmente contaminados (ex: materiais de higiene); após remoção de luvas. Neste procedimento, após humedecer as mãos com água, utiliza-se sabão líquido de uso geral com pH adequado (5,5) (ex: Baktolin ®), numa quantidade suficiente para cobrir com espuma toda a superfície das mãos. Após ensaboar as mãos, tendo o cuidado de abranger todas as áreas da mão (de acordo com o procedimento exposto na fig. 2 – cerca de 10-15 segundos cada passo), passa-se por água até retirar toda a espuma e seca-se bem com toalhas de papel. No caso de se utilizar uma torneira de encerramento manual esta deve ser fechada com o toalhete de forma a não recontaminar as mãos. Como alternativa, e quando as mãos se encontrem visivelmente limpas, pode utilizar-se um soluto alcoólico com emoliente (ex: Sterilium ®). Estes têm a vantagem de ser melhor tolerados do que as lavagens frequentes e apresentarem eficácia pelo menos idêntica ao procedimento tradicional. Deve-se aplicar 2 a 3 mL destes solutos e friccionar todas as áreas das mãos (fig. 2) durante cerca de 15 segundos, deixando, sem seguida, o soluto secar. 2 – Palma da mão 3 – Palma contra palma 1 – Palma contra palma esquerda com os contra o dorso da mão dedos abertos e direita e entrelaçados vice-versa  4 – Face dorsal dos 5 – Palma direita 6 – Friccionar com dedos na friccionando movimentos polegar esquerdo e vice- circulares as palma da outra mão versa extremidades distais dos dedos Figura 2 – Procedimento a utilizar na lavagem das mãos Desinfecção das mãos Indicada nas seguintes situações: Contacto com qualquer secreção, excreção ou líquido orgânico de um doente; Contacto com qualquer local infectado; Antes de procedimentos invasivos; Antes de qualquer procedimento numa Unidade de Cuidados Intensivos (UCI); Contacto com doentes com imunossupressão grave;  Contacto com doentes colonizados ou infectados com microrganismos multirresistentes ou altamente infecciosos. O objectivo é remover toda a flora cutânea (transitória e residente). Pode ser realizada tal como a lavagem higiénica (fig. 2) mas utilizando sabão líquido com anti-séptico (por exemplo, clorohexidina). As mãos devem ser bem secas após o último passo. Como alternativa pode recorrer-se a um soluto alcoólico com emoliente aplicado durante 30 segundos nas mãos visivelmente limpas ou após lavagem com água e sabão. Lavagem cirúrgica Indicada antes de qualquer intervenção cirúrgica. O objectivo é a remoção de toda a flora das mãos e antebraços, sendo o procedimento semelhante à desinfecção mas incluindo 3 passos sucessivos: Lavagem dos antebraços, punhos e mãos; Lavagem dos punhos e mãos; Lavagem das mãos. O tempo de cada passo deve ser cerca de 1,5 a 3 minutos e, entre cada um, a passagem por água deve ser feita deixando escorrer a mesma das mãos para o s antebraços e nunca ao contrário, permitindo que a água circule das zonas mais limpas para as zonas mais contaminadas. Deve também utilizar-se uma escova esterilizada, mas apenas nas unhas e antes da primeira cirurgia do dia, já que o seu uso continuado danifica a pele e aumenta o risco de colonização. Nos últimos anos surgiram escovas impregnadas com anti-sépticos que mostraram algumas vantagens em relação ao método tradicional de lavagem cirúrgica, nomeadamente menores custos e redução do tempo de lavagem, sem prejuízo da eficácia. Estas escovas devem ser utilizadas, sem adição de qualquer anti-séptico adicional, na lavagem sequencial dos dedos, mãos, metade distal e metade proximal dos antebraços, alternando sempre entre os dois membros e considerando as quatro faces de cada região (anterior, posterior, interna e externa). A passagem por água é realizada apenas no final de todo o procedimento, com os mesmos cuidados que no método tradicional. Ainda outra alternativa é realizar a lavagem das mãos e antebraços com sabão líquido sem anti-séptico tal como descrito acima e, após secagem com toalhete, aplicar soluto alcoólico com emoliente durante pelo menos 3 minutos e deixar secar. 2º Capítulo Amigdalite I. Quadro Clínico das Amigdalites Infecciosas O quadro clínico de amigdalite pode ser muito variado, dependendo do agente etiológico envolvido. Alguns dos sinais e sintomas mais típicos são: febre; odinofagia ou dor faríngea ou peri-amigdalina; presença de hiperémia e exsudado purulento na faringe; presença de hiperémia, hipertrofia e exsudado purulento nas amígdalas; adenopatias cervicais. Podem surgir muitos outros sinais ou sintomas associados, tais como fadiga, mialgias, artralgias, cefaleias, tosse, hiperémia e exsudado conjuntival, vesículas na faringe, úvula ou palato, adenopatias generalizadas, hepato-esplenomegália, mau estar geral, dor abdominal, exantema cutâneo, etc. II. Agentes Etiológicos Mais Frequentes de Amigdalite Vários microrganismos podem causar amigdalite. A importância relativa de cada um apenas pode ser estimada já que uma proporção significativa de caso s (cerca de 30%) carecem de agente etiológico identificado. Assim entre os agentes etiológicos de amigdalite identificados temos de considerar os vírus (responsáveis por cerca de 70% dos casos) e as bactérias (responsáveis pelos restantes 30%). Vírus: - Rinovírus (cerca de 20% do total de casos) e Coronavírus (~ 5%); Vírus Parainfluenza e Influenza; Adenovírus; Vírus Herpes Simplex (HSV) tipo 1 e 2; Coxsackie A e outros Enterovírus; Citomegalovírus (CMV); Vírus de Epstein-Barr (EBV); Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV); Bactérias: - Streptococcus pyogenes (5-15% de todos os casos em adultos); Corynebacterium diphteriae e outros Corynebacterium spp.; Neisseria gonorrhoeae; Treponema pallidum; Associação de anaeróbios fusiformes e espiralados (Angina de Vincent); Outros Streptococcus spp. (principalmente dos grupos C e G de Lancefield). Patogénese das Amigdalites Infecciosas Em termos de patogénese esta infecção pode ter duas formas de aquisição: a partir da flora microbiana indígena da faringe; através da inalação de aerossóis de indivíduos portadores. Em relação à primeira hipótese, vários microrganismos potencialmente causadores deste quadro podem fazer parte da flora comensal da faringe no ser humano. Entre os mais constantes encontram-se:  vários Streptococcus spp.; vários Corynebacterium spp.; bactérias anaeróbias. Numa percentagem reduzida de indivíduos (inferior a 10%) podemos ainda encontrar outros microrganismos como S. pyogenes ou C. diphteriae. Finalmente os vírus da família Herpesviridae (HSV-1 e - 2, EBV e CMV) podem residir, numa forma latente, nos gânglios linfáticos ou neurónios sensitivos da região faríngea, podendo, por reactivação, originar quadros de amigdalite. Na maioria dos casos, no entanto, a aquisição do agente infeccioso faz-se através da inalação de aerossóis de indivíduos portadores do microrganismo em causa. Estes indivíduos podem apresentar um processo infeccioso desencadeado pelo agente ou ser apenas portadores assintomáticos do mesmo. IV. Diagnóstico de Amigdalite O principal objectivo no diagnóstico etiológico da amigdalite infecciosa é a distinção entre a amigdalite estreptocócica aguda e as restantes etiologias possíveis (principalmente viral) para que a terapêutica possa ser prescrita de forma mais eficaz. Para a detecção de S. pyogenes utilizam-se o método cultural ou testes rápidos de detecção de antigénios desta bactéria, ambos