Métodos de Investigação em Microscopia PDF - 2024

2024 Métodos de Investigação em Microscopia MESTRADO EM BIOQUÍMICA MARIA PIRES  Página |1 Técnicas de Investigação em Microscopia Enquadramento histórico Microscópio – instr...

2024 Métodos de Investigação em Microscopia MESTRADO EM BIOQUÍMICA MARIA PIRES  Página |1 Técnicas de Investigação em Microscopia Enquadramento histórico Microscópio – instrumento para tornar pequenos detalhes visíveis. Microscopia – ciência que estuda e realiza aplicações utilizando o microscópio para observar objetos células, entre outros com dimensões invisíveis a olho nu. Microscópio (1624) – é um termo grego que vem de “mikros” (pequeno) + “skopein” (ver/examinar) e permitiu destruir a teoria da geração espontânea. Foi denominado por Johann Giovanni Faber e Bamberg em Itália. Pedra de leitura (1000 AC) – cristal de rocha conhecido como lente de Lanyard datado de 721 AC. Acredita- se ter sido a primeira lente criada pelo homem. Só mais tarde se inventaram os óculos em 1280. Microscópios primordiais (1500) – Zacharias Janssen e o seu filho Holland que eram produtores de óculos fabricaram os primeiros microscópios. Este microscópio era capaz de aumentar imagens 3 vezes mais quando fechados e 10 vezes estendido ao máximo. Princípio dos microscópios compostos As lentas dos microscópios funcionam da mesma forma que as lentes dos nossos olhos sendo convergentes. Microscópios vs telescópios A diferença entre estes 2 instrumentos é que o microscópio tem mais uma lenta na direção oposta ao olho mais próximas do objeto a observar e como tal permite focagem num ponto mais perto. Assim colocando uma lente de distância focal curta à frente de um telescópio obtemos um microscópio. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  Página |2 Século XVII – a palavra microscópio tornou-se oficial pelos membros da academia Lincei. Mais tarde em 1631 na Alemanha surgiu o primeiro microscópio com um tripé que aumentava a estabilidade sendo que o primeiro modelo data de 1683 pelo microscopista John Yarwell. Marcello Malpighi (1628-1694) – era um professor de medicina e anatomista considerado o pai da embriologia e histologia primordial que observou capilares em 1660, secções de madeira e fez as primeiras considerações sobre o desenvolvimento de sementes. Robert Hooke (1653-1703) – publicou o livro micrografia em 1665 no qual concebeu o microscópio composto. A sua observação mais famosa foi de um estudo de fatias de madeira às quais chamou células. A micrografia também incluía a teoria de onda de luz que comparava a dispersão de vibrações de luz às ondulações das ondas de água. Antioni Van Leeuwenhoek (1632-1723) – um mercador na Holanda que criou um microscópio simples que aumentava 275% e permitiu a publicação de desenhos de microorganismos em 1683. Ele foi incorretamente chamado o inventor do microscópio. Este microscópio atingiu um aumento de 200 vezes com lentes simples, no entanto os microscópios compostos apenas aumentavam 20-30 vezes a imagem. Isto permitiu a descoberta de bactérias, protistas livres e parasitas, células de esperma, células sanguíneas e nematodes microscópicos. Em 1973, Leeuwenhoek começou a escrever letras à sociedade real de Londres e em 1680 foi elegido como membro. Século XVIII – em 1742 os microscópios que projetavam imagens eram um sucesso sendo uma forma de entretenimento. As melhorias nos microscópios foram a estabilidade, precisão do foco e condições de manuseio. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  Página |3 Século XIX – novas técnicas de manufaturação de lentes. Começaram a ser usados espelhos curvos para melhorar o foco. Em 1840 os estados unidos começaram a fabricar microscópios, o que antes estava restrito a Inglaterra. Em 1880, os microscópios óticos chegaram a uma resolução de 0,2 m que se mantém até hoje. Aberração esférica As lentes devido à aberração esférica levam a que os raios se foquem em pontos diferentes do eixo ótico, como tal as lentes perfeitas sem aberração esférica têm todos os raios focados no mesmo ponto do eixo ótico. Este problema foi resolvido em 1830 por Jackson Lister matematicamente e publicou-o na revista Philosophical Transactions. A sua descoberta levou a que se soubesse que a forma esférica das lentes causava a aberração esférica. Nas aberrações esféricas, os raios paralelos passam pela região central das lentes focam mais longe que os raios que passam nas extremidades das lentes. Isto resulta em vários pontos de foco que produzem uma imagem desfocada. Para se obter uma imagem clara, todos os raios precisam de focar no mesmo ponto. Charles Sédillot (1878) – definiu a palavra micróbio (vem do grego mikrobios que significa vida curta). A palavra microorganismos tem origem em mikrós que vem de pequeno e organisme de organismos. Ernest Abbe and Carl Zeiss (1877) – publicaram um artigo que definia as leis da física que determinavam a distância resolvente de uma objetiva. Conhecida como a lei de Abbe, a distância mínima resolvente é relacionada com o comprimento de onda dividido pela abertura numérica que é proporcional ao angulo do cone de luz formado por um ponto num objeto para a objetiva. