Análisis Microbiológico de Suelo - PDF

Las muestras que han sido conservadas por alguno de los métodos citados requieren un pretratamiento para restablecer la población de microorganismos. Este tratamiento, que se denomina pre-incubación, consiste en la incubación de las muestras por 5-10 días a temperatura de 25 ºC y humedad óptima de 6...

Las muestras que han sido conservadas por alguno de los métodos citados requieren un pretratamiento para restablecer la población de microorganismos. Este tratamiento, que se denomina pre-incubación, consiste en la incubación de las muestras por 5-10 días a temperatura de 25 ºC y humedad óptima de 65 % de la capacidad de campo4 antes de realizar el análisis microbiológico. En este trabajo práctico no se realizará la pre incubación de las muestras sino que se trabajará con las muestras de suelo frescas. 4Capacidad de campo (CC) se refiere al máximo contenido de agua que es capaz de retener un suelo luego de la saturación y posterior drenaje. EJECUCIÓN DEL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUELO Sobre las muestras de suelo se evaluará: 1. Población global de microorganismos a través de: Actividad respiratoria: con esta técnica se evalúa el CO2 desprendido absorbido en un álcali y cuantificado por retrotitulación. 2. Grupos funcionales: a. Grupo funcional relacionado al Ciclo del Nitrógeno: Nitritadores (N). La mineralización del N consiste en dos procesos: la amonificación de compuestos orgánicos y la nitrificación que consiste en la oxidación del NH4 + hasta NO2 - y NO3 -. En este trabajo práctico se evaluará el grupo funcional nitritadores, responsable de la oxidación de NH4 + a NO2 -. b. Grupo funcional relacionado al Ciclo del Carbono: Celulolíticos(C). Este grupo funcional lleva a cabo la descomposición de la celulosa y comprende una variedad de microorganismos como: bacterias aeróbicas y anaeróbicas y hongos. Los nitritadores (N) serán evaluados por la técnica del Número Más Probable (NMP), mientras que los celulolíticos (C) serán evaluados por la técnica de recuento de granos de suelo infectados. Los resultados obtenidos para cada una de las situaciones agronómicas asignadas a los grupos de alumnos se analizarán en relación a las características físico químicas de los suelos. TÉCNICAS A EMPLEAR 1- Población global de microorganismos a. Incubación 1. Pesar 50 g de suelo y colocar en recipiente con cierre hermético. Hacer 4 repeticiones. 2. Colocar en cada uno de los recipientes un vasito de precipitado con 25 mL de NaOH 0,2 N. 3. Hacer 4 repeticiones. 4. Preparar un recipiente con todos los reactivos pero sin suelo (Blanco). La figura 1 muestra como se disponen los recipientes. 5. Incubar en estufa por 7 días a 25 ºC. b. Evaluación del CO2 desprendido luego de la incubación 1. Se trasvasa el NaOH a un erlenmeyer de 125 mL. 2. Agregar 4 mL de BaCl2 al 20 % y 2 a3 gotas de timolftaleína. 3. Titular con H2SO4 0,1 N hasta llegar al punto final, en el que se produce la siguiente reacción: 43 c. Cálculos Para calcular la cantidad de C, desprendido como CO2 por la actividad respiratoria en la muestra analizada se aplica la siguiente fórmula: 1. Promediar las cuatro repeticiones de mg C-CO2 de las muestra de suelo. 2. Calcular la cantidad de mg C-CO2 contenida en el blanco. 3. Restar al promedio de la muestra la cantidad encontrada en el blanco. 4. Llevar los resultados a 100 g de suelo seco. Se evaluarán los grupos funcionales Nitritadores y Celulolíticos. 1-Recuento de Nitritadores por la técnica del NMP a. Analizar la función fisiológica de los componentes del medio de cultivo. Medio de cultivo H2O destilada 1000 mL SO4 ( NH4 ) 2 0,5 g K2HPO 4 1,0 g NaCl 0,3 g Mg. SO4 7 H2O 0,3 g Fe SO4 7 H2O 0,03 g CaCO3 7,5 g -Distribuir 3 mL por tubo b. Preparación de diluciones de suelo para la posterior siembra 1. Pesar 10 g de suelo. 2. Colocar en erlenmeyer con 95 mL de agua estéril. 3. Agitar 10 minutos en agitador automático. 4. Dentro de los 10 minutos siguientes agitar a mano vigorosamente por unos segundos. 5. En ambiente estéril transferir 1 mL del centro de la suspensión de suelo a 9 mL de solución fisiológica. Así se obtiene la dilución 10-2. 6. Homogeneizar con vórtex. 7. Repetir la operación hasta obtener la dilución 10-6. c. Siembra 44 Se trabajará en ambiente estéril. 1. Sembrar 0,5 mL en medio para nitritadores. 2. Sembrar 3 tubos por dilución para las diluciones 10-2 a 10-6 incluídas. 3. Incubar en estufa los tubos a 28 ºC por 21 días. d. Recuento de Nitritadores por el método del NMP. 1. Después del período de incubación visualizar el crecimiento de Nitritadores agregando a cada tubo unas gotas de Reactivo de Griess, el cual indica la presencia de NO2 - 2. Así: color rojo indica presencia de nitritos (NO2 - ) ⇒ Existen Nitritadores. Dicho tubo se considera positivo. 3. Con el número de tubos positivos por dilución se determina el número característico y se calcula el NMP de Nitritadores por el método de Mac Grady. Por ej.: El número característico se lee así: a. La última dilución donde todos los tubos o la mayoría son positivos es la primera cifra del número característico. Las dos siguientes son aquellas del número de tubos positivos para cada una de las diluciones siguientes. Ej. : 310 para la dilución 10-2. b. Se busca en la tabla del NMP de Mc Grady (ver Anexo I) el número más probable de gérmenes contenidos en el volumen sembrado de la dilución correspondiente a la primera cifra característica. Para el ej. : 310 corresponde a 4,5 gérmenes/volumen de la dilución 10-2 sembrada. c. Llevar el número de gérmenes por gramo de suelo seco, teniendo en cuenta la humedad del suelo. 