Histolojiye Giriş (PDF)

Histoloji’ye Giriş D O Ç. D R. H A N İ F E Ö Z K A YA L A R  Histolojinin tanımı  Histo + logos : Histoloji Doku + bilim: Doku bilimi  Histoloji hücre biyolojisi olarak biyokimya ve genetik ve fizyoloji ile birlikte yer alır.  Hücrelerin, dokuların, organların hücrelera...

Histoloji’ye Giriş D O Ç. D R. H A N İ F E Ö Z K A YA L A R  Histolojinin tanımı  Histo + logos : Histoloji Doku + bilim: Doku bilimi  Histoloji hücre biyolojisi olarak biyokimya ve genetik ve fizyoloji ile birlikte yer alır.  Hücrelerin, dokuların, organların hücrelerarası matriksin yapılarını ve bu yapıya ilişkin işlevlerini ortaya koymayı amaçlar  Yapı bilimi olarak mikroskobu temel İnsan organizmasındaki hiyerarşik yapılanma Hücreler Ekstrasellüler matriks veya Hücrelerarası matriks Dokular Organlar Sistemler (Gİ sistem, Mono nukleer fagosit sistem V.b )  DOKULAR Epitel Bağ Dokusu Kıkırdak Kemik Kas Sinir HÜCRELER – DOKULAR - ORGANLAR  Hücreler  Dokular: Hücreler ve onların sentezlediği ara maddenin oluşturduğu, özgün işlev gösteren yapılar  Epitel dokusu  Bağ dokusu  Kas, kemik dokusu  Sinir dokusu  Organlar: Dokuların oluşturduğu işlevsel yapılar  Histolojide kullanılan yöntemler  Işık mikroskobu  Otoradyografi  aydınlık alan mikroskobu  Hücre ve doku kültürü  floresan mikroskobu  Enzim histokimyası  Faz kontrast M  konfokal M  Özel moleküllerin  polarize M doku kesitlerinde  Elektron mikroskobu gösterilimi  transmisyon veya geçirici  immünhistokimya E:M  hibridizasyon teknolojisi  Scanning veya tarayıcı E:M  CANLI (VİTAL) İNCELEME  Vital inceleme  Canlı dokulara zarar vermeden yaşayan organizmaları ya da hücreleri inceleme  Faz kontrast mikroskobunda kültüre hücrelerin incelenmesi  Vital boyama: Boyanın canlı organizmaya uygulanması  Supravital boyama: Organizmadan elde edilen canlı hücrelerin kültür ortamına boya uygulanması  Çini mürekkebi  Tripan mavisi VİTAL BOYAMA Karaciğer: Çini mürekkebi  Rutin ışık mikroskobik inceleme Kimyasal veya fiziksel olarak tesbit edilmiş ölü hücre ve doku materyellerinin 3-5 mikron kalınlığındaki kesitlerinin incelenmesidir Histoloji ve patolojide ilk adım olarak kullanılır ve genel hücre ve doku yapısını gösterir. Özel boyama ve teknikler özel amaçlar için çeşitli kimyasal grupları veya faklı dokuları birbirinden ayırt etmek için kullanılır, RUTİN IŞIK MİKROSKOP DOKU TAKİP YÖNTEMİ 1. Dokunun elde edilmesi 2. Fiksasyon (tespit) 3. Dehidratasyon 4. Şeffaflaştırma 5. Gömme 6. Kesit alma 7. Boyama 8. Kapatma  DOKU ÖRNEKLERİ Biyopsi materyali:  İnsan ya da deney hayvanlarından cerrahi olarak çıkarılan parça Otopsi materyali  Ölümden sonra doku örneklerinin alınması  doku taze olmalı organizmadan alınır alınmaz ve ölümden hemen sonra tesbit edilmeli  FİKSASYON FİZİKSEL KİMYASAL  Kurutma. kan Immersiyon,  Isıtma. İri kümeler Perfüzyon  Formaldehit: % 10’luk oluşturur dokuyu nötral tamponlanmış bozar formalin çözeltisi  Alkol formalin solusyonu:  Dondurma. Enzim ve (polisakkaritler) immün histokimya,  Ozmiyum tetroksit frozen çabuk doku  Zenker, Bouin, Pikrik asit  Asetik asit tanısı KİMYASAL FİKSASYON YÖNTEMLERİ İMMERSİYON PERFÜZYON  Rutin alınan dokunun  Fiksatif damar yoluyla hacminin en az 10 katı verilir. fiksatif kullanılmalıdır.  