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  Página |4 Resolução A resolução de um microscópio ótico é definida pela distância mínima entre 2 pontos num espécime que podem ser distinguidos pelo observador como entidades separadas. Dr Otto Schott (1886) - formulou as lentes de óculos que coloram corretamente e produziu as primeiras objetivas apocromáticas. Com as lentes corrigidas para 2 cores como azul e vermelho temos lentes acromáticas. Se forem otimizadas para luz azul, verde e vermelha e falamos de correção apocromática. Henri Hureau de Sénarmont – era um professor de mineralogia em Paris que criou o compensador de retardação de luz polarizada com o seu nome. O aparelho consiste na incidência de luz não polarizada que passa pelo polarizador que é transmitida a um prato de retardação de um quarto do comprimento de onda que faz com que a luz sai circularizada e polarizada. A polarização da luz permite que quando há uma forte intensidade da luz se consiga ver em profundidade por exemplo as pedras dentro de um rio. William Hyde Wollaston – fez várias invenções em ótica incluindo o prisma de Wollaston que é fundamentalmente importante na interferometria e na microscopia de contraste de inferência diferencial. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  Página |5 O prisma foi inserido nas objetivas e também no condensador. George Normarski – deu uma grande contribuição para a microscopia de contraste de interferência diferencial que também pode ser referida como contraste de interferência de Normaski que é usado para estudar amostras biológicas e tecidos não suportados. August Kohler – definiu as regras de correção de luz do objeto. O objeto é uniformemente iluminado e sem brilho, o que permite obter um maior potencial do microscópio. O objeto é uniformemente iluminado pelo condensador e com campo fechado. Além disso há um bom ajustamento de resolução e bom contraste pelo condensador e abertura de campo. Século XX Houve um grande avanço em ambos os microscópios e nas técnicas de observação. Durante este século surgiu o microscópio de fase de contraste, microscópio de contraste de interferência diferencial, microscópio de polarização e microscópio de epifluorescência com espelhos dicromáticos. Marvin Minsky - O modelo confocal ótico permite uma focagem extremamente precisa e elevada capacidade de magnificação. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  Página |6 Ernest Ruska – inventou o microscópio eletrónico nos anos 30. Este levou as observações a um nível inimaginável na altura: o nível atómico. Assim aumentou a magnificação 1 milhão de vezes usando colunas de eletrões e lentes eletromagnéticas em vez de lentes de vidro ou luz. Os princípios básicos desta microscopia é a transmissão (observação de cortes ultrafinos), digitalização (para observação de superfície) e efeito de túnel (visualizar átomos). Microscopia crio-eletrónica (2017) Esta descoberta permitiu a determinação da estrutura de biomoléculas em solução com elevada resolução. Esta técnica permite ver a estrutura intrínseca de proteínas, ácidos nucleicos e outras biomoléculas e também estudar como se movem e mudam ao fazer as suas funções. Primeiro a amostra é transferida para uma rede de metal e o excesso de material é removido. Depois a amostra forma um pequeno filme pelos buracos da rede quando é emergido em etano a -190ºC. Assim a água vitrifica à volta da amostra que depois é congelada por nitrogénio líquido durante as medições em microscopia eletrónica. LUPA Também designada magnifying glass ou estereomicroscópio. Esta permite a observação de material em 2 ou 3 dimensões em profundidade. Tem lentes acromáticas que dão imagens com um bom contraste ou lentes aplanéticas que distorção de imagens. Permite uma magnificação de 10 vezes e tem duas fontes de luz, uma platina preta ou transparente e magnificação de 10 a 80 vezes. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  Página |7 Processamento de amostras para microscopia ótica Recolha Primeiro é necessário fazer a colheita do material a analisar sendo que é necessário retirar tecido de modo a analisar não só a area que se pensa estar afetada por exemplo na pele, mas também a zona periférica. No caso de ser recolha de por exemplo em órgãos aos pares como rins, pulmões e mamas tem de haver sinalização que qual é o esquerdo ou direito e também a sua orientação no corpo. Fixação Normalmente é necessário colocar em fixador durante 16 horas a temperatura ambiente ou 24 horas a 4ºC dependendo no tipo de tecido e no tamanho de peças biológicas. Existem vários fixadores para tecidos animais: formol ou formaldeídos 4-10% e bouin (ácido pícrico, formol e ácido acético). Para tecidos vegetais, o FAA (etanol, ácido acético, formol e água destilada) e carnoy (etanol absoluto, clorofórmio e ácido acético). Além disso pode haver fixação por:  Fixadores de aldeídos – formaldeído, glutaraldeído e paraformaldeído comercial;  Agentes oxidantes – tetróxido de ósmio, dicromato de potássio, permanganato de potássio e ácido crómico;  Agentes coagulantes ou desnaturantes de proteínas – metanol, etanol, acetona e ácido acético;  Mecanismo desconhecido – cloreto de mercúrio, ácido pícrico e sais de zinco;  Combinação de reagentes – tetróxido de ósmio e glutaraldeído, tetróxido de ósmio e iodeto de zinco, glutaraldeído e carboamida e formaldeído com glutaraldeído;  Fixação seca – cera de carbono 6000 (20% polivinil álcool ou 20% polietileno glicol) ou fixação a vapor;  Micro-ondas – fixação por ondas eletromagnéticas com ou sem o uso de agentes fixadores. Lavagem Poderá ou não ser feita. Desidratação