2.- Recuento de Celulolíticos por la técnica de recuento de granos de suelo infectados. a. Analizar la función fisiológica de los componentes del medio de cultivo. Medio de cultivo Agar – agar 15 mL Solución Salina Standar de Winogradsky 1 mL suplementada con 2% p/v de NO3K Papel de filtro Una unidad por caja de Petri - Distribuir, en condiciones de esterilidad, 15 mL de agar-agar a las cajas de Petri esterilizadas. - Una vez solidificado el agar-agar, agregar 1 mL de SSS suplementada al 2% p/v con NO3K. Dejar secar. - Agregar a cada caja de Petri, con ayuda de una pinza estéril, un disco de papel de filtro. b. Siembra Se trabajará en ambiente estéril. 1. Trabajar con muestra tamizada con tamiz malla 2mm. 2. Distribuir en forma equidistante en la superficie de la caja de Petri 50 granitos de suelo. Para esta operación emplear pinza estéril, tal como lo muestra el esquema de distribución mostrado en la figura. 3. Incubar en estufa a 28º C por 21 días. 45 c. Recuento de Celulolíticos 1. Contar el número de granos de suelo infectados. 2. Se consideran granos de suelo infectado los que presenten halos de pigmentación, desarrollo de micelio, desintegración de papel alrededor del grano de suelo, etc. En dicho caso se considera que hay crecimiento de Celulolíticos. 3. Los resultados se expresan en porcentaje de infección. Se calcula relacionando el porcentaje de granitos infectados sobre el total de granitos sembrados. UNIDAD TEMÁTICA 10: Microbiología aplicada Proporciones de organismos vivos que constituyen la biomasa microbiana del suelo En el primer gráfico se puede observar que la materia orgánica constituye un 2-10% de la masa total de un suelo. el resto son partículas inorgánicas. Si uno desglosa esa la porción de materia orgánica vamos a contener una fracción pasiva y una fracción activa la cual es susceptible a ser descompuesta. De esta fracción activa un 30-35% está formada por organismos vivos sea por todos los microorganismos que vimos anteriormente y algunos otros organismos de mayor tamaño que corresponden a la fauna del suelo. Si nosotros desglosamos esa parte del gráfico donde se encuentran los organismos vivos vamos a darnos cuenta que en tamaño está mayormente constituida por los hongos 46 Los microorganismos en realidad forman una fracción muy pequeña de la MO. Se considera se encuentran en un 3 - 5% de la MO Grupos microbianos de mayor importancia Como vimos anteriormente los grupos microbianos de mayor importancia son los hongos y las bacterias. En cuanto las bacterias encontramos actinomycetes y cianobacterias. Arthrobacter es el género más abundante en el suelo, depende si el cultivo está en fase exponencial (forma bacilo) o en fase estacionaria (forma coco). En los hongos encontramos géneros como Penisillium, Rhizopus, etc. Funciones favorables de los microorganismos para las plantas A. Intervención en la Génesis del suelo Para los inicios en la primera etapa de la materia orgánica en el suelo fue necesario que haya una colonización por parte de organismos vivos que sean capaces de vivir en un ambiente con carbono inorgánico (dióxido de carbono) y del nitrógeno orgánico (nitrógeno gaseoso) abundantemente presente en el aire. Los microorganismos que poseen estas características son las cianobacterias. Una vez que se establecen, la materia orgánica libera nitrógeno de manera orgánica que quedará disponible para sucesivos desarrollos de seres vivos. También, poseen gran importancia aquellas asociaciones micorrizicas que permiten la exploración del suelo y la captación de nutrientes Podemos concluir que los microorganismos fueron los primeros colonizadores y permitieron el desarrollo de la MO en el proceso de formación de los suelos. B. Fijación de nitrógeno atmosférico (N2) Existen microorganismos que son capaces de utilizar esta fuente de nitrógeno. Estos organismos son llamados diazótrofos. Especialmente se le presta atención a aquellos microorganismos que pueden establecer relaciones simbióticas. C. Aumento de superficie de captación por micorrizas. Una raíz al estar asociada al hongo tiene un aumento de la superficie de captación 47  D. Descomposición de restos vegetales animales y microbianos E. Síntesis de humus Podemos observar que hay una relación entre la descomposición de restos vegetales, animales y microbianos y la síntesis de humus. Los compuestos inorgánicos del suelo pueden venir de los restos o también una parte de estos restos vegetales pueden formar un componente más estable denominado humus. Este humus es una forma orgánica más compleja de distintos elementos aunque existe una fracción que es más fácil de descomponer que otra. Los microorganismos intervienen en la mineralización a través del humus. Si uno analiza la cantidad de compuestos orgánicos que tiene el suelo que provienen de los restos y del humus la mayor parte de la mineralización proviene del humus. Porque en cantidad el humus que presenta una porción más grande en cuanto al peso de una masa de suelo que constituida por los restos F. Solubilización de nutrientes. La importancia de la capacidad de solubilizar en el suelo es ser aprovechada para generar ciertos compuestos pueden pasar a estar disponibles para que las plantas puedan tomarlos de esta manera. Los compuestos insolubles y de fósforo no son captables por la planta. Pero si los solubilizados. Función desfavorable de los microorganismos para la planta. Existen hongos patógenos que atacan las raíces de las plantas. Factores edáficos que influyen sobre la distribución de los