a partir de zaragatoas com exsudado faríngeo (ver secção VIII – Streptococcus pyogenes). O diagnóstico de outros agentes bacterianos é, habitualmente, realizado pelos métodos culturais, sendo que em alguns casos (particularmente N. gonorrhoeae e C. diphteriae) é necessário recorrer a meios de cultura não utilizados por rotina. Para identificar vários vírus recorre-se a ensaios específicos. Por exemplo, no caso de infecção por EBV pode utilizar-se o teste monospot ou ensaios para anticorpos específicos contra o vírus, para o VIH usam-se testes de detecção do ARN viral ou de antigénios específicos, etc. V. Normas de Colheita e Transporte de Exsudados Faríngeos A colheita de exsudado amigdalino / faríngeo deve respeitar os seguintes passos: Pedir ao doente para respirar fundo com a boca aberta; Baixar a língua com uma espátula; Realizar a colheita, com zaragatoa seca, a partir da faringe posterior ou amígdalas, tendo o cuidado de não tocar nas paredes da cavidade bucal, língua ou úvula; Colocar a zaragatoa dentro de um tubo esterilizado seco adequado. Fora do horário normal de funcionamento do laboratório de Microbiologia a zaragatoa deve ser colocada em meio de transporte adequado e mantida à temperatura ambiente. No caso de suspeita de Corynebacterium diphteriae ou Neisseria gonorrhoeae esse facto deve ser expressamente destacado na requisição, uma vez que é necessário cultura em meios especiais não utilizados por rotina. VI. Terapêutica da Amigdalite A utilização de antibióticos na amigdalite está praticamente restrita aos casos de infecção por S. pyogenes (ver secção VIII – Streptococcus pyogenes), já que esta é uma infecção tipicamente benigna e autolimitada. Nos restantes casos (principalmente com etiologia viral) a terapêutica é totalmente sintomática,  Excepção de alguns casos de infecção por vírus influenza ou HSV e na circunstância de síndrome aguda do VIH. Em relação ao vírus influenza existem vários antivirais eficazes como amantadina ou oseltamivir. Estes devem ser iniciados nas primeiras 36 a 48 horas após o aparecimento da sintomatologia de forma a reduzir a duração da doença. A infecção oro-faríngea por HSV responde, por vezes, à terapêutica antiviral com aciclovir. Habitualmente estes fármacos são reservados para doentes imunocomprometidos. A síndrome aguda do VIH é uma indicação formal para início de terapêutica com anti-retrovirais. Infelizmente subsistem algumas dúvidas em relação à duração ideal da terapêutica. VII. Streptococcus spp. O género Streptococcus congrega um grupo heterogéneo de bactérias que coloniza e infecta o homem e os animais. São cocos anaeróbios facultativos, Gram positivos, catalase-negativos, fermentadores dos carbohidratos, que se dispõem em cadeia (sobretudo em meio líquido ), com necessidades nutritivas complexas (necessitando de meios enriquecidos com sangue ou soro) e podem ser causa de doenças tão diversas como amigdalite, pneumonia, abcessos cerebrais, meningite, endocardite ou gangrena. Classificação A diferenciação das espécies dentro deste género é complexa utilizando- se três esquemas de classificação que se baseiam, respectivamente, nos padrões hemolíticos, propriedades serológicas e propriedades bioquímicas dos microrganismos. O último esquema é o menos importante sendo apenas utilizado quando os restantes não são conclusivos. Classificação de Streptococcus spp. segundo o tipo de hemólise Observando o crescimento das colónias em gelose de sangue: α-hemolíticos hemólise parcial correspondendo a uma coloração verde- acastanhada da hemoglobina (provavelmente devido à produção de peróxido de hidrogénio) (exs: S. pneumoniae, S. sanguis); β-hemolíticos hemólise completa observando-se uma zona de descoloração envolvendo as colónias (exs: S. pyogenes, S. agalactiae); γ-hemolíticos ausência de hemólise (exs: S. bovis, S. mitis). Classificação de Streptococcus spp. segundo as propriedades serológicas Classificação elaborada em 1933 por Rebecca Lancefield que agrupa os estreptococos de acordo com a constituição da parede celular em determinados antigénios (carbohidratos). Existem os grupos A a H, K a M e O a V de Lancefield. Alguns estreptococos não são grupáveis, nomeadamente a maioria dos α- e γ-hemolíticos. Esquema geral de classificação: Streptococcu s ( ) outros (ex: maioria Grupo A Grupo B Pneumococ Outros o de S.viridans) (Grupo C, G, F e alguns D) Alguns Grupo D  Enterococcus spp. S. bovis VIII. Streptococcus pyogenes S. pyogenes são cocos Gram positivos dispostos em cadeia, capsulados, não esporulados e imóveis. São β-hemolíticos e classificam-se no grupo A de Lancefield, por possuirem o carbohidrato C na parede celular. Este antigénio é específico deste grupo e é constituído por um dímero de N- acetilglicosamina e ranose. Alguns factores de virulência Cápsula – tem acção anti-fagocítica; Ácido lipoteicóico – permite a ligação a células epiteliais; Proteína M – tem acção de adesina, é anti-fagocítica e degrada o componente C3b do complemento. A sua presença é essencial para a patogenicidade desta bactéria; Toxina eritrogénica – responsável pelo exantema observado na escarlatina. Para a bactéria a possuir é necessário ser infectada por um bacteriófago temperado; Hemolisinas ou estreptolisinas O e S – provocam a lise dos eritrócitos, leucócitos polimorfonucleares, plaquetas e outras células. A estreptolisina O é antigénica e lábil ao oxigénio degradando-se na sua presença (a hemólise que se vê nas placas de cultura é da responsabilidade da estreptolisina S). Quando se pretende pesquisar a presença de anticorpos específicos contra esta bactéria podem utilizar-se anticorpos anti-estreptolisina O; Hialuronidase – lesa o tecido conjuntivo facilitando a dispersão da infecção. Tem também acção anti-fagocítica; Estreptoquinase – dissolve coágulos; DNAse – degrada o ADN em material purulento; C5a peptidase – degrada o componente C5a do complemento. Epidemiologia S. pyogenes coloniza habitualmente a orofaringe de 15 a 20% das crianças e adultos jovens saudáveis. Pode também existir na pele. A colonização é transitória e regulada pela capacidade do portador de iniciar uma resposta imunitária dirigida à proteína M da estirpe colonizadora assim como pela presença de outros organismos na pele e orofaringe que impedem o seu crescimento. Geralmente a doença é provocada por estirpes recentemente adquiridas que têm a capacidade de estabelecer infecção antes que haja produção de anticorpos específicos. A transmissão é feita por via aérea (ex: infecções respiratórias superiores) ou por contacto directo (ex: infecções cutâneas). As infecções cutâneas ou dos tecidos moles resultam da capacidade do microrganismo penetrar na pele através de feridas ou quebras na continuidade cutânea pré- existentes. Principais doenças associadas Faringite / Amigdalite; Escarlatina (faringite + exantema cutâneo); Impetigo;  Erisipe la; Celulit e; Fasceíte necrotizante; Pneumonia; Bacteriémia; Síndrome do choque tóxico estreptocócico; Etc. Sequelas não supurativas de infecção aStreptococcus do grupo A Febre Reumática: pode surgir após faringite / amigdalite ou escarlatina; Glomerulonefrite Aguda: pode ocorrer após faringite ou impetigo. Diagnóstico Exame microscópico; Exame cultural em meio de gelose de sangue; Detecção de antigénio específico de grupo; Detecção de