Para diminuir a percentagem de água na amostra começamos por colocar em etanol 50%, 75%, 90%, 95% e ainda mais duas passagens em etanol absoluto. Depois passa-se por xilol ou ainda antes com misturas etanol- xilol. Neste caso é necessária uma hora por passo em tecido animal e mais tempo para tecido vegetal. Impregnação e inclusão Colocar em parafina, começando com banhos com uma mistura de parafina e xilol e finalmente colocar em parafina pura demorando cada banho cerca de uma hora para tecidos animais e tempos prolongados para plantas. Corte no micrótomo Primeiro o bloco tem de ser aparado até se chegar ao espécime e encontrar uma zona onde se consiga obter o máximo de tecido para analisar e depois os cortes são colados num banho de água a temperatura ambiente para se colocar os cortes na lâmina. Posteriormente passou-se verticalmente a lâmina num banho de água quente para derreter a parafina e esticar a amostra na lâmina não permitindo a formação de rugas. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  Página |8 Corte no criostato Uma outra alternativa para se formar um bloco suficientemente rígido para fazer cortes é congelar o tecido a baixas temperaturas e fazer cortes no criostato. Corte no vibratomo É muito semelhante ao micrótomo, mas usa uma lâmina que vibra e a amplitude de vibração, velocidade e angulo da lâmina pode ser controlado. A lâmina vibratória ajuda na minimização de danos e na preservação de estruturas delicadas já que reduz a força aplicada ao tecido. Neste caso o tecido fixado ou fresco precisa de ser embebido em agarose a baixas temperaturas. Benefícios  Não é necessário desidratar os tecidos antes da incorporação diminuindo a perda de constituintes celulares;  Permite incorporação em agarose para dar estabilidade no corte;  Evita-se artefactos derivados de cristais de gelo ou pela embebição em parafina;  Não é necessário haver diafanização e reidratação antes da coloração;  Não há elevadas temperaturas e tratamentos químicos agressivos que levem a instabilidade antigénica;  Diminui a autofluorescência devido a fixação por formaldeído com menor tempo;  Permite a espessura desejada para microscopia confocal. Desvantagens  Os cortes são mais delicados e por isso mais difíceis de manusear;  O posicionamento na lamina é mais difícil;  Penetração de anticorpos e outros reagentes podem ser mais lentos levando a maiores tempos de incubação;  Pode dificultar a aquisição de imagens e fotografar com o microscópio. Plano de corte Os cortes poderão ser transversais, oblíquos e longitudinais, sendo, portanto, necessário ter uma orientação do órgão para que depois de possam retirar conclusões acerca do que se observou. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  Página |9 Remoção da resina/parafina Dissolução da parafina em xilol durante aproximadamente 10 minutos. Reidratação Usa-se uma serie decrescente de concentração em álcool começando por etanol absoluto, etanol 95%, 90%, 75% e 50% e finalmente água. Este passo é importante para que seja possível colorar a amostra já que estas são mais compatíveis com soluções aquosas. Coloração A coloração mais comum é hemalumen-eosina (H&E) que se baseia nas propriedades ácido base das células. No entanto pode haver coloração com tintas naturais e artificiais (derivados de benzeno). H&E O hemalumen é um corante básico que colora os núcleos (contêm ácidos nucleicos sendo basofílicos) e, portanto, também pode ser denominado de acidófilo. Já a eosina é um corante ácido que cora as proteínas (componentes básicos) e pode ser chamado de basofilíco. Desidratação É levada a cabo por passagens por concentrações crescentes de álcool começando por álcool 50%, 75%, 90%, 95% e finalmente etanol absoluto. Diafanização De seguida coloca-se em xilol para que depois haja compatibilidade com as resinas de montagem. Montagem Colocar resinas naturais (Canada Balsam) ou sintéticas (DPX e Entellan) por cima do tecido para que depois se possa colocar a lamela. Rotulagem Identificar a origem da amostra, ou seja, órgão, orientação, data de preparação e código de serie. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 10 Microarray Consiste em blocos de parafina em que 1000 peças de tecido são montadas numa matriz permitindo uma análise histológica múltipla. Esta técnica foi desenvolvida para facilitar quando há reagentes de diagnostico limitados e o tamanho da amostra também. O procedimento consiste numa agulha usada para remover pequenas partes do tecido de regiões de interesse embebidas em parafina que depois são inseridas num recipiente com um matriz padrão. As secções do bloco são cortadas com micrótomo montadas numa lamina e analisadas por métodos padrões de histologia (imunohistoquímica e fluorescência em hibridização in situ. São úteis em análise de biopsias clínicas e espécimes de cancro. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Quando há testagem de fármacos é necessário ter em conta as reações dependendo do tipo de toma já que esta pode ser tópica, oral, endovenosa e peritoneal. Como tal por norma observa-se uma reação inflamatória indicada pela presença de células sanguíneas. Dentro destas células temos eritrócitos, trombócitos e leucócitos. No caso dos leucócitos temos uma divisão em agranulócitos que contêm os monócitos e linfócitos enquanto os granulócitos contêm eosinófilos (grãos básicos que são acidofílicos e são corados com eosina), basófilos (grãos ácidos corados com hemalumen que é básico) e os neutrófilos (têm componentes básicos e ácidos). ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Microscópio ótico O microscópio ótico é composto por uma parte estrutural e uma parte ótica. Começando pela iluminação é necessário considerar:  Filtro azul – filtra comprimentos de onda maiores (vermelho) sendo uma barreira para calor (luz amarela). Além disso é necessário considerar a distância focal que é a distância entre a objetiva e o espécime. As lentes podem ser apocromáticas corrigindo as aberrações esféricas tendo CaF2. Existem também objetivas telescópicas que são as de x40 e x100 que se retraem em contacto com a lamina a observar. Considerando a trajetória da luz vemos que no caso de uma imagem real e virtual temos algumas diferenças: Imagem real Imagem virtual  Apresenta 3 trajetórias da luz;  A luz passa no centro ótico sem qualquer 1. Paralela que se desvia para passar desvio; no foco;  Paralelo ao centro ótico e na lenta passa ao 2. A que passa no centro sem sofrer foco; desvios;  Ponto de foco antes e depois. 3. Passa fora da objetiva;  Imagem invertida. Há um ponto de interseção atrás do objeto Podemos ter aberrações na cor e esféricas, o que normalmente é corrigido com o uso de fluoreto de cálcio que corrige o ângulo do comprimento de onda e forma 2 cores distintas. As lentes apocromáticas corrigem MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 11 3 juntas para uma cor só. Além disso as correções destes problemas implicam mais lentes e melhor vidro. Isto poderá também ser influenciado pelo óleo de imersão. Determinação do coeficiente micrométrico O objetivo da determinação do coeficiente é verificar a correlação entre os valores do micrómetro da objetiva e os valores do micrómetro da ocular para diferentes objetos. A escala micrométrica da objetiva coloca-se na platina e tem uma medição que vai de 0-2 mm, enquanto o micrómetro da ocular tem uma escala com 100 divisões. Como calcular? Ajustar as escalas para que o valor inicial (0) das duas escalas coincida. Depois vão ser registadas 3 correspondências exatas entre as escalas para cada objetiva. Objetiva x4 Objetiva x10 Objetiva x40 Objetiva x100 Divisões Objetiva Divisões Objetiva Divisões Objetiva Divisões Objetiva ocular mm ocular mm ocular mm ocular mm 4 0,1 10 0,10 4 0,01 10 0,01 57 1,45 15 0,15 24 0,04 20 0,02 65 1,75 25 0,25 16 0,06 30 0,03 Depois tendo em conta que 1 mm = 1000 m, podemos então calcular o coeficiente para cada ponto: Objetiva x4 Objetiva x10 Objetiva x40 Objetiva x100 Coeficiente Coeficiente Coeficiente Coeficiente micrométrico micrométrico micrométrico micrométrico 24,1 10 2,5 1 25,4 10 2,5 1 26,9 10 2,5 1 Média dos coeficientes micrométricos Objetiva x4 Objetiva x10 Objetiva x40 Objetiva x100 25,4 10 2,5 1 Normalmente para objetivas de x100 usamos os coeficientes obtidos na x40 e x10: Abaixo temos então o valor de cada divisão no micrómetro da ocular e isto permite medir o tamanho de uma célula já que podemos multiplicar o número de divisões pelo coeficiente micrométrico. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 12 Microscopia ótica – transmissão de luz A objetiva é um componente essencial do microscópio e é muito mais do que uma única lente que amplifica a imagem para a magnificação selecionada. Na objetiva temos indicado o seu tipo (apocromática), código, meio de imersão (óleo, glicerol ou água), correção colar e lentes. As objetivas modernas são compostas por múltiplas lentes que corrigem as aberrações óticas que ocorrem quando a luz passa através da objetiva. Assim podemos ter diferentes tipos de lentes:  Acromática – desenhada para prevenir distorção de cores;  Fluorite – mineral ideal para corrigir as aberrações cromáticas;  Apocromática – lentes fotográficas com melhor correção cromática e aberração esférica. Normalmente estas objetivas têm lentes duplas, lentes triplas e lentes do menisco e de frente. Porque se usam tantas lentes, o que ocorre na passagem da luz e como se obtém a imagem do microscópio? Não é possível focar o campo inteiro ao mesmo tempo e como tal objetos no centro nunca têm o mesmo foco que os das extremidades e isto leva à produção de uma imagem com curvatura devido à superfície curva das lentes (efeito saída do eixo); Um foco desigual da luz monocromática devido à curvatura das lentes leva a um foco diferencial dos raios periféricos e axiais e a imagem aparece nebulosa ou marginalmente fora de foco. Se a objetiva estiver correta pode verificar-se a adesão da lâmina e incompatibilidade do índice de refração; MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 13 Assim em lentes não corrigidas iremos ter uma sobreposição de cores no eixo Z, enquanto que as lentes corrigidas em relação a aberrações cromáticas permitem claramente distinguir as tonalidades. Assim as objetivas poderão ter diferentes lentes com o objetivo de corrigir curvatura, aberrações esféricas e cromáticas. O seu preço aumenta com o nº de lentes e correções. Como escolher a objetiva? Se quiser uma objetiva 40x é necessário saber como escolhe-la já que há data de 2020 havia 99 objetivas 40x. Para tal podemos ter em conta os diferentes parâmetros:  Magnificação;  Abertura numérica;  Distância livre de trabalho;  Planaridade do campo;  Correção de cor;  Transmissão;  Adequada para algumas técnicas de contraste;  Imersão;  