microorganismos del suelo Textura y estructura del suelo La textura hace referencia a la proporción de un suelo de partículas de distinto tamaño. La estructura hace referencia a cómo se arreglan estas partículas espacialmente y determina la porosidad que puede llegar a tener ese suelo. Se puede señalar que la ubicación de las hifas de los hongos de alguna manera estabilizan a las estructuras para mantener unidas las partículas entre sí. 48 Contenido de humedad y aireación. En la Gráfica nosotros representamos el desarrollo de la población microbiana en función de distintos contenidos hídricos. En el eje de las abscisas tenemos un suelo que está seco y a su derecha va aumentando su contenido hídrico hasta lograr un encharcamiento Cuando el suelo está totalmente seco el desarrollo microbiano es nulo y luego va aumentando hasta tener un valor óptimo de desarrollo microbiano al 60% CC. Una vez que llega este valor no es el contenido hídrico el que limita al desarrollo microbiano sino, la falta de oxígeno. Entonces, este factor es el que empieza hacer el limitante y provoca la caída de la curva hasta llegar a un punto donde la población microbiana presente es aquella que se desarrolla de manera anaeróbica. Por lo tanto, se mantiene constante a medida que va aumentando el contenido de humedad Un punto a tener en cuenta es el 60% de CC ya que en el mismo se conjuga la mejor disponibilidad de humedad con el mejor contenido de oxígeno para las poblaciones aerobias. En este punto, existe un máximo crecimiento de los organismos. pH El rango óptimo es cercano a la neutralidad (pH 7). No quiere decir que cuando pH estén lejos de la neutralidad no se encuentran microorganismos o se cumplan los procesos degradativos. Sino, que son reemplazados por otros microorganismos que toleran pH alto o pH bajo. Lo más común que podemos encontrar en un suelo es cuando hay una acidificación, donde generalmente las poblaciones se hacen más abundantes en hongos y el proceso de descomposición se lentifica. Sin embargo, el proceso se lleva adelante con un reemplazo del equilibrio de la población normal. Temperatura La temperatura óptima es la que pertenece al rango mesófilo (20 - 40°C). Pero para algunos procesos como el de amonificación el rango termófilo lo favorece y por ende, no podemos hablar de que el rango mesófilo es el único que favorece al desarrollo microbiano. Materia orgánica Es muy importante este factor porque el grueso de los microorganismos presentes en el suelo son de tipo heterótrofo y dependen de un sustrato sobre el cual puedan desarrollarse. Entonces, el contenido de materia orgánica favorece el desarrollo microbiano por esta razón. Mayor cantidad de materia orgánica uno puede suponer que hay mayor cantidad de microorganismos. Pero, esta relación no es directa 49 Formas de evaluar las poblaciones microbianas De una muestra de suelo se pueden seguir diferentes formas para evaluar los microorganismos en el suelo. Una de las formas más comunes es a través de un microscopio. En otra época se utilizaron métodos de cultivo y análisis químico. Más recientemente se han incorporado estudios de proceso.Todos acusan a evaluar una cuestión diferente de la población microbiana. La microscopía en general observa cuestiones morfológicas y determinaciones de Biovolúmenes. En gráficos donde se visualiza el desarrollo microbiano en función a las partículas del suelo y los espacios porosos se realiza esta determinación a partir de técnicas de microscopía. Por otro lado, se han utilizado los métodos de recuento en dónde se pone a disposición un medio de cultivo que es favorable para el microorganismo y muestras de suelo. Se hacen diluciones para luego, realizar el recuento en placa. Este método ha sido muy utilizado en las evaluaciones microbiológicas. Por último, los estudios de proceso implican el conocimiento de las actividades de las enzimas presentes en el suelo relacionadas a la actividad de los microorganismos presentes. Una actividad muy frecuentemente evaluada es la respiración que permite hacer estimaciones de degradaciones de compuestos carbonados o actividades enzimáticas. Observación microscópica directa. Forma y ordenamiento de los microorganismos “in situ” Este tipo de estudios permite establecer la distribución de los microorganismos en relación con los agregados de suelo, partículas de materia orgánica, raíces de las plantas. Uno de los métodos más antiguos consiste en la introducción de un portaobjeto en la tierra y su posterior observación, previa tinción con colorantes adecuados (ácidos, anticuerpos fluorescentes). Se han empleado también cortes finos de suelo para alcanzar este objetivo. Recuento de microorganismos del suelo Para ello se preparan suspensiones de suelo. Una cantidad determinada de la suspensión se distribuye en una superficie conocida de un portaobjeto. Luego de coloreado se observa y recuenta al microscopio. Se puede calcular la cantidad de microorganismos por gramo de suelo. (Si se realizan las mediciones necesarias se puede 50 calcular el biovolumen y con la densidad media de los microorganismos establecer la biomasa microbiana estimada). Actividad biológica del suelo Las actividades de los microorganismos que se miden son metabólicas y enzimáticas. Actividad metabólica La actividad metabólica que se ha medido con más frecuencia es la actividad respiratoria, la cual puede estimarse a través del consumo de O2 o la producción de CO2. La medición más frecuente es la de producción de CO2 a través de su absorción en álcali y posterior titulación. Cabe destacar que al medir CO2 se incluye