antigénios no exsudado faríngeo (Rapid Diagnosis Test – RDT); Testes serológicos: TASO (teste de detecção de anticorpos anti- estreptolisina O), anti-hialuronidase, anti-DNAse, etc;  Prova da bacitracina; Provas bioquímicas. Os métodos de diagnóstico bacteriológico clássico (exames microscópico e cultural e provas bioquímicas) continuam, actualmente, a ser os mais sensíveis e específicos para o diagnóstico das infecções provocadas por todas as espécies de Streptococcus spp. incluindo, naturalmente, S. pyogenes. Nos últimos anos surgiram vários kits que permitem a detecção dos antigénios específicos dos grupos serológicos de Lancefield. Estes testes permitem determinar o grupo serológico das bactérias de forma rápida e sensível, utilizando-se colónias que, após sementeira em gelose de sangue, apresentem padrão β-hemolítico. Estes testes têm particular interesse n o caso de faringo-amigdalite, já que permitem distinguir os Streptococcus dos grupos A, C e G de Lancefield, todos possíveis agentes etiológicos destas infecções. Os testes de detecção de antigénios específicos de S. pyogenes no exsudado faríngeo / amigdalino representaram um enorme avanço no diagnóstico etiológico da amigdalite. Apesar de menos sensíveis e específicos que o método cultural, são muitíssimo m ais rápidos do que este, permitindo obter resultado s em poucos minutos. Apresentam especificidade entre 90 e 100% e sensibilidade entre 80 e 90%. A sua maior utilidade verifica-se nas infecções amigdalinas pediátricas onde um resultado positivo deve ser sempre considerado como evidência de infecção por S. pyogenes, e tratado como tal de forma a prevenir as complicações não supurativas deste infecção. Um resultado negativo, na presença de uma forte suspeita clínica, deve sempre ser confirmado através do diagnóstico microbiológico clássico. Nos adultos, considerando o menor risco de desenvolvimento daquelas complicações, esta conduta não se encontra tão bem definida. Os testes serológicos são menos úteis para o diagnóstico da infecção aguda, sendo principalmente utilizados no diagnóstico retrospectivo ou como parte dos critérios diagnósticos de Febre Reumática (ver adiante). Prova da bacitracina  Antes do desenvolvimento de métodos mais eficazes e fiáveis a distinção entre S. pyogenes e os restantes Streptococcus spp. era feita pela prova da bacitracina. Nesta prova coloca-se um disco de bacitracina numa placa inoculada com a espécie de Streptococcus spp. que se pretendia identificar, e deixa-se a incubar durante cerca de 24 horas. Caso os microrganismos sejam sensíveis a este antibiótico considera-se que se trata de S. pyogenes, visto ser esta a única espécie dentro do género sensível à bacitracina. Esta prova tem sido cada vez menos utilizada devido à disponibilidade de novos métodos de distinção entre os vários grupos antigénicos de Streptococcus spp. e, por outro lado, às evidências de crescente resistência de S. pyogenes à bacitracina. Tratamento e Profilaxia A terapêutica da faringo-amigdalite estreptocócica está indicada por diminuir o risco de desenvolvimento de febre reumática, reduzir a duração do período sintomático (quando o tratamento é iniciado nas primeiras 48 horas) e diminuir o risco de transmissão do agente a outros indivíduos. No entanto, a terapêutica da amigdalite ou impetigo estreptocócico não parece alterar a epidemiologia da glomerulonefrite aguda pós-infecciosa. Em todos os restantes casos de infecções sistémicas a terapêutica também está, naturalmente, indicada. Actualmente continuam a não existir casos descritos de S. pyogenes resistentes à penicilina, pelo que a melhor terapêutica para este agente é penicilina G intramuscular em dose única. Atendendo ao desconforto desta via de administração podem utilizar -se β-lactâmicos de administração oral, como uma penicilina de espectro mais alargado (ex: amoxicilina) ou uma cefalosporina de 1ª geração (ex: cefradina). Em caso ed alergia a estes antibióticos pode optar-se por um macrólido (ex: claritromicina, azitromicina, eritromicina). Nos últimos anos, no entanto, têm surgido casos de resistência aos macrólidos, atingindo já cerca de 25% das estirpes patogénicas em Portugal. Acredita-se que estas resistências se devam ao uso excessivo deste anti- microbianos no tratamento de diversas infecções.  Outra alternativa são as tetraciclinas que, no entanto, não podem ser utilizadas em crianças por provocarem alterações de crescimento. A profilaxia das complicações não supurativas deve ser feita com uma injecção mensal de penicilina de longa duração (ex: penicilina G). IX. Complicações de Infecções Estreptocócicas: Feb r e Reumática Epidemiologia Actualmente a Febre Reumática (FR) é uma doença mais prevalente nos países em vias de desenvolvimento. Pode surgir na sequência de faringo- amigdalite e escarlatina. A epidemiologia da FR aguda é idêntica à das infecções do tracto respiratório superior por Streptococcus do grupo A, verificando-se um pico de incidência entre os 5 e os 15 anos. O principal factor de risco para esta patologia são as más condições socioeconómicas. Cerca de 3% dos indivíduos com faringite por Streptococcus pyogenes não tratada desenvolvem FR, dependendo estes números do serótipo em causa. Patogénese FR é uma sequela não supurativa de faringite por Streptococcus pyogenes em seres humanos. Define-se como não supurativa já que não existem nem microrganismos nem reacção inflamatória purulenta nas lesões em causa. Pensa-se que esta patologia seja provocada pela resposta imunológica do hospedeiro à infecção pelo microrganismo, sendo a FR considerada uma doença auto-imune resultante de “mimetismo antigénico”. Certas estirpes de Streptococcus do grupo A possuem diversos antigénios que compartilham epítopos com tecidos humanos, nomeadamente o músculo cardíaco e o tecido valvular conjuntivo. Estes epítopos são um a parte integrante da proteína M da bactéria. Assim os anticorpos contra a proteína M reagem também contra diversas estruturas humanas, nomeadamente fosforilase, miosina e outras proteínas do músculo cardíaco, assim como contra proteínas cerebrais e da membrana sinovial. Estes auto-anticorpos estão presentes no sangue de doentes com FR. Os imunocomplexos que se formam atraem outros mediadores inflamatórios (células e enzimas) agravando ainda mais a situação. Certos investigadores colocam também a hipótese de a imunidade celular estar envolvida na patogénese da FR, defendendo que certos fragmentos de proteína M estimulariam a produção de células T citotóxicas específicas contra células do miocárdio. De qualquer forma a patogénese da FR não se encontra totalmente esclarecida, havendo ainda autores que defendem a existência de uma predisposição genética em alguns indivíduos que explicaria as diferenças na susceptibilidade a esta patologia. Quadro clínico Cardite (40 a 60% dos casos) – pancardite que envolve o endocárdio, miocárdio e pericárdio, podendo originar inicialmente taquicardia sinusal, sopro de regurgitação mitral, S3, atrito pericárdico ou cardiomegália, evoluindo posteriormente para espessamento fibroso das válvulas mitral e aórtica, levando a estenose ou regurgitação valvular crónicas; Poliartrite migratória (cerca de 75% dos casos) – manifesta-se por dor muito intensa e edema que atinge principalmente as articulações do tornozelo, punho, joelho e cotovelo; Coreia de Sydenham (menos de 10% dos casos) – pode surgir dias a meses após a infecção estreptocócica; Nódulos sub-cutâneos ( 64mg/L) e a resistência à clindamicina (um antibiótico do grupo das lincosamidas). 