Dokuya daha hızlı ve iyi  Difüzyon hızı optimal penetrasyon sağlar. prezervasyon için  Doku prezervasyonu kritiktir. daha iyi.  DOKU KORUMA-FİKSASYON: Yapıyı canlıda olan formuna en yakın biçimde koruyabilmek Dokuların endojen enzimlerce (enzimatik otolizis) ya da ekzojen (bakterilerce) parçalanmasını önlemek( enzimleri inaktif hale getirir) Dokuyu sertleştirip kesilebilir kıvama getirmek  Fiksatif: Dokudaki proteinlerle çapraz bağlar yapıp bozulmayı önleyen fiziksel ya da kimyasal bir ajan.  Proteinleri ve bunlara bağlı diğer molekülleri ya çapraz bağlama veya denatürasyon yoluyla koagüle der.  Yapılarını ve yerlerini sabitler.  Taze ve miktarca yeterli olmalıdır & Dokuya hızla penetre olmalıdır  Doku alındıktan hemen sonra en kısa sürede fiksatif uygulanmalıdır.  Rutin ışık mikroskobik teknik Formalin fiksasyonu, parafine gömme ve hematoksilen eozin ikili boyaması ışık mikroskopik incelemede dokunun hazırlanması için gereklidir. Tamponlanmış nötral formalin genel doku ve hücre yapısının korunması için en uygun kimyasal fiksatifdir. Ösmium tetroksid ( Oso4) lipid ler için ve EM için  DEHİDRATASYON  Kimyasal fiksatif ve doku içeriğinin çoğu sudur.  Gömme materyeli parafin; suyla uyumsuzdur, suda çözünmez bu nedenle dokulardaki suyun parfine yer açmak için alınması gerekir.  Doku artan derecelerde (50, 60, 70, 80, 90, 96, 100%) etil alkollerden (sabit vakumla)  ŞEFFAFLAŞTIRMA  Suyu alınan doku erimiş/sıvı parafinle uyumlu sıvılarda şeffaflandırılır.  Şeffaflandırma hem dehidratasyon materyelinde ( alkolde) hem de sıvı parfinde eriyebilen kimyasalardır.  Bu amaçla çoğunlukla ksilol, bazen de toluen, benzen türevleri kullanılabilir. IŞIK MİKROSKOBU İÇİN DOKU TAKİP CİHAZLARI  İNFİLTRASYON VE GÖMME  İnfiltrasyon: Dokuların sıvı parafin ile etüvde/takip cihazında uygun sıcaklıkta /sabit vakumla bekletilmesi  Böylece şeffaflaştırıcı ajan parafinle yer değiştirir  Gömme : Örneklerin gömme kaplarına alınıp, üzerine sıcak taze parafin eklenmesi  Parafinin hızla soğutularak sertleştirilmesiyle blokların elde edilmesi PARAFİNE GÖMME İSTASYONLARI  KESİT ALMA  Mikrotomda çelik/ karbon kaplı/tunsten karbid bıçaklarla istenen kalınlıkta (2-10 mikrometre) kesitler alınması.  Kırışıklıkların jelatin havuz/sıcak su banyosu/alkolle açılması (parafin takibi).  Cryostat’da soğutulmuş bir odacıkta dondurulmuş (frozen) dokulardan kesit alınması  Doku kesidinin adeziv olan ya da olmayan cam/pleksiglas lam üzerine alınması. PARAFİN KESİT ALMA  KESİT ALMA: ROTARY, SLİDİNG, CRYO MİKROTOMLAR Parafin tekniği özeti ve boyamaya hazırlama  Tespit edilen dokunun alkollerle dehidratasyonu  Ksilolle şeffaflaştırma  Gömme  Parafin blokların elde edilmesi  Mikrotomla kesit alma  Parafinin kesitten uzaklaştırılması (etüvde sıcakta bekletme)  Rehidratasyon  Boyama (suda eriyen boyalarla)  Dehidratasyon (lamel ve kapatma ortamının kalıcılığını sağlamak için) ve kapama  Boyama Farklı doku bileşenlerinin hepsi aynı optik densiteye sahip olduğundan birbirlerinden ayırdedilmeleri farklı renkerde görüntülenmeleri için boyanarak mikroskop altında incelenebilir. Klasik olarak en yaygın boyama bir asid birde bazik özellikteki boyanın, kesilip parafinden arındırılarak suyu geriye verilmiş (rehidrate) kesitlere ar arda uygulanmasıdır. Hematoksilen eozin bu amaçla kullanılan en klasik örnektir.  