Metode de Evidențiere a Cromozomilor în Mitoză, Laborator 2, 2024 PDF

METODA FEULGEN PENTRU EVIDENȚIEREA CROMOZOMILOR ÎN MITOZĂ Laborator 2 Roman Sara, 2024 CE ESTE CELULA? O celulă este unitatea fundamentală structurală și funcțională a tuturor o...

METODA FEULGEN PENTRU EVIDENȚIEREA CROMOZOMILOR ÎN MITOZĂ Laborator 2 Roman Sara, 2024 CE ESTE CELULA? O celulă este unitatea fundamentală structurală și funcțională a tuturor organismelor vii. Este cea mai mică parte a unui organism care poate realiza toate funcțiile esențiale ale vieții, cum ar fi metabolismul, creșterea și reproducerea. Există două tipuri principale de celule: 1. Celulele eucariote – Sunt celule mai complexe, cu un nucleu în care se află ADN-ul. Aceste celule sunt prezente la animale, plante, fungi și protiste. Au organite (structuri specializate) cum ar fi mitocondriile, cloroplastele (în celulele vegetale), și alte structuri care îndeplinesc diverse funcții. 2. Celulele procariote – Sunt celule simple, fără un nucleu bine definit. Materialul lor genetic (ADN) plutește liber în citoplasmă. Bacteriile sunt exemple de organisme procariote. CICLUL CELULAR ȘI DIVIZIUNEA CELULARĂ LA EUCARIOTE Caracteristicile organizării genetice eucariote sunt: 1. existenţa membranei nucleare duble care închide materialul genetic; 2. repartizarea informaţiei genetice pe mai mulţi cromozomi. Datorită localizării materialului genetic pe mai mulţi cromozomi, transcrierea şi traducerea informaţiei genetice se realizează separat, prima în nucleu și cea de-a doua în citoplasmă la nivelul ribosomilor (structuri celulare esențiale pentru sinteza proteinelor). Complexarea permanentă a ADN cromosomal cu histone (proteine bazice ce conţin resturi de arginină şi lizină) face ca la eucariote substanţa nucleară – cromatina să prezinte un aspect fibros la microscopul electronic. Complexarea cu proteine histonice a ADN cromosomal are drept consecinţă prezenţa unui ciclu celular cu două faze distincte: replicativă şi distributivă. CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE În celulele somatice, cromozomii suferă procese ciclice de spiralizare, despiralizare şi sinteză replicativă, procese care asigură transmiterea informaţiei genetice de la o generaţie la alta, în cadrul ciclului celular (fig.I.1-1). Ciclul celular reprezintă perioada dintre două diviziuni mitotice succesive!. Ciclul celular este divizat în două etape: 1. interfaza (I) 2. diviziunea celulară - mitoza (M). CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE A. Interfaza Interfaza este perioada cea mai activă din punct de vedere metabolic - are loc sinteza ADN, a proteinelor histonice. Este subdivizată în trei faze : a) faza presintetică G1 - (G = gol sintetic) b) faza S - (S = sinteză) c) faza postsintetică G2 CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE a) faza presintetică G1 - (G = gol sintetic) - Nu se sintetizează ADN, dar are loc acumularea compușilor necesari replicării cromozomilor monocromatidici, dublării centriolilor și formării aparatului mitotic. - Au loc sinteze de ARN, proteine enzimatice și neenzimatice. CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE b) faza S - (S = sinteză) - se dublează cantitatea de ADN, cromozomii devenind bicromatidici. La sfârşitul mitozei şi în G1 cromozomii sunt monocromatidici. CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE c) faza postsintetică G2 - nu se sintetizează ADN, dar se asigură condiţiile pentru formarea aparatului de diviziune a celulei - se acumulează substanţe cu rol energetic necesare pentru realizarea mitozei. CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE B. Mitoza Mitoza reprezintă procesul de diviziune a celulelor somatice, care asigură ca cele două celule fiice să primească fiecare câte un complement cromozomal identic cu cel al celulei mamă. Mitoza constă din succesiunea a patru etape: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza (fig. I.1-3). CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE B. Mitoza Parcurgerea acestor etape permite celulei iniţiale să se dividă în două celule fiice, care au fiecare acelaşi număr de cromozomi monocromatidici, egal cu numărul de cromozomi bicromatidici ai celulei mamă. În esenţă, acest proces este acelaşi la toate organismele eucariote. Fiecare cromosom, care la începutul diviziunii nucleului are două cromatide, se divide în două jumătăţi identice, care se separă una de alta şi se distribuie în cele două celule fiice. Înainte de a intra în faza distributivă a ciclului celular (mitoza) cromozomii sunt despiralizaţi, decondensaţi şi nu pot fi observaţi la microscopul optic.  ! CROMOZOMII Cromozomii (gr. chroma = culoare, soma = corp) reprezintă entităţi genetice ale genomului eucariot, fiind purtători ai informaţiei genetice (genelor). Sunt corpusculi coloraţi cu structură şi număr caracteristice fiecărei specii, constituind un criteriu de identificare a speciei. Cromatina – (structura fibroasă de ADN şi proteine) reprezintă substanţa cromatică a cromozomilor ca şi a nucleului. Are 2 stări distincte interconvertibile, numite : - eucromatină- este decondensată în interfază şi condensată în timpul diviziunii, la nivelul cromozomilor, când se colorează intens ; - heterocromatină – este condensată atât în timpul diviziunii cât şi în interfază, colorându-se în mod egal de-a lungul ciclului celular (interfază + mitoză). La nivelul nucleului celulelor eucariote, cromozomii se individualizează ca structuri sub formă de baghetă sau de corp sferic, formate dintr-un complex macromolecular nucleo-histonic.  ! CROMOZOMII Cromozomii metafazici sunt alcătuiţi din următoarele componente: cromatide, centromer, kinetocor, braţe, telomere (fig. I.1-4). Cromatidele sunt subunităţi structurale longitudinale unite într-un singur punct numit centromer, cu ajutorul căruia se prinde de fibrele fusului de diviziune, în metafază. Cromatidele surori (engl. sister chromatids)- sunt structuri identice ce rezulta in urma replicarii cromosomului in timpul fazei S a ciclului celular. Fiecare cromatidă conţine câte o moleculă de ADN linear ; Braţele cromozomului sunt porţiunile libere ale cromatidelor, situate de o parte şi de alta a centromerului. Funcţie de poziţia centromerului, cromozomii pot avea braţele egale (metacentrici) sau inegale (submetacentrici, acrocentrici). Constricţia primară apare la cromozomii metafazici în regiunea centromerului, zonă unde cromatidele sunt mult îngustate. La acest nivel se află kinetocorul - o structură trilamelară, tristratificată, dispusă pe partea externă a centromerului, câte una la fiecare centromer al celor două cromatide.  ! CROMOZOMII CR- Cromatide surori ; C- centromer ; CP- constricţie primară ; K – kinetochor F- fibre de diviziune ; CS- constricţie secundară ; T- telomere ; mS – macrosatelit S – microsatelit ; D – dublu helix ADN ; p – braţ scurt ; q – braţ lung Rolul kinetocorului este acela de-a ataşa cromozomii la fibrele fusului de diviziune.  ! CROMOZOMII Unii cromozomi prezintă şi o a doua constricţie - secundară. Cromozomii care au constricţii secundare sunt implicaţi în organizarea nucleolilor şi se numesc organizatori nucleolari. La nivelul constricţiei secundare sunt grupate genele pentru ARNr (28 S, 18 S, 5.8 S şi 5 S). Constricţiile secundare pot fi foarte accentuate, realizându-se despărţirea aproape completă a unui segment din cromatidele cromosomului. Aceste porţiuni se numesc sateliţi. Extremităţile cromozomilor se numesc telomere care au rolul în stabilitatea cromozomilor (previne asocierea la capete a diferiţilor cromozomi). În zona telomerelor se găsesc secvenţe de ADN înalt repetate care protejează cromosomul in cazul scurtării cromatidelor (fenomen ce apare după fiecare rundă de replicare).  ! CROMOZOMII Dimensiunea cromozomilor variază în funcţie de specie, între 0,2 – 0,5 μm în diametru şi 0,2 – 30 μm în lungime, astfel: cromozomii umani au dimensiunile cuprinse între 4- 6 μm, la porumb 8- 10 μm, la ceapă 10- 20 μm etc. Un rol important în formarea şi reglarea aparatului mitotic, care este responsabil de repartiţia egală a cromozomilor în cele două celule fiice, îl au centriolii. Centriolul este un organit celular de forma unui cilindru gol cu pereţii formaţi din 9 grupe de câte 3 microtubuli, numite triplete. Microtubulii sunt cilindri goi, constituiţi din protofilamente formate din dimere de α şi β tubulină.  MITOZA - PROFAZA Diviziunea celulară de la majoritatea animalelor şi la unele plante (alge, ciuperci, briofite, pteridofite şi gimnosperme inferioare) se desfăşoară datorită fusului mitotic, a cărui origine este în principal centriolară. Mitoza (kariokineza) cuprinde următoarele faze: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza. 1. PROFAZA. În timpul acestei faze, nucleul prezintă un aspect difuz, granulat. La începutul profazei cromozomii încep să se condenseze, având forma unor filamente subţiri, vizibile în nucleu. În timp ce profaza avansează, cromozomii devin mai scurţi şi mai groşi ca urmare a spiralizării lor. În profaza târzie, au loc următoarele trei fenomene (fig. I. 1-5): - dispar nucleolii; -membrana nucleară de dezintegrează; - apare fusul de diviziune, în urma migrării spre poli a centriolilor şi formării fibrelor.  