Espessura da lamela. Microscopia Ótica A microscopia de transmissão de luz é um grupo de técnicas da microscopia ótica que pressupõe a passagem da luz (transmissão da fonte às lentes). Este método é usado para distinguir as características morfológicas e propriedades óticas do material observado. Além disso, permite um canal extra que permite colorações fluorescentes e é importante devido à baixa energia utilizada sendo particularmente adequados para visualização ao vivo. Usando o modo de campo claro poderemos sentir falta de detalhe devido à falta de estruturas das características da amostra. Como tal, para visualizar algumas amostras ou espécimes como bactérias, células vivas aderentes ou laminas com tecidos finos, os investigadores usam outras técnicas de microscopia ótica que aumentam o contraste nestas amostras quase transparentes. Poderemos ter diferentes tipos de microscopia entre os quais:  Campo claro;  Campo escuro;  Contraste de fase;  DIC ou contraste diferencial de interferência. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 14 Campo claro Neste caso o contraste é determinado pelas diferenças na absorção de luz, índice de refração ou cor. O contraste é adquirido assim que a luz passa pelo espécime alterando a sua direção. Esta técnica é muito utilizada em espécimes corados com corantes que absorvem luz como hematoxilina e eosina. As vantagens da microscopia de campo claro são:  A ótica não muda a cor das estruturas observadas. Muitas vezes os corantes são usados para tornar visíveis algumas estruturas (a cor não se altera);  A ótica de campo claro é mais barata que a de contraste de fase;  Requer poucos ajustes antes da observação do espécime. Campo escuro O princípio é semelhante ao da formação de um eclipse em que a lua é bloqueada e as estrelas aparecem visíveis. O fundo escuro aumenta a visibilidade de objetos mais claros. As amostras de campo escuro podem ser facilmente visualizadas sem usar qualquer coloração. Comparando o campo escuro com campo claro verifica-se que no primeiro caso a onda resultante do espécime muito semelhante ao da onda difratada e é eliminada a onda de fundo não difratada, no segundo caso há semelhança com a onda de fundo não difratada. Antes do condensador há uma paragem de campo e assim apenas a luz difratada entra na objetiva e tudo o resto é mostrado como um fundo preto. O campo escuro é usado para uma magnificação baixa (objetiva 40x), visualizar tudo numa amostra líquida, resíduos e tudo, visualizar partículas de pó pequenas ou células em suspensão, obter um plano focal correto numa baixa magnificação para espécimes pequenos e com baixo contraste. Contraste de fase O seu desenvolvimento por Fritz Zernike em 1953 foi mais tarde premiado com um nobel da física. Este desenvolvimento levou a que a iluminação permitisse a visualização de amostras transparentes. Usando interferência em vez de absorção de luz, as amostras extremamente transparentes como células de mamíferos vivas possam ser vistas sem recorrer a coloração. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 15 Comparando a iluminação com a de campo claro que apenas os raios refratados chegam à amostra sendo que o diafragma está diminuído formando uma fase em anel como se mostra a seguir. Isto traduz-se no facto de a onda do espécime ser semelhante à da luz não difratada, mas não igual e de continuar a haver variação das ondas difratadas. As vantagens desta microscopia são:  Visualização de estruturas que de outra forma são invisíveis incluído organelos celulares que não podem ser visualizados em campo claro;  A imagem é melhor do que a de campo claro devido à visibilidade dos detalhes. DIC (Differential interference contrast) Através do DIC conseguimos visualizar características invisíveis da amostra. A ótica complexa permite obter informação da densidade ótica da amostra. A imagem obtida será semelhante ao de microscopia de contraste de fase sem o halo de difração distrativa características das imagens de fase de contraste. A sua teoria foi publicada em 1955 por George Normarski e a técnica é muito usada em amostras transparentes. O DIC funciona separando uma fonte de luz polarizada em duas partes mutuamente coerentes ortólogas polarizadas que estão distribuídas espacialmente no mesmo plano e recombinadas antes da observação. A interferência das duas partes na recombinação é sensível à diferença do seu percurso ótico (produtos de índice de refração e comprimento geométrico do percurso). MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 16 Além disso, esta técnica poderá ter o ajuste de Wollaston em que depois do primeiro filtro de polarização e antes do segundo filtro de polarização é colocado um prisma. Isto leva a uma melhor definição da imagem. Comparando as imagens de fase de contraste com as de DIC verifica-se:  Imagens com elevada resolução;  Bom contraste;  Pode ser usado com espécimes espessos;  Não tem o halo distrativo da fase de contraste. Tendo em conta tudo o que foi descrito o equipamento deve ser utilizado com atenção e deverá ter-se em atenção a escolha da objetiva, óleo e lâmina correta. Além disso, de acordo com a análise que se pretende pode escolher-se entre microscopia de campo claro, campo escuro, contraste de fase e contraste de interferência diferencial. Caso a iluminação não seja homogénea é necessário verificar a iluminação koller. Se a imagem não for