la actividad microbiana de fermentación y la estimación se disminuye por acción de los organismos autótrofos. (En condiciones normales de aerobiosis tanto la actividad autotrófica como la de fermentación se consideran despreciables frente a la respiración). Actividad enzimática La evaluación de las actividades enzimáticas en el suelo ha sido muy diversa dependiendo del objetivo del estudio. Existen numerosos trabajos en los que se ha medido: actividad sacarolítica, amilolítica, lipolítica, celulolítica, lignolítica, etc. Otras enzimas que pueden cuantificarse son la ureasa, proteasa, fosfatasa, deshidrogenasa. La cuantificación de esta última enzima es una medida indirecta de la actividad respiratoria de un suelo y por su simplicidad, ha sido muy usada en trabajos aunque actualmente ya casi no se emplea. Actividades degradativas En algunos estudios se pretende evaluar la velocidad de degradación de un determinado sustrato. Para ello se suele agregar el sustrato y se mide la aparición del producto. En otros casos se mide la velocidad de aparición de los productos a partir de la degradación de la materia orgánica del suelo (ej: mineralización de compuestos orgánicos nitrogenados que son degradados y entre los productos finales se encuentran el NH4 + y NO3 - , que se pueden medir) Recuento microbiano mediante su cultivo Recuento poblacional Microflora Total es una técnica que en los estudios microbiológicos de suelo tuvo mucha difusión. La misma consiste en realizar recuento de viables en suspensiones de suelo sobre un medio general para que desarrolle la mayor cantidad de microorganismos presentes. Los medios más frecuentemente utilizados son: Agar Extracto de Levadura Glucosado y Agar Extracto de Suelo. Estos medios son los que dan los mejores recuentos. Aún utilizando estos medios nunca se logra recontar la totalidad de los microorganismos presentes. Solo se puede estimar entre un 1 a un 10% de lo obtenido en recuento microscópico directo. Las algas, los quimoautótrofos y muchos otros no desarrollan. A su vez desarrollan pocos hongos ya que estos son inhibidos por el desarrollo bacteriano. Para realizar un recuento de hongos se utiliza un medio selectivo para ellos como es el Agar Rosa de Bengala Estreptomicina. Recuento de Grupos funcionales Se define a los Grupos funcionales o fisiológicos del suelo como grupos de microorganismos que en el suelo cumplen una determinada función. Por ejemplo el grupo de celulolíticos incluye microorganismos que no están emparentados taxonómicamente pero tienen en común su capacidad de degradación de la celulosa. Para su determinación se emplean medios selectivos. A menudo se usan medios que usan sílico gel como solidificante, el que se impregna de los nutrientes necesarios para el grupo funcional que se desea hacer desarrollar. Hay ciertos grupos fisiológicos que no se desarrollan formando colonias visibles sobre un medio sólido. Para estos se utilizan los recuentos por NMP (Número Más Probable) en medios líquidos y su determinación se realiza por agregado de un reactivo. Estimación de biomasa microbiana Biomasa microbiana por Fumigación-incubación 51 Una de las determinaciones que en los últimos años ha tenido gran difusión en la investigación relacionada a la población microbiana global de un suelo es la de Biomasa Microbiana. Esta consiste en aplicar la acción de un fumigante (cloroformo) a una porción de suelo y luego reinocularlo; finalmente se mide la cantidad de CO2 que se produce a partir de la muestra. La masa microbiana se estima por la relación que existe entre el CO2 producido en las muestras fumigadas y en otras que no se le aplica fumigación. En las muestras fumigadas hay una extramineralización de la materia orgánica provocada por la descomposición de los microorganismos muertos por acción del fumigante. Como aditamento de esta técnica se puede estimar la porción de N y F contenido en la masa de microorganismos. Medición de ATP El empleo de la medición de ATP como estimador de la masa microbiana se fundamenta en que este compuesto está relacionado a células vivas, ya que cuando se libera al suelo es degradado muy rápidamente. Para estimarlo se realiza una separación de los componentes sólidos del suelo y se combina con una enzima que en presencia de ATP emite luz. La intensidad de la luz emitida es medida en un luminímetro. (Cuanto mayor luz es emitida hay más cantidad de ATP y por lo tanto mayor masa microbiana). Respiración inducida por incorporación de sustrato Esta metodología consiste en medir la cantidad de CO2 producido por la respiración en una muestra de suelo inmediatamente después de la incorporación de un sustrato fácilmente descomponible (generalmente se emplea la glucosa). Generalmente se realiza la medición dentro de las tres horas posteriores a la incorporación del sustrato. Dada las pequeñas cantidades de CO2 que se miden debe realizarse con equipos como un cromatógrafo de gases, un analizador de gases o un medidor de CO2 por absorción de luz infrarrojo. UNIDAD TEMÁTICA 11: RIZÓSFERA La rizósfera es la parte del suelo donde el sistema radical induce la proliferación microbiana. Ha sido definida por Hiltner (1904) como el volumen de suelo influenciado por la presencia de raíces de una planta viva, cuya extensión puede variar de acuerdo al tipo de suelo, la especie de planta, su edad y otros factores. En consecuencia, es el lugar físico de interacción entre la planta y el microorganismo, en donde los microorganismos influyen sobre el crecimiento de la planta y la planta actúa sobre el crecimiento de ellos. En la rizosfera