2 – Mecanismo de efluxo Este mecanismo é codificado pelo gene mef (“macrolide efflux”). Confere resistência à eritromicina, claritromicina e azitromicina mas não às lincosamidas e estreptogramina B. Os microrganismos com este gene apresentam níveis moderados de resistência aos macrólidos (CMI entre 1 e 32 mg/L) e são susceptíveis à clindamicina. Fenótipos de resistência aos macrólidos O estudo da susceptibilidade de Streptococcus spp. aos anti-microbianos deve ser feita em gelose de Mueller-Hinton com 5% de sangue de carneiro, incubando a 35º C em atmosfera com 5% de CO2, durante 20 a 24 horas. Para determinação do fenótipo de resistência aos macrólidos deve colocar-se na placa um disco de eritromicina e um disco de clindamicina colocados à distância (entre o centro dos discos) de cerca de 20 mm. Existem três fenótipos distintos de resistência: Fenótipo de resistência M resistente à eritromicina e sensível à clindamicina sem zona de «blunting» (corte) da zona de inibição da clindamicina próxima ao disco de eritromicina; Fenótipo de resistência MLSB constitutivo (cMLSB) resistente à eritromicina e à clindamicina; Fenótipo de resistência MLSB indutível (iMLSB) resistente à eritromicina e sensível à clindamicina com “blunting” (corte) da zona de inibição da clindamicina próxima ao disco de eritromicina. O fenótipo M é originado pelo mecanismo de efluxo, enquanto o MLSB surge por modificação da zona alvo do ribossoma. O facto de existirem dois fenótipos MLSB (constitutivo e indutível) deve- se ao facto de o gene erm ter dois tipos de expressão distintos. Assim a forma constitutiva encontra-se permanentemente expressa, conferindo resistência mantida aos antibióticos em causa, originando o fenótipo MLSB constitutivo. Por outro lado a forma indutível do gene só é expressa na presença de concentrações significativas de macrólidos, enquanto os restantes antibióticos (lincosamidas e estreptogranina B) não têm a capacidade de activar a sua expressão. Isto explica a existência do fenótipo MLSB indutível. 3º Capítulo Infecção dos Tecidos Moles I. Características Gerais da Pele e Tecidos Moles A pele, estéril à nascença, é rapidamente colonizada com uma flora que compreende bactérias aeróbias e anaeróbias e fungos, sendo diversos os factores que afectam a distribuição, a composição e a densidade dos microrganismos que “habitam” a pele. A pele tem duas propriedades que a tornam particularmente hostil à colonização por microrganismos: a exfoliação e a secura. A constante renovação do estrato córneo da pele (camada de células mortas) arrasta muitas das bactérias que aderem à sua superfície. Por outro lado, na pele, as zonas mais húmidas (ex: axilas e virilhas) podem ter até 105 vezes mais microrganismos que as zonas mais secas (ex: região dorsal). Outros factores importantes que limitam o crescimento bacteriano são: Diminuição do pH (pode baixar como resultado da hidrólise dos lípidos das glândulas sebáceas pelos próprios microrganismos); Diminuição da temperatura; Concentração de NaCl (o excesso de sal resultante da evaporação do suor inibe diversos microrganismos seleccionando as espécies resistentes como é o caso de Staphylococcus epidermidis); Compostos químicos excretados pela pele (exs: sebo, ácidos gordos, ureia); competição entre diversos microrganismos. Principais microrganismos que colonizam a pele  A flora cutânea pode ser englobada em dois grandes grupos: Flora residente; Flora transitória. Flora residente A flora residente encontra-se quase sempre presente na pele e tem a capacidade de se multiplicar na mesma. É constituída por microrganismos de baixa virulência e que raramente causam infecções como Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis (associado a infecções de dispositivos médicos, como catéteres vasculares), Micrococcus spp., cocos Gram positivos anaeróbios (como Peptostreptococcus spp.) e bacilos Gram negativos aeróbios (que causam infecções com maior frequência em indivíduos acamados). Flora transitória Estes microrganismos sobrevivem na pele durante algum tempo mas não têm a capacidade de desenvolver residência permanente. Dela fazem parte os microrganismos que mais frequentemente causam infecções cutâneas: Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus. Enquanto S. aureus tende a causar infecções mais localizadas, S. pyogenes dissemina-se de forma mais extensa pelos tecidos. Outros microrganismos que podem fazer parte desta flora sã o: Haemophilus influenzae Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Fungos dermatófitos (Trychophyton spp., Epidermophyton spp. e Microsporum spp.)  Vírus Herpes Simplex (HSV) II. Noções Gerais Sobre Infecções da Pele e Tecidos Moles Os agentes infecciosos podem entrar na pele e nos tecidos cutâneos por duas vias: A partir do exterior: através de cortes, feridas, picadas de insectos, lesões de doenças cutâneas ou qualquer situação que interfira com a integridade do estrato córneo; A partir do interior: a partir de doença localizada em tecidos adjacentes ou disseminada à distância por via hematogénica ou linfática. Desta forma a instalação de uma infecção cutânea ou subcutânea pode ser explicada de três formas distintas: Infecção Exógena – resulta da invasão directa dos microrganismos a partir do exterior; alguns factores predisponentes são humidade excessiva, traumatismo, catéteres percutâneos, situações clínicas associadas a diminuição da irrigação sanguínea local dos tecidos (ex: vasculite), etc; Infecção Endógena – surge como manifestação cutânea de uma infecção sistémica; pode ocorrer por extensão directa (exs: osteomielite, artrite séptica) ou por disseminação hematogénica (exs: bacteriémia, endocardite); Lesão Mediada por Toxinas – lesões cutâneas induzidas por toxinas produzidas noutro local do organismo (exs: escarlatina, síndrome do choque tóxico). Como se depreende pela estrutura anatómica e histológica da pele, as infecções exógenas podem ocorrer em várias localizações diferentes, adquirindo denominações distintas e tendo agentes etiológicos particulares. Assim, podemos ter: Micoses superficiais – Infecção fúngica cutânea da camada queratinizada do estrato córneo, pêlos e unhas. Apresentam-se como lesões eritematosas, pruríticas e descamativas. O tratamento é feito com antifúngicos tópicos. Microrganismos mais frequentes: Trichophyton spp., Epidermophyton spp., Microsporum spp., Candida spp. Impetigo – Infecção da epiderme que se manifesta como uma lesão eritematosa acompanhada, ou não, de vesículas intra-epidérmicas cheias de exsudado purulento contendo o microrganismo causador. A etiologia mais frequente é distinta para as formas bolhosa e não bolhosa. Trata-se habitualmente com flucloxacilina ou uma cefalosporina. Microrganismos mais frequentes: S. pyogenes e S. aureus. Foliculite – Infecção dos folículos pilosos. Surge como pápulas ou pústulas, que rodeiam um folículo piloso, circundadas por uma região eritematosa. Pode alastrar localmente originando um furúnculo que se pode complicar num abcesso. O tratamento é feito através da expressão da lesão ou com um antibiótico (ex: flucloxacilina). Microrganismos mais frequentes: S. aureus. Abcesso – infecção colectada, apresentando um revestimento de tecido conjuntivo e sendo constituída por exsudado purulento contendo bactérias viáveis e mortas, neutrófilos e outros leucócitos, restos celulares, etc. Pode resultar da evolução de um foliculite / furúnculo ou da introdução de microrganismos profundamente na pele, por exemplo através de injecções, picadas ou penetração com outros objectos. Trata-se recorrendo ao desbridamento cirúrgico da lesão e a anti-microbianos (ex: flucloxacilina). Microrganismos mais frequentes: S. aureus, bactérias anaeróbias.  