boa tenta ajustar a abertura numérica do condensador, filtros de luz, limpa as lentes e a amostra. Microscopia eletrónica Na microscopia eletrónica, as imagens não têm cor assim como na fluorescência e a câmara é a preto e branco o que aumenta a gama de pixels. Para além disso, o comprimento de onda é mais curto já que temos eletrões e depende da forma que os colocamos a correr sendo que um aumento de voltagem diminui o comprimento de onda e aumenta a energia. Existem dois tipos de microscopia eletrónica:  SEM – observa-se a superfície da amostra e requer menos voltagem (30 kV);  TEM – atravessa a amostra e requer maior voltagem (50-60 kV). Estas técnicas aumentaram a amplitude do limite de deteção. Normalmente está associado ao estudo da morfologia de por exemplo organelos como mitocôndrias. As imagens obtidas nem sempre corresponde à imagem que criamos de uma mitocôndria podendo ser assim: Sendo que apenas a que está a laranja apresenta uma disfunção (alveolar) em que são rodeadas por RE liso o que as torna as células incapazes de fertilizar e se houve levaria a alterações cardíacas e neurológicas graves. Componentes do microscópio eletrónico Primeiro tem uma coluna com eletrões que tem de ter vácuo, lentes, condensadores, filamento de tungsténio e uma placa com cátodo que atrai eletrões. Normalmente são arrefecidas com hélio. As lentes eletromagnéticas são anéis magnéticos que criam um campo elétrico não havendo vidro. Neste caso começamos com uma ampliação de 1000 vezes (10 x 100) e depois aumentamos. Para observar a MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 17 amostra é necessário desidratá-la e cola-la. Por norma no SEM temos resolução 3D e no TEM reconstrução de proteína na forma nativa. A placa fluorescente permite que ao atravessar um eletrão ele bata e emita um fotão. Os eletrões ficam retidos e não há emissão de fotão ficando uma área preta. No cinzento batem de raspão. Temos ainda uma grelha onde se coloca a amostra e fatias não podem exceder os 100 nm (50-70 nm). Os cortes são feitos no ultramicrótomo que permite o uso de uma faca de vidro ou de diamante. O bloco neste caso será de hepoxida (epon) ou podemos colocar a amostra em nitrogénio líquido para vitrificar. Imunocitogold A preparação para TEM requer: 1. Coleta; 2. Fixação – glutaraldeído (penetração radial) e depois faz-se a dupla fixação por adição de tetróxido de ósmio que fixa a membrana celular ligando a cabeça dos fosfolípidos (bom para focar). O formaldeído não é utilizado neste caso pois precipita e coagula aproximando as proteínas e ficamos abaixo do limite de resolução ótico. Além disso pode influenciar o diagnóstico. 3. Incluir em epon ou araldite. O epon é líquido a temperatura ambiente e indo à estufa fica tipo ambar. 4. Cortes ultrafinos – os semifinos são com faca de vidro e coloca-se numa lâmina para ver ao microscópio ótico corado com azul de metileno e azure II para verificar se é o local pretendido. Os cortes ultrafinos são cortados com faca de diamante e colocados numa grelha; 5. Adicionar contrastante e depositar metais pesados É necessário ter em atenção os planos de corte quando estamos a observar. Microscopia de fluorescência Descoberta da fluorescência George Stokes fez a primeira observação em que um mineral de fluorite floresceu quando iluminado com luz ultravioleta e usou a palavra fluorescência para denotar a aparência geral de uma solução de sulfato de quinina e meio semelhante inicialmente observado por Sir John Herschel. Como funciona a fluorescência? A fluorescência é a emissão de fotões por átomos ou moléculas cujos os eletrões são transientemente estimulados para um estado de excitação elevado por energia radiante de uma fonte externa. A fluorescência termina no momento em que a luz de excitação termina. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 18 Fluorocromos As moléculas que emitem fluorescência designam-se fluorocromo e tem uma absorção máxima e picos de emissão. Por norma o fotão emitido tem uma menor energia e maior comprimento de onda do que o de excitação e a este fenómeno denomina-se desvio de Stokes. As características dos fluorocromos são dependentes do ambiente químico: pH, potencial redox e força iónica. Além disso eles devem ter estas 3 características:  Elevada eficiência quântica;  Resistência a quenching;  Resistência a fotobleaching. Coeficiente extinção – potencial de um fluorocromo para absorver fotão num único comprimento de onda normalmente máximo. Eficiência de quântica – medições das emissões de fotões ao longo da banda espetral do fluoróforo. Fluorocromo Corantes químicas – corantes Alexa, hilite, cianina, DAPI, acridina laranja e Oregon verde. Corantes biológicos – GFP. Proteínas fluorescentes As proteínas fluorescentes emitem luz em diferentes comprimentos de onda quando excitados por luz podendo ser observada em várias cores. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 19 Além disso existem:  Proteínas fotoconversíveis – mudam de uma cor fluorescente para outra quando expostas a um determinado comprimento de onda de luz por exemplo pode começar por emitir luz verde e com comprimento específico mudar para vermelho;  Proteínas fotoativáveis – tornam-se fluorescentes após exposição a um comprimento de onda específico de luz, ou seja, inicialmente não emitem luz só após ativação;  Proteínas fotossensíveis – podem alternar entre dois estados fluorescentes diferentes quando expostas a diferentes comprimentos de onda de luz por exemplo pode alternar entre vermelho e verde. Componentes de microscópios de fluorescência Os microscópios de fluorescência são compostos por fonte de luz, cubo ou conjunto de filtros fluorescentes, lentes das objetivas e câmaras de aquisição digital. A fonte de luz pode ser:  Díodo azul – 405 nm;  Árgon – 458 nm, 475 nm, 488 nm, 496 nm e 514 nm;  Estado sólido (SSDP) – 651 nm;  Hélio-néon (HeNe) – 594 nm;  Hélio-néon (HeNe) – 633 nm. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 20 A fonte de luz para a microscopia de fluorescência é 10-100x mais brilhante que as lâmpadas de halogênio. Na microscopia de fluorescência existem várias opções de iluminação entre as quais LED, xénon, haleto metálico, mercúrio, LED ou ILE (Integrated Laser Engine) para uma iluminação de laser de campo largo. Conjunto de filtros fluorescentes Podem ser arranjados em cubos com filtros com 3 componentes principais:  Filtro de excitação;  Espelho dicroico;  Filtro de emissão. O conjunto de filtros fluorescentes permite a iluminação da amostra com um comprimento de excitação específico enquanto regista apenas luz de missão para o observador. O filtro de excitação permite especificamente a passagem do comprimento de onda excitatório. O espelho dicroico direciona a excitação para a amostra e permite a passagem especifica da luz de emissão para o filtro de emissão. O filtro de emissão restringe a passagem de um comprimento de onda emitido a partir do espécime. Os diferentes tipos de filtros são nomeados de acordo com a sua capacidade de discriminar entre diferentes comprimentos de onda. Os filtros de excitação são normalmente de passe curto. Os espelhos dicroicos refletem alguns comprimentos de onda e permitem a passagem de outros. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 21 Usando as características dos diferentes filtros e dos espelhos dicroicos podemos criar um conjunto de filtros específicos adequados às experiências com obtenção de imagens de fluorescência. Existem dois tipos básicos de conjuntos de filtros:  Filtro único – permite elevado sinal em relação ao ruído, mas a obtenção de imagem é mais lenta;  Filtro múltiplo – permite uma recolha de imagem mais rápida, mas o sinal é mais baixo em relação à razão de ruído. Nota: antes de comprar anticorpos deve ser ter em atenção os filtros dos microscópios já que um anticorpo fica mais barato do que filtros novos. Objetivas Por norma as objetivas têm uma elevada abertura numérica que permite obter elevada resolução e são transparentes a luz UV permitindo usar corantes UV. São feitas de vidro pouco fluorescente. Neste caso as objetivas de fluorite e apocromáticas são as ideias. As lentes têm de corrigir a mudança de plano cromático atuando como um condensador. Câmaras Na microscopia de fluorescência as câmaras mais comuns são pretas e brancas. Muitas das vezes a imagens de fluorescência são mostradas com uma coloração que é falsa (processamento da imagem) e adicionada aos respetivos canais podendo fazer-se uma sobreposição para ver os diferentes componentes, no entanto as imagens obtidas de cada canal da câmara monocromática são a preto e branco. Estas câmaras são mais usadas pois existem mais tons entre preto e branco do que com cores levando a uma imagem em que se obtêm mais pixels e que terá melhor resolução. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 22 Limitações da microscopia de fluorescência Quando se usa microscopia de fluorescência existem vários fenómenos a ter em conta como:  Autofluorescência;  Efeito bleed-though do conjunto de filtros de fluorescência disponíveis;  Fotobleaching (Fotodegradação) do corante;  Fototoxicidade de células vivas. Autofluorescência As causas de autofluorescência são:  Autofluorescência de moléculas endógenas;  Filtros inadequados;  Reatividade ao fixador usado. Efeito bleed-though Isto é muito importante quando se pretende obter imagens com múltiplos fluorocromo ou proteínas fluorescentes simultaneamente. As causas deste efeito são filtros não ideais em que as bandas são muito próximas ou fluorocromo não adequado para a experiência e set up. As possíveis soluções seriam:  Tempos de exposição reduzidos;  Usar filtro altamente específico com passagem de banda estreita. Mesmo assim haverá sempre cruzamento de sinal. Fotobleaching dos corantes Também designado fotodegradação é uma alteração química de um corante que é irreversível. Quando ocorre nunca mais consegue emitir fluorescência. É causado pelo aumento da exposição do fluorocromo à luz. A exposição a energia intensificada leva à formação de radicais que podem causar modificações nas ligações covalentes do fluorocromo. Os resultados é a transição de um estado singleto para um estado tripleto. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 23 Para evitar fotobleaching devemos:  Usar um corante o mais fotoestável possível;  Reduzir o oxigénio da amostra – usando N2 ou eliminadores de oxigénio;  Usar reagentes anti desvanecimento no meio de embebimento;  Reduzir o tempo de exposição. FRAP (fluorescence Recovery After Photobleaching) A recuperação de fluorescência pode ser feita por difusão de moléculas, veículos de transporte ou transporte ao longo de microtúbulos. Fototoxicidade na célula viva As fontes de luz são usadas em elevada energia e podem transmitir luz UV. Os filtros e espelhos dicroicos não são totalmente eficientes no bloqueamento desses comprimentos de onda o que pode causar danos nos lípidos da parede celular e proteínas levando a uma rápida morte celular. As soluções que poderão ser adotadas são:  Reduzir o efeito com filtros UV adicionais, tempos de exposição e meio redox equilibrados quando se usa como fontes de luz haletos metálicos;  Usar iluminação de campo largo que ilumina seletivamente a amostra apenas com as linhas de laser escolhidas;  Usar comprimentos de onda maiores para visualização live;  Usar comprimentos de onda NIR (evitar UV);  Escolher sistema de obtenção de imagens compatível com experiências live como dual micro spinning disk system. Set up e design Para se planear uma experiência é necessário ter em conta:  Disponibilidade de microscópios;  Filtros dos microscópios;  Lasers disponíveis;  Objetivo. Primeiro precisamos de definir se queremos amostras fixadas ou live. Depois temos de definir será uma experiência de uma cor única ou multicolor para que se possa ver anticorpos fluorescentes, proteínas MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 24 fluorescentes e quantum dots que sejam adequados. Finalmente temos de desenhar o protocolo de preparação da amostra e antes de usar o microscópio deverá desenhar-se um protocolo de aquisição de imagens. Qualidade da imagem Para termos uma imagem de qualidade, existem vários fatores a considerar:  Escolha de fluorocromo  Intensidade de excitação;  Alinhamento da lâmpada;  Comprimento de onda de excitação;  Filtros de emissão;  Abertura numérica da objetiva;  Magnificação;  Quenching;  Bleaching;  Fluorescência do fundo;  Propriedades da luz no percurso ótico;  Degradação do fluoróforo;  Comprimento do percurso;  Sensibilidade do detetor;  Artefactos óticos da fluorescência membranar. Vantagens Desvantagens  Fluoróforos auto-luminosos – elevado  Ciclo de vida finito – eventualmente contraste; degradam;  Marcadores muito sensíveis – boa deteção  Sobreposição de espetros de emissão – (pode marcar uma única molécula); cruzamento entre 2 fluoróforos;  Marcadores muito específicos –  Auto-luminosidade – embaçamento da discriminação de componentes individuais; célula ou secção do tecido.  Largo espetro de marcadores fluorescentes disponíveis – possibilidade de marcação múltipla;  Proteínas fluorescentes (FPs) – marcam diretamente muitos componentes;  Fluoróforos e FPs tolerados por células – marcam células vivas sem danos;  Seguir cinética da difusão de proteínas – uso do photobleaching e da fotoconversão;  Seguir interações com outras moléculas – FRET e métodos de razão;  Marcação relacionada com nº de moléculas – extração de informação quantitativa;  Detetores digitais sensíveis – coleta sinais fracos com elevada eficiência. Mecanismo TUNEL Também designado como “terminal transferase-mediated dUTP-biotin Nick End-Labeling of DNA fragments”. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 25 Primeiro é necessário desparafinizar e reidratar a amostra. De seguida é incubada com proteinase K 10 mM pH 7,4 a 37ºC durante 10 minutos. Seguem-se lavagens com PBS a pH 7,4 e a permeabilização com 0,1% de citrato de sódio e 0,1% Triton-X100 a 4ºC durante 2 minutos. Posteriormente há lavagem com PBS a pH 7,4 e depois incubação com a solução de trabalho com TdT e dUTPs/fluoresceína durante 30 minutos a 37ºC numa câmara molhada e escura. Finalmente segue-se uma lavagem com PBS a pH 7,4. Depois aplica-se um contrastante e monta-se com DAPI e finalmente observa-se ao microscópio de fluorescência. MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 26 Substâncias com fluorescência natural  Lipofuscinas;  Elastina e colagénio;  Flavinas;  NADPH;  Clorofila. Fluorescência induzida por fixação  Fluorescência induzida por aldeídos Fluorocromos sintéticos Além disso existem vários fluorocromo sintéticos como os que se seguem abaixo. Método de coloração Existem vários métodos de coloração como os que se seguem sendo o primeiro o principal:  Imunofluorescência em células fixadas – uso de anticorpos primários para detetar o alvo e um anticorpo secundário conjugado para detetar o primário;  Corantes fluorescentes com propriedades de ligação intrínseca (vivas ou fixadas) – podem ser usados em ácidos nucleicos (DAPI e Draq5), organelos (MitoTracker, ER-Tracker, LysoTracker), corantes membranares (moléculas lipídicas fluorescentes) e reagentes fluorescentes (SNAPs, CLIPs e FLASH);  Outros conjugados fluorescentes – lectinas, toxinas, recetores de ligandos, quantum dots, proteínas fluorescentes alvo e biossensores. Sondas fluorescentes comuns Ácidos nucleicos  4,6-diamino-2-fenilindole, dihidrocloreto (DAPI);  Hoechst 33342;  YO-PRO-1 (491/509); MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES  P á g i n a | 27  SYTOX Green (504/523);  Iodeto de propridio (PI – 535/617);  YOYO-3 e YO-PRO-3 (612/631 e 612/631);  TOTO-3 e TO-PRO-3 (642/660 e 642/661). Citoesqueleto  Actina – Alexa fluor faloidina (350-647);  Tubulina – conjugados paclitaxel fluorescente. Organelos  Golgi – BODIPY FL C5-ceramida;  ER – ER-TRACKER e DiOC6;  Lisossomas – LysoTracker;  Mitocôndria – MitoTracker;  Membranas – BODIPY Fatty Acids and Phospholipids, FM 1-43, Dil, DiA, Alexa Fluor wheat germ aglutinina (WGA); Iões  Ca2+ - Fura-2, Fluor-4, Calcium green; pH  Indicador de pH SNARF MÉTODOS DE INVESTIGAÇÃO EM MICROSCOPIA MARIA PIRES