vamos a diferenciar : - Rizoplano: es el plano de contacto que tienen las raíces con el suelo o superficie radical - Endorizosfera: zona de tejido cortical donde pueden proliferar los microorganismos - Suelo rizosferico: comprende entre 1 - 2 mm de suelo a partir de la superficie de la raíz, aunque algunos autores consideran que el efecto puede extenderse hasta 4 o 5 mm. La rizósfera es una zona especial del suelo que se caracteriza por la presencia de exudados radicales, formados por compuestos de bajo peso molecular como azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos, mucigel y lisados de la raíz liberados de la autólisis de células radicales. Se estima que los exudados rizosféricos pueden llegar a contener entre 10 y 44% del carbono asimilado en la fotosíntesis y pueden ser excretados en dicha zona (Primavesi, 1984). 52 La estimulación en esta zona es diferencial ya que no todos los grupos fisiológicos se ven beneficiados. En general los microorganismos más exigentes en factores de crecimiento son los que proliferan en mayor proporción ej. bacterias de los géneros Pseudomonas sp., Azospirillum sp., Beijerinkia sp., etc. Y así, podemos decir que, en general, esta zona y los compuestos mencionados afectan positivamente a la mayoría de los microorganismos de este hábitat que son heterótrofos; sin embargo, los microorganismos de esta zona del suelo mantienen un equilibrio inestable debido por ej. a la introducción de distintas especies de plantas en el suelo. Al mismo tiempo, en esta zona los microorganismos realizan una serie de transformaciones movilizando ciertos nutrientes, produciendo sustancias promotoras del crecimiento y actuando como antagonistas de patógenos. La presencia de microorganismos benéficos alrededor de la raíz establece y acelera procesos bioquímicos que influyen sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas, lo que está asociado con un incremento de elementos químicos disponibles y la producción de sustancias de crecimiento o de control de patógenos. Por lo tanto, la rizósfera es el "entorno de mayor actividad física, química, y principalmente biológica ya que existe un efecto recíproco entre ambos organismos El efecto de la rizósfera sobre un microorganismo se mide a través del coeficiente o cociente rizosférico (R/S), que representa la cantidad del microorganismo en la zona de la rizósfera (R) en relación a la cantidad que hay en el suelo no rizosférico (S). Esta relación puede modificarse bajo la acción de diferentes factores, los cuales actúan no solo directamente, sino principalmente en forma indirecta, por medio de sus influencias sobre el crecimiento de las plantas y con la transformación correspondiente en la cantidad y calidad de las raíces formadas. COCIENTE RIZOSFERICO: R/S R: microorganismos en rizosfera S: microorganismos en suelo rizosférico La ecuación sirve para relativizar el número de microorganismos que existen normalmente en un suelo. Se podría deducir que si el cociente rizosférico es mayor a 1 ese conjunto de microorganismos está estimulado en la zona rizosférica. Si este valor es cercano a 1 no hay un efecto de estimulación porque no hay cambio de número. Si ese valor tomó un valor entre 0 y 1 el organismo en realidad está perjudicado en esa zona. Conjunto de microorganismos que se desarrollan en la rizosfera y poseen interés agrícola. Micorrizas: constituye una asociación simbiótica entre un hongo y la raíz de una planta superior. Otra definición: organismos simbióticos que mejoran la captación de nutrientes. En esta asociación, la planta le proporciona al hongo carbohidratos (producto de su fotosíntesis) y un nicho ecológico para completar su ciclo de vida; mientras que el hongo, a su vez, le permite a la planta una mejor captación de agua y nutrientes minerales de baja disponibilidad en el suelo (principalmente fósforo). Ambos, hongo y planta, salen beneficiados, por lo que la asociación se considera de tipo una simbiosis. A partir del estudio de estas asociaciones se han visto o se han planteado que existe una serie de tipos de micorrizas. En general se las puede clasificar en dos tipos básicos: - Ectomicorrizas: agrupa aquellos micorrizas que se caracterizan porque el micelio fúngico no penetra en las células del córtex radical y forma además una envoltura alrededor de las raíces denominada manto. Sin 53 embargo, actualmente se reconocen siete subtipos de micorrizas donde cada uno de los subtipos se diferencian entre sí porque forman estructuras morfológicas características. Estas micorrizas que en general se asocian árboles y tienen importancia en producciones forestales Las Ectomicorrizas se caracterizan porque las especies de hongos que forman este tipo de micorrizas presentan hifas tabicadas. El desarrollo fúngico forma un manto externo de hifas alrededor de la raíz que le da una apariencia única a la raíz micorrizada. Algunas de estas hifas se prolongan hacia el suelo circundante, mientras que otras hifas penetran la raíz. Estas últimas ocupan los espacios intercelulares de la corteza radical. Este desarrollo micelial característico se denomina “red de Hartig”, el que no avanza más allá de la endodermis. Las raíces colonizadas con ectomicorrizas manifiestan cambios morfológicos, algunos de los cuales son observables a simple vista o con ayuda de una lupa. Estas raíces son más cortas y gruesas que las no infectadas, además presentan una típica ramificación por sucesivas bifurcaciones dicotómicas. Se considera que un 10% de la flora mundial desarrolla ectomicorrizas, siendo particularmente abundantes en especies