Erisipela – Infecção da derme caracterizada por lesões superficiais dolorosas, eritematosas, endurecidas e elevadas. As lesões estão perfeitamente delimitadas em relação aos tecidos adjacentes. Esta doença, que inicialmente se dissemina pelos vasos linfático s superficiais da derme, pode originar um quadro clínico com alguma gravidade. A terapêutica é habitualmente feita com penicilina G. Microrganismos mais frequentes: S. pyogenes, outros Streptococcus spp. Celulite – Processo inflamatório que envolve os tecidos subcutâneos e se caracteriza por dor, eritema, edema e aumento da temperatura local. Pode coexistir com febre, calafrios e linfadenopatia regional. Os bordos da lesão são mal definidos. Pode evoluir par a septicémia. No tratamento utiliza-se flucloxacilina, clindamicina ou, em casos mais graves ou que não respondem aos antibióticos anteriores, piperacilina + tazobactam ou tigeciclina. Microrganismos mais frequentes: S. pyogenes, S. aureus e H. influenzae (agente raro ocorrendo quase exclusivamente em crianças). Fasceíte – Infecção da aponevrose que separa o tecido adiposo subcutâneo do músculo. Estas infecções necrosantes são por vezes causadas por bactérias que penetram através de zonas de ulceração cutânea (por exemplo em diabéticos com insuficiência vascular e diminuição da sensibilidade local) podendo disseminar-se de forma rápida e grave. A terapêutica consiste no desbridamento cirúrgico e tratamento anti-microbiano (associação de penicilina G e clindamicina). Microrganismos mais frequentes: S. pyogenes, Clostridium spp., outras bactérias anaeróbias. III. Normas de Colheita e Transporte de Exsudados Purulentos Normas gerais Todas as amostras devem ser devidamente identificadas, incluindo tipo de produto biológico em causa e local anatómico da colheita; A amostra deve ser colocada num recipiente estéril. No caso de colheita com seringa, a mesma pode ser enviada para o laboratório desde que exista uma tampa esterilizada não perfurante ou cortante apropriada; O transporte e processamento deve ser feito até 2 horas após a colheita. Neste intervalo os produtos devem ser mantidos à temperatura ambiente; Os melhores produtos para o isolamento do agente etiológico são os exsudados colectados ou biopsias tecidulares. O produto biológico a colher depende da lesão em causa, considerando-se três tipos distintos. Lesões fechadas Neste tipo de lesão cutânea a colheita com zaragato a não tem qualquer utilidade. O método ideal de colheita é por punção e aspiração com agulha e seringa esterilizadas. Naturalmente a pele a puncionar deve ser previamente desinfectada com solução alcoólica iodada, de forma a evitar a contaminação pela flora cutânea. Pode ainda recorrer-se a biopsia cirúrgica de material tecidual (não superior a 0,5 cm de diâmetro). Lesões abertas No caso de a colheita através de seringa não ser possível recorre-se à biopsia. O local de colheita deve ser lavado com água destilada ou soro fisiológico estéril e os tecidos necrosados removidos. A biopsia deve ser efectuada nas lesões mais profundas e com sinais de infecção activa.  Quando a biopsia não é possível utiliza-se a colheita com zaragatoa esterilizada (também após limpeza e remoção do tecido necrosado). Esta deve ser colocada num meio de transporte adequado. Úlceras de pressão ou vasculares Estas amostras contêm habitualmente uma grande quantidade de tecidos necrosados que favorecem a colonização por uma abundante flora microbiana. Assim, devido à dificuldade em distinguir os agentes etiológicos da flora colonizadora, estes produtos só devem ser processados em situações especiais, seguindo as normas emitidas por cada laboratório. Habitualmente preferem-se os produtos colhidos por punção com seringa ou por biopsia em relação aos colhidos com zaragatoa. IV. Processamento Laboratorial de Exsudados Purulentos Tal como na maioria dos produtos biológicos o processamento laboratorial básico dos exsudados purulentos tem dois componentes fundamentais: Exame microbiológico directo; Exame cultural. Exame microbiológico directo Este exame só tem valor em relação aos exsudados colhidos com seringa e compreende a realização de esfregaços, coloração dos mesmos pelo método de Gram e sua observação microscópica. Em certas situações podem também utilizar-se as coloração de Ziehl-Neelsen ou azul-de- metileno. Exame cultural Os meios de cultura utilizados para os exsudados purulentos são os seguintes: Gelose de sangue; Meio de MacConkey; Meio de ANC; Manitol Salgado ou meio de Chapman (ver VIII. Distinção Entre Staphylococcus aureus e Staphylococcus Coagulase Negativos); Meios líquidos de enriquecimento. A incubação é feita em aerobiose a 37º C durante 18 a 24 horas. V. Staphylococcus spp. O género Staphylococcus inclui uma grande variedade de cocos Gram positivos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, imóveis, catalase positivos e que se dispõem “em cacho”. Compreende 32 espécies e 17 sub - espécies, muitas das quais colonizam o ser humano e algumas têm capacidade patogénica. As espécies mais frequentemente associadas a doença no Homem são: Staphylococcus aureus (a espécie mais virulenta e melhor estudada); Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus haemolyticus; Staphylococcus lugdunensis; Staphylococcus saprophyticus.  A distinção entre S. aureus e as restantes espécies pode ser efectuada por uma prova bioquímica simples – a prova da coagulase. S. aureus é o único membro deste género coagulase positivo sendo as restantes espécies globalmente conhecidas como Staphylococcus coagulase negativos (SCN). Epidemiologia Os elementos do género Staphylococcus podem ser encontrados em quase todas as localizações. Todos os seres humanos têm SCN na pele e S. aureus é um membro da flora cutânea transitória, especialmente nas pregas cutâneas, onde a percentagem de humidade é superior. Nos recém-nascidos a colonização do coto umbilical, região peri-anal e pele por S. aureus é comum. Nesta faixa etária também é possível encontrar SCN e S. aureus na orofaringe e nos tractos gastrointestinal e uro-genital. Em crianças mais velhas ou adultos a colonização persistente ou transitória por S. aureus é mais frequente na nasofaringe. Cerca de 15-30% dos adultos saudáveis apresentam S. aureus na nasofaringe de forma persistente, sendo a incidência desta colonização superior em doentes hospitalizados, pessoal médico, indivíduos com doenças cutâneas eczematosas e utilizadores regulares de seringas, por razões médicas (ex: diabéticos insulinodependentes) ou em utilizadores de drogas por via endovenosa. Dado o seu habitat a transmissão dos estafilococos entre dois indivíduos é muito fácil. Este facto torna