Asid ve bazik boya // asidofili bazofili Hücre ve dokulardaki (–) yüklü guruplar (+) yüklü bazik boyalarla, (+) yüklü olanlar ise (–) yüklü asidik boyalarala boyanır.  Asid boyalarla boyanma asidofili veya asidofilik yapı  Bazik boyalarla boyanma bazofili veya bazofilik yapı  Dokulardaki asit yapıdaki bileşenler (bazofilik yapılar) bazik boyalarla tuz oluştururlar  Dokudaki bazik yapıdaki bileşenler (asidofilik yapılar) asit boyalarla tuz oluştururlar  Hematoksilen-Eozin Hematoksilen (bazik boya) dokudaki asit bileşenleri (çekirdekteki-nükleik asitler, DNA, RNA) koyu mavi (mor) renge boyayan bazik boya Eozin (asit boya) dokudaki bazik bileşenleri (sitoplazmik proteinler, kollajen lifler vb.) kırmızı-pembe renge boyayan asidik boya  HEMATOKSİLEN-EOZİN HEMATOKSİLEN (Bazik) Çekirdek--- Asidik Lacivert-Mor (Bazofilik) EOZİN (Asidik) Sitoplazma—Bazik Pembe-Kırmızı (Asidofilik) HEMATOKSİLEN-EOZİN BAZI TEMEL HİSTOKİMYASAL BOYALAR  Hematoksilen-Eozin; Rutin  Demirli hematoksilen; Bazı lifler ve yapılar için  Mallory Azan ve Masson’un üçlü boyaları; bağ dokusu, kollagen fibriller ve bazı özel bileşenler için  Verhoeff van Gieson; elastik lifler  Gümüşleme (Silver impregnation); Sinir, retiküler lifler, Golgi  Çini mürekkebi ; Vital, supravital inceleme  Tripan mavisi; kültür, canlı-ölü inceleme Periyodik Asit Schiff (PAS); karbohidratlar Feulgen; DNA Methyl green-Pyronin; DNA-RNA BAZI TEMEL HİSTOKİMYASAL BOYALAR  Yağ boyaları; Sudan III & IV, Oil red O, Sudan black, osmic acid  Ozmik asit (ozmiyum tetroksit); EM, yağ  Wright or Giemsa Kan boyaları; Kan hücreleri, granüller MALLORY TRİKROM DEMİRLİ HEMATOKSİLEN GÜMÜŞLEME PAS (PERİYODİK ASİT- SCHİFF) REAKSİYONU  Aldehid grupları zayıf asitlerle açığa çıkarılabilen karbonhidrat içeren yapıları göstermek amacıyla kullanılır.  PAS reaksiyonunda zayıf asit olan periyodik asit nötral karbohidratlar da aldehid gruplarını açığa çıkarır ve bunların boyanmasını sağlar (bazal lamina, glikojen, mukus vb.)  Schiff reaktifi (renksiz fuksin) aldehit gruplarıyla reaksiyona girerek menekşe-kırmızı (magenta) bir renk oluşturur PAS (Periodik Asit-Schiff): Aldehid grupları zayıf asitlerle açığa çıkarılabilen karbonhidrat içeren yapıları göstermek amacıyla kullanılır.  YAĞ BOYALARI  Rutin takipte erir, bal peteği görünümü  Dondurularak tespit edilebilir  Sudan III ve IV ------- kırmızı  Oil red O-----------------kırmızı  Charlock -----------------kırmızı  Sudan black ---------- siyah  Osmik asit (Ozmiyum tetroksit)------koyu kahverengi (tespit ve boya) Lipidlerin rutin yöntemle hücreden ekstraksiyonu: Bal peteği görünümü (HE) SUDAN BLACK OIL RED O OZMIYUM TETROKSİT  KAN İNCELEME YÖNTEMLERİ  Romanowsky boyaları  Eozin ve bazik boya karışımları (Metilen mavisi, azure)  Wright ve Giemsa boyası  Eritrositler ve eozinofilik granüller: pembe  Monosit, lenfosit, lökositler: mavi-mor  Fiksasyon: kurutma ile yapılır Kan Boyaları  METAKROMAZİ  Çok sayıda anyonik (negatif yüklü) grup içeren bileşenler (sülfat, fosfattan zengin makromoleküller) bazik boyalarla metakromazi gösterirler (örnek mast hücre granüllerindeki heparin, kıkırdak ara maddesi). Boyanın boyaması gereken renkten farklı bir renkte boyanır.  