MITOZA - METAFAZA - În această etapă se formează placa metafazică. - Cromozomii bicromatidici se atașează la fibrele fusului de diviziune, cu ajutorul kinetocorului și migrează spre centrul celulei, se distribuie în planul ecuatorial al fusului mitotic. - Are loc deplasarea lor spre polii opuși ai fusului de diviziune. - În metafază, cromozomii prezintă un maxim de condensare (fig. I. 1-6).  MITOZA - ANAFAZA - Începe separarea cromatidelor surori prin clivarea longitudinală a centromerilor. - Deplasarea lor spre polii opuşi ai fusului de diviziune. - Cromozomii devin astfel monocromatidici (fig. I. 1-7).  MITOZA - TELOFAZA - În această fază cromozomii monocromatidici ajung la polii opuşi ai fusului de diviziune. - Membrana nucleară se reface în jurul fiecărui grup de cromozomi - Fusul de diviziune dispare, nucleolii se reorganizează şi cromozomii se despiralizează (fig. I. 1-8). - Treptat, cei doi nuclei rezultaţi capătă aspectul caracteristic din interfază - Celula se divide (citokineza). CITOKINEZA În zona ecuatorială a celulei, în locul fostei plăci metafazice, apare un perete despărţitor numit fragmoplast, de natură proteică, astfel citoplasma şi organitele celulare se repartizează în mod egal între cele două celule fiice (fig. I. 1-9).  METODA FEULGEN PENTRU EVIDENȚIEREA CROMOZOMILOR ÎN MITOZĂ Metoda constă în eliberarea grupărilor aldehidice din ADN printr-o uşoară hidroliză cu HCl 1N. Are loc o reacţie chimică între aceste grupări şi fuxina bazică în urma căreia cromozomii se colorează în roşu - violaceu. În histochimie reacţia Feulgen pozitivă este considerată un indicator al prezenţei acidului dezoxiribonucleic. La celulele aflate în diviziune numai cromatina se colorează în roşu - violaceu, acidul ribonucleic din nucleoli şi citoplasma nu se colorează. Pentru studiul cromozomilor în mitoză la plante se foloseşte zona meristematică a rădăcinilor de ceapă, usturoi, etc. Metoda Feulgen de colorare a cromozomilor cu fuxină bazică se realizează astfel: 1. FIXAREA 2. HIDROLIZA 3. COLORAREA 4. PREPARATELE MICROSCOPICE  METODA FEULGEN PENTRU EVIDENȚIEREA CROMOZOMILOR ÎN MITOZĂ Materiale necesare -Rădăcini de ceapă sau de usturoi aflate in faza de creştere activă (~2,5 cm lungime); -Acid acetic glacial 45% sau fixator Carnoy (6 părţi alcool etilic absolut:3 părţi cloroform:1 parte acid acetic glacial); -HCl 1 N; -Fuxină bazică decolorată (reactiv Schiff); -Alcool etilic 70% pentru păstrarea materialului vegetal până la utilizare; -Pensetă, Scalpel, Hârtie de filtru, Lame, Lamele; Beţişoare de lemn ; Carmin acetic ; - Microscoape.  METODA FEULGEN PENTRU EVIDENȚIEREA CROMOZOMILOR ÎN MITOZĂ 1. FIXAREA omoară celulele şi asigură coagularea constituenţilor celulari. Se poate folosi una din următoarele soluţii: acid acetic glacial 45% sau fixator Carnoy. Peste rădăcinuţe se pun 2-3 ml de soluţie fixatoare, apoi balonul Erlenmeyer se introduce în frigider timp de 12-15 ore. 2. HIDROLIZA asigură macerarea ţesuturilor prin dizolvarea parţială a substanţelor pectice şi eliberează grupările aldehidice din ADN uşurându-se procesul de colorare şi apoi de etalare a celulelor pe lamă. Se foloseşte HCl 1 N încălzit la 60°C, care se adaugă după îndepărtarea fixatorului. Balonul Erlenmeyer se introduce într-o baie termostată la 60°C timp variabil în funcţie de duritatea ţesuturilor (10-15 minute). 3. COLORAREA se efectuează cu o soluţie de fuxină bazică decolorată (reactiv Schiff), care se adaugă după îndepărtarea HCl 1 N. După 10 - 15 minute zonele meristematice din vârful rădăcinilor se vor colora.  METODA FEULGEN PENTRU EVIDENȚIEREA CROMOZOMILOR ÎN MITOZĂ 4. PREPARATELE MICROSCOPICE se fac prin etalarea materialului într-un strat subţire, format dintr-un singur rând de celule, după metoda squash. a. în mijlocul unei lame se pune o picătură de carmin acetic şi porţiunea colorată din vârful rădăcinii (1-2 ml); b. peste aceasta se pune o lamelă (unsă cu albumină glicerinată şi trecută repede prin flacără pentru coagularea albuminei, care are rolul de-a împiedica dispersarea cromozomilor în celulă); c. lamela se loveşte cu un beţişor de lemn pentru etalarea materialului; d. cu o hârtie de filtru se absoarbe excesul de carmin acetic. e. se observă lama la microscop şi se identifică etapele de diviziune METODA FEULGEN PENTRU EVIDENȚIEREA CROMOZOMILOR ÎN MITOZĂ