os elementos deste género agentes muito frequentes de infecções nosocomiais, ocorrendo a sua transmissão através do contacto entre dois doentes de forma directa ou indirecta (através de um profissional de saúde) ou através do contacto com objectos de um doente colonizado (exs: roupa, lençóis da cama, etc). Esta circunstância enfatiza a importância das práticas d e controlo de infecção hospitalar, principalmente a lavagem das mãos por parte do profissional de saúde , após o contacto com qualquer doente ou mesmo apenas com os objectos que estão em contacto com os mesmos. VI. Staphylococcus aureus  A capacidade de sobreviver em condições difíceis na Natureza, a extrema virulência que evidencia (resultante da diversidade de factores de virulência que possui) e a variedade de infecções que pode provocar, tornam este microrganismo um dos mais importantes agentes patogénicos para o Homem. S. aureus, apesar de não formar esporos, é um dos microrganismos mais resistentes na Natureza, podendo sobreviver longos períodos em objectos inanimados como roupas (incluindo da cama), maçanetas das portas, torneiras, etc. É relativamente resistente ao calor. Por estas razões quando introduzido n o “ambiente humano” é difícil de ser eliminado. Factores de virulência S. aureus é um dos microrganismos mais bem “equipados” em termos de factores de virulência o que lhe permite causar diversas doenças graves. Estes factores podem ser divididos em três grupos. Componentes estruturais Cápsula– inibe a quimiotaxia, a fagocitose e a proliferação de leucócitos mononucleares; facilita a adesão a corpos estranhos; Peptidoglicano – permite a estabilidade osmótica, estimula a produção de pirogénios endógenos e inibe a fagocitose; Ácido teicóico – regula a concentração catiónica na membrana celular; liga- se à fibronectina facilitando a adesão bacteriana; Proteína A – inibe a acção dos anticorpos ao ligar-se aos receptores Fc de IgG1, IgG2 e IgG4; tem acção anti-complemento. Toxinas Citotoxinas (α, β, γ, δ e leucocidina P-V) – acção tóxica sobre leucócitos, eritrócitos, macrófagos, plaquetas e fibroblastos, entre outras células; Toxinas exfoliativas (ETA e ETB) – proteases que quebram as ligações intercelulares (desmossomas) no estrato granuloso da epiderme, provocando a separação entre a superfície da pele e as camadas mais profundas. Desta forma perde-se um dos mais importantes mecanismos de defesa inespecífica do nosso organismo, tornando-se assim uma porta de entrada fácil para a infecção por diversos microrganismos. A acção sistémica destas toxinas no recém-nascido e crianças jovens provoca o Síndrome estafilocócico da pele escaldada (doença de Ritter ou “Staphylococcal scalded skin syndrome” – SSSS) enquanto em crianças mais velhas e adultos ocorre principalmente a versão localizada, denominada impetigo bolhoso; Enterotoxinas (A-E e G-I) – superantigénios; estimulam a libertação de mediadores inflamatórios pelos mastócitos, aumentam a peristálise e a perda de líquido a nível intestinal provocando náuseas e vómitos; são resistentes ao aquecimentos a 100º C durante 30 minutos e à hidrólise por enzimas gástricas e jejunais; provocam intoxicações alimentares; Toxina do Síndrome do Choque Tóxico (TSST-1) – superantigénio; provoca destruição das células endoteliais e tem a capacidade de penetrar as barreiras mucosas; provoca um quadro clínico com febre, exantema, hipotensão e disfunção multiorgânica, com hemoculturas negativas; a porta de entrada mais frequente é a vagina, surgindo mais habitualmente em mulheres jovens (com S. aureus na flora vaginal) que usam tampões durante o período menstrual (facilitando a proliferação destes microrganismos); Enzimas Coagulase – converte o fibrinogénio em fibrina; Catalase – catalisa a remoção do peróxido de hidrogénio; Hialuronidase – hidrolisa o ácido hialurónico no tecido conjuntivo, promovendo a disseminação de S. aureus nos tecidos; Fibrinolisina – dissolve coágulos de fibrina; Lípases – hidrolisam os lípidos; Nucleases – hidrolisam o ADN; Penicilinases – hidrolisam as penicilinas. Doenças Associadas S. aureus tem a capacidade de provocar doenças através da produção de toxinas ou pela invasão directa e destruição dos tecidos. Doentes com presença de corpos estranhos ou com doenças congénitas associadas a défices na resposta quimiotáctica ou fagocítica têm maior susceptibilidade a infecções por este agente. Algumas das doenças mais importantes e/ou mais frequentes provocadas por S. aureus são: Doenças mediadas por toxinas: o SSSS, impetigo bolhoso; o Intoxicação alimentar; o Síndrome do choque tóxico; Infecções supurativas: Infecções cutâneas (impetigo, foliculite, celulite , fasceíte, abcesso, infecções de feridas); o Bacteriémia / Endocardite; o Pneumonia, empiema; o Osteomielite, artrite séptica. VII. Staphylococcus Coagulase Negativos SCN são dos microrganismos mais frequentemente encontrados na flora normal do Homem. Apesar de menos virulentos que S. aureus, possuem também alguns factores de virulência, sen do responsáveis por infecções principalmente em indivíduos imunocomprometidos (diabéticos, transplantados, com neoplasias, neutropénicos, sob quimioterapia ou corticoterapia). Entre os factores de virulência há a destacar: “slime” (matriz polissacarídea produzida pela bactéria para o exterior – existe em todos os SCN mas principalmente em S. epidermidis) – funciona como “cola” ligando as células entre si e ao material inerte (ex: superfície de dispositivos médicos de plástico) facilitando a colonização e impedindo a acção dos mecanismos de defesa do hospedeiro e dos antimicrobianos; cápsula ; ácido teicóico ; catalase. Exemplos de espécies de SCN S. epidermidis (mais frequente); S. saprophyticus (associado a infecções urinárias em mulheres jovens sexualmente activas devido à capacidade que esta bactéria tem de se ligar ao epitélio da uretra e da bexiga); S. haemolyticus (particularmente resistente aos anti-microbianos); S. lugdunensis  ; S. schleiferi; S. capitis; S. hominis; S. warneri. Doenças Associadas Endocardite (principalmente em próteses valvulares); Infecções de catéteres e shunts; Infecções de próteses osteoarticulares; Infecções urinárias ( S. saprophyticus). VIII. Distinção entre Staphylococcus aureus e Staphylococcus Coagulase Negativos No diagnóstico laboratorial de infecções por Staphylococcus spp. podem utilizar-se quatro tipos de métodos: Exame directo; Exame cultural; Testes serológicos; Provas bioquímicas.  