Nedeni polianyonlara çok sayıda boya molekülünün bağlanmasıyla rengin orijinal maviden farklı kırıcılık nedeniyle mora kaymasıdır.  Yüksek anyonik grup içeren moleküller  Sülfat ve fosfattan zengin (-) yüklü bileşenler  Heparin içeren mast hücresi granülleri  Kıkırdak ara maddesi METAKROMAZİ Enzimlerin doku kesitlerinde gösterilmesi Enzim histokimyası Enzim korunması dondurulmuş kesitler veya özel fiksasyon  Doku kesitlerinin enzimin etki etttiği substratı ile inkübasyonu  Oluşan etkilenmiş substratın ya direkt olarak çözülmeyen stabil renkli bir ürün oluşturması veya enzim etkileşimi sonucu substrattaki ürünü gösteren bir işaretleyici ile görünür hale gelmesi Figure 1-10 Copyright © McGraw-Hill Companies  İmmünhistokimya veya İmmünsitokimya Hücre ve dokulardaki bir molekülü ( çoğu kez proteinden zengin, bir reseptör, sinyal molekülü büyüme faktörü v.b) doku kesitlerinde gösterilmesi Gösterilmek istenen moleküle karşı hayvanlarda antikor geliştirilir.  antikora bir enzim (peroksidaz veya başka bir işaretleyici (flöresan bir madde, molekül) bağlanır doku kesitlerindeki moleküle ( antijen)özgül olarak bağlanan işaretli antikor yoluyla istenilen molekül gözlenir  Mikroskoplar  Işık mikroskopları : objeyi aydınlatma ve görüntü oluşturma prensiplerine bağlı olarak,  ışığı kırma ( aydınlık alan mikroskobu)  ışığı saçma ( karanlık alan mikroskobu)  ışığın fazını değiştirme( faz kontrast mikroskobu)  ışığın polarizasyon düzlemini değiştirme( polarizasyon mikroskobu)  Belli dalga boyundaki ışınların enerjilerini değiştirme( flüoresan mikroskobu)  Elektron mikroskopları.  Transmisyon ( TEM) geçirim elektron mikroskobu  Scanning ( SEM) veya tarama elektron mikroskobu  STEM AYDINLIK ALAN MİKROSKOBU Rutinde kullanılmaktadır. Işınlar doku kesitinden geçer, büyütülür ve gözümüze gelir. İncelenen yapı doğal olarak renkli/ renklendirilmiştir. Işık kaynağı olarak güneş ışığı/ ampüller kullanılır. Görüntü oluşturmada aydınlık alan objektifleri ve okülerleri kullanılır. Optik hataları düzeltilmiş apokromatik, plan objektifler tercih edilir. AYDINLIK ALAN MİKROSKOBU Optik bölümler  Kondansör: ışığı yoğunlaştırıp preparat üzerine düşüren mercekler sisteminden oluşur.  Objektif: en az 5-7 mercek çeşitinden yapılmıştır. Objektif örnekten gelen ışınları toplayıp büyüten mercekler bütünüdür. Görüntüyü oluşturur  Oküler: 2-3 adet mercekten yapılmış, belli bir büyütme derecesi olan ve mikroskopta göze en yakın olan optik parçadır. Objektifin oluşturduğu görüntüyü büyüterek göze veya bir CCD kameraya ulaştırır Işık spesmenin içinden geçer  Objektifin fonksiyonu sadece büyütme sağlamak değil, aynı zamanda değişik yapılardaki detayları ortaya çıkarmaktır.  