de interés forestal perteneciente a las familias Pinaceae, Betulaceae, Fagaceae, Ericaceae, Myrtaceae, Juglandaceae y Salicaceae. En la imagen anterior podemos observar un corte de una raíz y en la parte rosada se encuentra el micelio del hongo. Podemos decir que la micorrización en una planta forestal se puede visualizar a simple vista por la presencia del manto que contienen y esto no sucede en las endomicorrizas - Endomicorriza: el tipo más importante es el Vesículo-Arbuscular ya que se estima que hasta un 90% de las plantas podrían tener este tipo de asociación. Nosotros nos vamos a enfocar en: Micorrizas vesiculo arbusculares (utilizadas en citrus) Este tipo de asociación se caracteriza porque el hongo micorrícico penetra entre las células de la raíz y algunas hifas desarrollan en su citoplasma una estructura ramificada característica denominada “arbúsculo”. Por lo tanto a diferencia de los hongos ectomicorrícicos, su desarrollo en el interior de la raíz es tanto intra como intercelular. Eventualmente las hifas del hongo forman otras estructuras ovoides que se denominan “vesículas”, las cuales contienen material lipídico. Las vesículas son consideradas como sitios de almacenamiento, mientras que el arbúsculo se considera es el sitio de mayor intercambio entre la planta y el hongo. Las raíces infectadas con estas micorrizas no muestran los cambios morfológicos descritos para las asociaciones que involucran hongos ectomicorrícicos, y por lo tanto para su observación se requiere someter la raíz a un tratamiento con una base fuerte y luego teñirla con un colorante para hongos, como el azul de tripán y posterior observación microscópica. Esto permite ver las hifas, las vesículas y los arbúsculos Estructuras características de las micorrizas VA Como dijimos hoy la formación de arbúsculos y vesículas en característicos de este tipo de micorrizas. También existen otras estructuras como hifas externas y esporas. Otra diferencia importante es que los hongos formadores de MVA no han podido ser cultivados en el laboratorio, por lo que parece que dependen completamente de su planta hospedera para la obtención de sus fuentes de carbono, a diferencia de las ectomicorrizas. Para estas últimas se han desarrollado medios de cultivo sintético, lo que permitió desarrollar inoculantes comerciales. 54 Micorrizas ericoides (utilizadas en la produccion de arandanos) Dentro del tipo endomicorriza subtipo ericoides que se caracteriza por formar asociaciones con las ericáceas arándano. La característica de este tipo de endomicorrizas es la formación de pelotones o superenrollamientosde hifas dentro de las células de la planta. Se ha demostrado que la duración de esta asociación no supera las 11 semanas. Mecanismo por el cual las micorrizas mejoran el crecimiento vegetal En general, los hongos micorrícicos incrementan el área fisiológicamente activa de la raíz , aumentando la superficie de captación de la planta micorrizada. De esta forma la planta cuenta con la ventaja de poder alcanzar fuentes nutrientes poco móviles (especialmente el P) en relación a una raíz no micorrizada. En la mayoría de los suelos, gran parte del P se encuentra en baja disponibilidad, ya sea porque está bajo forma insoluble o porque está asociado con otros compuestos. La fuente de P disponible para las plantas es la que se encuentra en la solución del suelo, que se equilibra a partir de la fase sólida del suelo. Cuando el ritmo de absorción de los iones PO4H= y/o PO4H2 - por parte de la planta es superior al de desplazamiento de los mismos se forma una zona de agotamiento de este nutriente alrededor de la raíz, por lo que la planta micorrizada tiene la ventaja de poder explorar sitios del suelo cuyas raíces no podrían alcanzar si no estuviera colonizada por el hongo. Una raíz sin micorrizas vesiculo arbusculares no puede captar de la zona rosada ningún nutriente. Cuando se capta ese nutriente poco móvil se genera una zona de agotamiento de nutrientes generada inmediatamente alrededor de la zona de la raíz. si la raíz se encuentra micorrizada las hifas del hongo van hasta la zona pintada en rojo donde la raíz ya no puede captar este nutriente inmóvil. En forma adicional, las plantas micorrizadas mejoran la captación de agua y otros nutrientes como Zn, Mg, Mn, N, K y Ca. La presencia de manto de hifas en plantas infectadas con hongos ectotróficos, le provee una protección física al ataque de nematodos y patógenos a la raíz. Rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) Son bacterias benéficas colonizadoras de la rizosfera que inoculadas a las semillas inducen el aumento del crecimiento de los cultivos traduciéndose muchas veces en incrementos de rendimiento Estos incrementos de rendimientos suelen ser de un 5 a 30% en comparación con los controles que no recibieron inoculación Algunas de las bacterias más estudiadas comprenden especies de Acetobacter, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas, Herbaspirillum, etc. En la producción nacional se utilizan bacterias de los géneros Azospirillum, Bacillus y Pseudomonas 55 Mecanismos de promoción del crecimiento Pueden citarse esta serie de mecanismos teniendo en cuenta de que no todas las bacterias poseen todos los mecanismos pero en general, se van a caracterizar por tener un mecanismo principal acompañado de otros. Estos mecanismos son: - Producción de fitohormona (hormonas que mejoran el crecimiento del vegetal) - Fijación de N2 asimbiótica (ya que las PGPR se ubican en la zona rizosferica y no forman una estructura que genere una simbiosis verdadera con las raíces