Os testes serológicos não se encontram, actualmente, implementados na prática laboratorial, limitando-se a sua utilização à investigação em Microbiologia. Na distinção entre S. aureus e SCN o exame microscópico (coloração pelo método de Gram e observação microscópica) não é útil, já que ambos se apresentam como cocos Gram positivos dispostos em cacho, sem qualquer diferença evidenciável. Desta forma o diagnóstico diferencial entre estes agentes apoia-se apenas no exame cultural e nas provas bioquímicas. Exame cultural Meio de gelose de sangue As colónias de S. aureus em meio sólido de gelose de sangue podem apresentar pigmentação amarelada (especialmente se incubadas à temperatura ambiente), são lisas, circulares, opacas, ligeiramente elevadas e com frequência hemolíticas. As de SCN não apresentam pigmento, são brancas (daí a denominação alternativa dos SCN como «estafilococos brancos»), lisas e opacas. Apenas as colónias de S. haemolyticus apresentam hemólise. Meio de manitol salgado ou de Chapman Este meio selectivo e diferencial contém manitol, uma elevada concentração de NaCl e um indicador de pH (vermelho de fenol). A elevada concentração de NaCl inibe o crescimento da maioria dos microrganismos à excepção dos Staphylococcus spp. Por outro lado o meio permite a diferenciação entre S. aureus e SCN já que as colónias de S. aureus ficam envolvidas por um halo amarelado devido à acidificação do meio devido à fermentação do manitol (o meio “vira” para amarelo). Pelo contrário os SCN não fermentam o manitol (à excepção de certas estirpes de S. saprophyticus) ficando o meio com a cor original (vermelho). Provas bioquímicas Prova da coagulase A coagulase é uma enzima termo-estável que coagula o plasma na ausência de Ca 2+ e é usada para diferenciar S. aureus dos outros estafilococos. Também se encontra em S. intermedius (causa de infecção nos animais, pouco frequente no Homem e, nesses casos, habitualmente associado a feridas por mordedura de cão) e S. hyicus (raramente associado a infecção humana). Procedimento: dissolver uma colónia em estudo num tubo com 0,5 mL de plasma de coelho com EDTA (quelante do cálcio); incubar a 35-37ºC; após 4 horas de incubação e sem agitar o tubo, verificar se existe formação de coágulo; a ausência de coágulo implica a reincubação do tubo e novas observações às 6 e 24 horas de incubação. Um teste é positivo quando se observa a formação de um coágulo (alguns isolados formam o coágulo entre as 4 e as 6 horas que entretanto lisa e é negativo ao fim de 24 horas). Assim, na prova da coagulase em tubo, entre as espécies de Staphylococccus spp. habitualmente patogénicas no Homem, apenas S. aureus se apresenta como coagulase positivo. Os restantes estafilococos medicamente importantes são coagulase negativos. No caso de se realizar a prova da coagulase em slide esta também pode ser positiva para S. schleiferi e S. lugdunensis. Prova da DNAse A DNAse é uma nuclease termoestável que diversas espécies bacterianas possuem e que permite hidrolisar o ácido desoxirribonucleico. É também usada para diferenciar S. aureus de outros estafilococos. Procedimento: com uma ansa tocar numa colónia em estudo e semear numa placa com meio de cultura contendo ácido desoxirribonucleico; incubar durante 18-24 horas a 35-37ºC; inundar o meio com ácido clorídrico que funciona como revelador ao precipitar o ADN não hidrolisado. O teste é positivo quando se observa um halo transparente em volta da zona de crescimento bacteriano. O restante meio apresenta-se mais opaco devido à precipitação do ADN provocada pelo ácido. Nesta prova o único estafilococo habitualmente pato génico no Homem que se apresenta DNAse positivo S. aureus. Entre os restantes também S. intermedius, S. hyicus e S. schleiferi o podem ser. As restantes espécies de Staphylococcus spp. são DNAse negativas. IX. Teste de Susceptibilidade aos Anti-Microbianos Teste de susceptibilidade aos anti-microbianos (TSA) deve realizar-se para qualquer microrganismo que seja responsável por um processo infeccioso e que necessite de terapêutica antibiótica, sempre que a susceptibilidade não puder ser previsível pelo conhecimento da identidade do microrganismo. A sua realização também se aplica sempre que um determinado anti-microbiano (cuja eficácia sobre o microrganismo em causa seja bem conhecida) não pude r ser utilizado (exs: alergias a fármacos, grávidas ). De uma forma geral existem 3 tipos de TSA: testes de diluição; testes de difusão; testes de gradiente de difusão. Os testes de diluição (os primeiros a serem utilizados) podem ser realizados em meios líquidos ou sólidos e permitem o conhecimento da concentração inibitória mínima (CIM) de determinado microrganismo para um ou vários anti-microbianos. Os testes de difusão são os mais utilizados na prática laboratorial e permitem apenas classificar a susceptibilidade do microrganismo aos antibióticos em causa em 3 grupos: sensível, resistente ou intermédio. Os testes de gradiente de difusão ( ε-test) permitem combinar os princípios dos dois métodos anteriores, utilizando tiras próprias com concentrações seriadas de um anti-microbiano. Testes de difusão O teste de difusão é habitualmente realizado pelo método de Kirby-Bauer, que permite obter um resultado qualitativo que se baseia na relação entre os valores da CIM e os níveis terapêuticos dos anti-microbianos atingido no organismo humano. Princípio  Um inóculo do microrganismo é aplicado na superfície de uma placa de Mueller-Hinton, onde se colocam discos impregnados de anti- microbianos; Após incubação de 16-18 horas são medidos os diâmetros dos halos de inibição de crescimento para cada disco; O diâmetro do halo é inversamente proporcional à C IM do microrganismo e, baseando-se nas tabelas do NCCLS, obtém-se um resultado qualitativo que se exprime em sensível, resistente ou intermédio. Indicações do método e selecção dos anti-microbianos Este método é indicado para vários microrganismos, entre os quais se encontram Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, Acinetobacter spp., Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus spp. e V. cholerae. O teste deve ser feito a partir de uma cultura pura de um destes microrganismos, não se aplicando a microrganismos de crescimento lento ou que requerem enriquecimento especial dos meios de cultura. A selecção dos anti-microbianos a testar é feita por cada laboratório em conjunto com comissões hospitalares indicadas para esse efeito. As tabelas do NCCLS poderão servir como indicação para esta escolha. Procedimento Retirar 4 a 5 colónias bem isoladas e morfologicamente semelhantes do meio de cultura e inocular em solução de NaCl a 0,85%; Agitar para homogeneizar;  Rodar uma zaragatoa esterilizada na suspensão e retirar o excesso de líquido; Aplicar a zaragatoa no meio de cultura, garantindo a distribuição uniforme do inóculo; Aplicar os discos através de pinça esterilizada com ligeira pressão; Incubar a 35º C em aerobiose, durante 16-18 horas (24 horas em algumas situações); Ler as placas (medindo as dimensões dos halos de sensibilidade) e, por comparação com as tabelas do NCCLS, obter o resultado. Terapêutica e Padrão de Susceptibilidade aos Anti-Microbianos em Staphylococcus spp. Há cerca de 60 anos, quando a penicilina foi introduzida na terapêutica anti-microbiana, todos os Staphylococcus spp. eram sensíveis a este fármaco. Actualmente, mais de 90% das estirpes de Staphylococcus spp. são resistentes à penicilina por produção de -lactamase ou penicilinase (mecanismo de transmissão plasmídica), uma enzima produzida por determinadas bactérias que degrada o anel -lactâmico das penicilinas inactivando o antibiótico antes de este poder actuar. Na década de 60, surgiram as isoxazolilpenicilinas ou “penicilinas resistentes às penicilinases” (ex: meticilina, oxacilina, nafcilina, dicloxacilina e flucloxacilina) que são um grupo de penicilinas que têm o anel -lactâmico protegido, não sendo susceptível à acção das -lactamases. Estas penicilinas semi-sintéticas são especificamente utilizadas para tratar infecçõe s estafilocócicas. Por volta dos anos 70/80 começaram a surgir níveis preocupantes de resistência à meticilina, mais