Çözünürlük  rezolüsyon :İncelenen yapı içinde birbirine yakın iki küçük cismin objektif tarafından teker teker ayıdedilebilme ayrı birer varlık olarak gösterilme yeteneğidir.  Çözünürlük küçüldükçe mikroskobun çözüm gücü artar.  Normal insan gözü birbirine uzaklığı 0,2mm olan cisimleri iki ayrı obje olarak ayırdeder.  aydınlık alan mikroskobu 0,2 mikrometre  Okuler X10 ObjektifX40 Sayısal açıklık 0.65 Mikroskobun objektifin sağladığı 40 temel büyütme büyütmesi Mikroskobun kullanıcının Objektif X okuler toplam okülerden bakarken 40 X10=400 büyütmesi gördüğü büyütmedir. Bir objektifle objektifin sayısal 0.65 X1000=650 çıkılabilecek açıklığının 1000 en büyük katıdır. büyütme AYDINLIK ALAN MİKROSKOBU Zeybek; Aşan et al. 2007  ELEKTRON MİKROSKOBU Işık kaynağı yerine havası alınmiş bir ortamda hızlandırılmış elektronlarin kullanılmaktadır.  TEM (transmisyon geçirim elektron mikroskobu)  SEM (Scanning veya tarama elektron mikroskobu) Elektronlar küçük ve negatif yüklü parçacıklar olup maddenin çeşitli formları tarafından kolaylıkla emilebilir veya kırılabilir. KARANLIK ALAN MİKROSKOBU Boyanmamış kesitlerin veya canlı hücrelerin incelenmesinde kullanılabilir. Bu yapılar ile içinde bulundukları ortamın kırma indeksi birbirine yakındır. Kontrast oluşturamadıkları için ışık mikroskobunda bu yapıların görüntülenmesi zordur. Karanlık alan mikroskobu ışığı saçma prensibine dayanarak bu problemi çözer. Sifiliz etkeni Trepenoma pallidum tanısında, hücre süspansiyonları, parazitler, otoradyografik tane sayma Idrarda urik asit ve okzalat kristallerinin incelenmesinde yararlıdır. Işık mikroskobuna göre çözünürlük düşük olmasına rağmen artmış kontrasta bağlı olarak birçok küçük yapı karanlık alan tekniği ile daha kolay görülebilir.  Faz kontrast mikroskobu  Hücre kültürü tesbit ve boyama yapılmamış canlı hücre incelenmesi  Farklı bir lens sistemi kullanarak transparan objelerin görünümünü sağlar  Hücre, çekirdek, zar, HAM gibi farklı ışık yansıtma özelliği olan yapıların hızını değiştirerek bazı yapıların diğerlerine göre daha koyu veya daha açık görüntü oluşturmaları esasına dayanır. FAZ KONTRAST MİKROSKOBU Flöresan mikroskobu Bazı doku bileşenleri uygun dalga boyunda bir ışığa maruz kaldıklarında daha uzun dalga boyunda bir ışın salarlar buna oto flüoresan özellik denir.  Bu mikroskopta kesitler UV ile aydınlatılır, spesmenden geçen ışınları dalga boyuna göre ayıran bir filtre sistemi vardır. Flöresan özellikteki bileşenler siyah bir zemin üzerinde parlak ışık saçan alanlar olarak görülür. Bu doğal özelliğin dışında doku yapılarındaki moleküllere bağlanan flöresan boyalar kullanarak immun histokimya dahil olmak üzere çeşitli moleküllerin doku kesitlerinde gösterilmesi mümkün olur.  Polarize mikroskop  Tekrarlayan veya birbirini düzenli izleyen belli bir yöne yönelmiş alt ünitelerden oluşan yapıların izlenmesinde kullanılır bu yapılara ışığı çift kıran anizotrop maddeler denir.  Düzenli dizilim nedeniyle ışığı belli bir açı farkıyla ikiye ayırır açık ve koyu bantlar şeklinde görünmesini sağlar.  Kollagen çizgili kas kemik dokusundaki lameller