de la planta por este motivo, es una fijación asimbiotica) - Producción de sideroforos (mejora el crecimiento vegetal, para que los patógenos que ataquen las raíces lo hagan van a requerir una cantidad de hierro presente en la zona rizosferica. Entonces, estos organismos bloquean el hierro) - Síntesis de antibióticos enzimas que degradan la pared celular de hongos y/o compuestos fungicidas (biocontrol de enfermedades). - Disminución del contenido de etileno en el ambiente rizosferico - Solubilización de los fosfatos y otros minerales (se trata de bacterias que cambian de la forma insoluble a la forma soluble minerales aumentando la disponibilidad de los mismos) Legislación regulatoria de productos biológicos PGPR. Resolución 0264/ 2011 del SENASA - Concentración mínima para los productos formulados en base azospirillum al vencimiento de 1x10^7 ufc/ml o gr. - Los productos con inoculados y PGPR deberán ser sometidos a tres campañas de ensayos de eficacia en 3 zonas agroecológicas diferentes con evaluación estadística Azospirillum Organismos rizosféricos que estimulan el crecimiento radical. Es el microorganismo que más se comercializa como PGPR en Argentina. Tiene una capacidad de aumentar el crecimiento de las raíces de las plantas por producción de fitohormona y se desarrolla muy bien en el ambiente rizosferico. Existen varias especies dentro del género azospirillum pero la más importante es la azospirillum brasilense (cepa az39) Efecto principal de las azospirillum en las raíces Aumento del desarrollo radical. Como consecuencia: - mayor número de raíces laterales - mayor superficie absortiva total Secreción de fitorreguladores como: - Auxinas - Citocininas - Giberelinas Efecto de los azospirillum en trigo y maíz A partir de los resultados de la red de ensayos que lleva INTA en nuestro país (en distintas zonas agroecologicas) La respuesta a la aplicación de azospirillum brasilense es de: Trigo 249 kg por hectárea Maíz 400 kg por hectárea Efecto de azospirillum en co inoculación con rizobios en leguminosas Aumento de los puntos de inflexión. Como consecuencia: - Mayor cantidad de nódulos formados. - Mayor masa nodular Pseudomona Organismo rizosféricos que actúan como solubilizadores de fosforo o biocontroladores. 56 La especie pseudomona fluorescens es utilizada por su capacidad de producir enzimas fosfatasas y ácidos orgánicos que incrementan la recuperación del fósforo nativo de suelo y mejora la captación del aportado por fertilización La otra Pseudomona que se comercializa en Argentina es Pseudomona chlororaphis aurantiaca esta es de tipo biocontroladora UNIDAD TEMÁTICA 12: Ciclo Biológico del Carbono En la figura podemos ver el ciclo general del carbono y lo que podría llegar a pasar en un ecosistema agropecuario. El carbono que proviene de los restos de animales y vegetales va a formar parte del suelo. Estos materiales carbonados y la materia orgánica pueden ser degradados por actividad respiratoria y liberar dióxido de carbono por parte de los organismos que luego, por fotosíntesis puede ser fijado bien por los vegetales o por los microorganismos fotótrofos y también por quimioautótrofos. El C se recicla a través de cuatro principales depósitos: La atmósfera Los océanos y otros ambientes acuáticos Los suelos Sedimentos y rocas El contenido de C en el suelo varía con el tipo de suelo, regiones climáticas, vegetación característica, prácticas de manejo, etc. Proporciones: Suelos minerales: 1-3 % C Praderas: 6-10% C Suelos turbados: 30 - 40% C Uno de los conceptos a tener en cuenta en el flujo del carbono es el siguiente: La materia orgánica fresca que llega al suelo, es decir, restos de vegetales, animales y microorganismos puede ser mineralizada por los microorganismos del suelo liberando minerales como nitratos, sulfatos, dióxido de carbono, etcétera. Pero también estos restos vegetales frescos son mineralizados y re sintetizados algunos de ellos para formar ácidos y así de esta manera formar parte del humus del suelo. 57 Las tasas a las cuales se mineralizan los compuestos carbonados a partir del humus son menores que las tasas de mineralización de la materia orgánica fresca. Sin embargo, la cantidad de Humus que hay en el suelo es mucho mayor que la cantidad de materia orgánica fresca que proviene de restos de cosecha de los cultivos. Por lo tanto, los aportes a partir de humus son mayores que los aportes de la materia orgánica fresca. Los residuos frescos que se encuentran en mayor cantidad en los sistemas agropecuarios son provenientes de residuos de la cosecha y la mineralización de los mismos depende de varios factores tales como del estadio fenológico en cual se encuentra la planta o que parte de la planta se encuentra ya que estos factores afectan directamente la composición química y por lo tanto, a la degradación por parte de los microorganismos. Los microorganismos utilizan el C como constituyente celular (40%) y el resto en respiración o fermentación. Además, un 40% es liberado a la atmósfera. Materia orgánica: los organismos autótrofos son los responsables de la síntesis de MO a partir de CO2 y CH4. MO fresca: constituida por los aportes vegetales, células microbianas muertas y restos de animales. Estos son sometidos a procesos de degradación con participación de los equipos enzimáticos especializados de los microorganismos (reducción del tamaño de partículas). MO nativa en humus: formado por procesos de descomposición y resistencia. posee estructuras diferentes a la MO original. Es muy estable, posee enlaces mas fuertes que brindan mayor resistencia ante el