frequentemente nos casos associados a infecção nosocomial. O mecanismo de resistência é diferente, não por inactivação enzimática, mas sim por alteração d o alvo: as proteínas da parede celular da bactéria onde a meticilina se vai ligar, denominadas PBPs (“penicillin-binding proteins”). Este mecanismo tem transmissão cromossómica associada ao gene mecA, proveniente da espécie de estafilococos mais abundante na Terra (S. sciuri), que codifica uma nova PBP designada PBP2a a que os -lactâmicos não têm a capacidade de se ligar. Estas bactérias denominam-se resistentes à meticilina (o paradigma do grupo farmacológico) e são resistentes aos outros -lactâmicos (ex: cefalosporinas) e habitualmente resistentes a outras famílias de anti- microbianos (ex: macrólidos, tetraciclinas, aminoglicosideos e quinolonas). Actualmente cerca de 30 a 50% das estirpes de S. aureus e 50% dos SCN são resistentes à meticilina. Os S.aureus meticilino-resistentes (MRSA) são, habitualmente, sensíveis aos glicopéptidos (exs:vancomicina e teicoplanina), anti-microbianos que também actuam na síntese da parede celular. Desde 1997 têm surgido, esporadicamente, relatos de casos de susceptibilidade diminuída à vancomicina (S. aureus com resistência intermédia à vancomicina – VISA, com CIM = 8-16 mg/L) e, mais recentemente, com início em 2002, surgiram os primeiros casos, altamente preocupantes de S. aureus resistentes à vancomicina (VRSA, com CIM > 32 mg/L). A resistência de alto nível à vancomicina é da responsabilidade do gene vanA, conhecido há vários anos em Enterococcus spp. Este gene é responsável pela alteração do alvo do anti-microbiano ao substituir o dímero D-alanina-D-alanina por um dímero D-alanina-D-lactato, impedindo a acção da vancomicina. Este facto é ainda mais alarmante já que, ao haver capacidade de transferência genética artificial entre géneros tão distintos como Enterococcus spp. e Staphylococcus spp., parece inevitável a emergência de uma bactéria altamente virulenta e praticamente intratável. De uma forma simplificada, as opções terapêuticas actuais são: Estirpes sensíveis à penicilina – penicilina G; Estirpes MSSA – oxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina; Estirpes MRSA – vancomicina, teicoplanina; Estirpes VISA – vancomicina ou teicoplanina em dose elevada; Estirpes VRSA – linezolido, co-trimoxazol, quinopristina-dalfopristina, daptomicina, tigeciclina. 4º Capítulo Meningite I. Noções Gerais Sobre Infecções do Sistema Nervoso Central As infecções do Sistema Nervoso Central (SNC) são pouco frequentes mas encontram-se entre os principais problemas na prática médica devido às el evadas taxas de mortalidade e morbilidade que se lhes associam. O cérebro e a medula espinhal são estruturas simultaneamente bem protegidas e altamente vulneráveis. Se, por um lado, o SNC é anatomicamente protegido do exterior por ossos e membranas, por outro, estando contido num espaço limitado, os efeitos das infecções tendem a ser ampliadas, de tal forma que uma pequena inflamação pode causar lesão significativa. Também a nível fisiológico se pode observar esta dualidade já que a barreira hemato-encefálica (BHE) , do mesmo modo que inibe a passagem de microrganismos e substâncias tóxicas para o cérebro e líquido céfalo-raquidiano (LCR), impede também a passagem dos elementos de defesa humoral e celular do sangue para essas mesmas estruturas e, também, de diversos anti-microbianos, diminuindo muitas vezes as opções terapêuticas disponíveis. Classificação das infecções do SNC As infecções do SNC podem ser classificadas de acordo com a localização envolvida. Assim temos: Encefalite – infecção do parênquima cerebral; Meningite – infecção das meninges; Mielite – infecção da medula espinhal.  As encefalites são exclusivamente provocadas por vírus e podem ser agudas ou crónicas. Como agentes comuns de encefalite aguda temos: Arbovírus (exs: vírus do Nilo Ocidental, vírus da encefalite japonesa, etc); Vírus herpes simplex (HSV) tipo 1 e tipo 2; Vírus varicela zoster (VZV); Enterovírus (vírus Coxsackie A e B, echovírus, etc). Os agentes mais frequentes de encefalite crónica são o vírus JC (agente da leucoencefalopatia multifocal progressiva), o vírus do sarampo (que pode provocar pan- encefalite esclerosante subaguda) e o vírus da rubéola (que pode originar a rubéola pan-encefalítica progressiva nos doentes com rubéola congénita). As meningites, tema da 8ª aula prática de Microbiologia, serão abordadas em maior pormenor de seguida. As mielites habitualmente surgem em simultâneo com os outros quadros clínicos. Além destas infecções podem ainda ocorrer abcessos cerebrais e epidurais e empiemas sub-durais. Os abcessos cerebrais designam infecções localizadas do parênquima cerebral, provocadas por bactérias, fungos ou parasitas, e limitadas por uma cápsula vascularizada. Quando esta cápsula não está presente pode usar-se o termo “cerebrite”. O abcesso epidural localiza-se entre a dura-máter e a tábua interna da caixa craniana. Um empiema sub-dural é, como o nome indica, uma colecção de pús no espaço entre a dura-máter e a aracnóide. Estas três infecções surge m frequentemente associadas e como consequência de infecções em locais anatómicos próximos (por exemplo sinusite, otite média, mastoidite, etc) ou após traumatismos ou procedimentos invasivos da cavidade craniana. Os agentes etiológicos mais frequentes em todos os casos são várias bactérias, tais como Streptococcus spp., Pseudomonas spp., S. aureus e enterobacteriáceas. Frequentemente ocorrem infecções que afectam mais de uma localização do SNC. Entre estas as mais frequentes são as meningo-encefalites que afectam a s meninges e o parênquima cerebral. Ocorrem ainda encefalo- mielites (parênquima cerebral e medula espinha), encefalo-mielo-radiculites (parênquima cerebral e raízes nervosas), etc. II. Classificação e Etiologia das Meningites As infecções das meninges podem ser provocadas por todo o tipo de microrganismos (vírus, bactérias, parasitas e fungos) e classificam-se, de acordo com critérios temporais, em: agudas – estabelecimento do quadro num período máximo de 1 semana, com duração total inferior a 4 semanas; subagudas – estabelecimento superior a 1 semana e duração inferior a 4 semanas; crónicas – duração superior a 4 semanas. Do ponto de vista clínico as características das meningites subagudas e crónicas são praticamente indistinguíveis. Em relação à etiologia, os agentes mais frequentes de meningite subaguda são: Mycobacterium tuberculosis; Cryptococcus neoformans; Histoplasma capsulatum; Coccidioides immitis; Treponema pallidum.  Estes microrganismos são também agentes frequentes de meningite crónica. Nesta circunstância pode-mos também considerar como possíveis agentes: Borrelia burgdorferi; Candida spp.; Aspergillus spp.; Toxoplasma gondii; Trypanossoma brucei; Taenia solium (na forma quística provocando Cisticercose); Vírus da papeira; Vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV); Echovírus; Vírus da imunodeficiência humana (HIV); Vírus herpes simplex (HSV) tipos 1 e 2. Finalmente a meningite aguda pode ser dividida em dois grandes grupos consoante os agentes etiológicos. Por um lado temos a meningite aguda viral que ocorre tipicamente em associação com a encefalite, constituindo uma meningo-encefalite viral. Este quadro é m