ataque microbiano. Por este motivo, da fertilidad a largo plazo en el suelo. Tambien, da estabilidad a la estructura. Su contenido representa el 2-3% del suelo. Factores que condicionan la velocidad de descomposición de la materia orgánica Naturaleza del material vegetal: Composición química promedio del tejido vegetal: Celulosa 15-60% Hemicelulosa 10-30% Lignina 5-30% Proteínas y ac. nucleicos 2-15% Ácidos alifáticos 5-30% Lípidos 1 - 25% Cenizas 1-13% Relación C/N Trigo: 70-100 Si los restos vegetales provienen de los primeros estadios fenológicos la composición química de los mismos tendrá mayor cantidad de carbohidratos solubles y menos del tipo estructural. Por tanto, la mineralización será más rápida. Tampoco es lo mismo que queden restos de un tallo de maíz o de sus hojas. El otro punto a tener en cuenta en la degradación de compuestos carbonados es la relación entre el carbono y nitrógeno que tenga el resto ya que esto limitará el crecimiento de los microorganismos. La descomposición de la MO tiene dos funciones para los microorganismos: Abastecerse de energía para su crecimiento 58  Suministrar C para la síntesis de nuevos materiales celulares. Hongos y actinomycetes asimilan 30-40% C y el resto lo liberan como CO2 o se acumula como producto de desecho Bacterias aerobias asimilan 5-10% C Bacterias anaerobias asimilan 2-5%C Asimilación: proceso por el cual el sustrato se convierte en C protoplasmático. La asimilación es una forma de inmovilización ya que reduce la cantidad de nutrientes disponibles para la planta. Eficiencia: efectividad de convertir C del sustrato a C celular. La degradación de la MO es propia de microorganismo heterótrofos e indica el nivel de actividad microbiana. La descomposición de humus refleja la disponibilidad de C del suelo. La liberación de CO2 es una estimación de la biodegradabilidad de los compuestos. La tasa de liberación de CO2 durante la mineralización del humus varía según el tipo de suelo. En condiciones de laboratorio (20.30°C), es de 5-50 mgCO2/kgMS/día. En el campo es de 500 - 1000mg CO2/m2/día Factores que rigen la descomposición del humus Nivel de MO del suelo. La liberación de CO es proporcional al nivel de MO (la mineralización del C está relacionada con el contenido de C orgánico en el suelo) Temperatura. Puede estar por debajo del punto de congelamiento pero un aumento acelera la descomposición (30-40°C temperatura optima). Ph. Neutro o ligeramente alcalino (para bacterias) Humedad. Afecta la respiración en el suelo. debe estar entre 60-70 CC para que se de la maxima actividad de los microorganismos. Compuestos carbonados en restos vegetales En los restos vegetales vamos a encontrar compuestos carbonados que pueden ser: - Estructurales: celulosa, hemicelulosa y lignina - De reserva: almidón. Cada uno de ellos tiene distinta complejidad en cuanto a la facilidad de degradación por parte de los microorganismos. Almidón Es un carbohidrato de almacenamiento en vegetales (amiloplastos). Lo que llamamos almidón es la mezcla de dos polisacaridos, la amilosa y la amilopectina. Ambos están formados por unidades de glucosa, en el caso de la amilosa unidas entre ellas por enlaces a 1-4 lo que da lugar a una cadena lineal. En el caso de la amilopectina, aparecen ramificaciones debidas a enlaces a 1-6. La velocidad de descomposición es mayor que la de la celulosa, lignina y hemicelulosa. No otorga mucho al humus. Composición química del Almidón Químicamente se encuentra compuesto por amilosa y amilopectina. Microorganismos responsables de la degradación del almidón - Grupo funcional: grupo de microorganismos que pueden o no estar vinculados taxonómicamente pero que llevan adelante la misma actividad. El grupo funcional amilolítico es diverso (compuesto por bacterias gram + y gram - ,hongos y actinomycetes) por ejemplo Bacillus sp. En general la mayoría de estos microorganismos poseen la enzima amilasa que es capaz de degradar el almidón. Bacterias: Bacillus, Clostridium, Cythophaga, Pseudomonas, Micrococus, Flavobacterium. Hongos: Aspergillus, Fusarium, Rhizopus. Actinomycetes: Nocardia, Streptomyces, Micromonospora. Enzimas que intervienen en la degradación. Las enzimas que intervienen son amilasas extracelulares y podemos nombrar: 59 - Alfa-amilasa: Son endoenzimas rompen en el interior de la cadena Los enlaces glucosidicos Alfa 1-4 En amilosa libera maltosa y glucosa. En amilopectina libera dextrinas (alto PM) - Beta amilasa: Es una exoenzima quiere decir que corta la cadena en los enlaces glucosa-glucosa de los extremos. Rompe los enlaces Alfa 1-4 glucosídicos liberando maltosa y dextrinas. Actua en amilosa y amilopectina - Alfamilo 1-6 glucosidasa: Rompen los enlaces Alfa 1- 6 dónde se encuentran las ramificaciones de las amilopectinas. Hidroliza en los puntos de ramificación en la amilopectina. Celulosa Compuestos carbonados formados por monómeros de glucosa pero la unión de estos monómeros es distinta por lo tanto la degradación por parte de los microorganismos es distinta. Se encuentran las paredes celulares y a medida que las células van creciendo hay más depósito de celulosa y hemicelulosa. La celulosa se encuentra organizada en fibras y microfibrillas constituyendo entre el 35 - 50% del peso seco de la biomasa vegetal Composición química de la celulosa. Homopolisacárido de monómeros de glucosa con enlaces Beta 1- 4 glucosídicos. Forman cadenas lineales y a su vez, estas cadenas lineales se unen a través de enlaces puente de hidrógeno. 60 Microorganismos responsables de la degradación de celulosa (CELULOLÍTICOS) El grupo funcional de celulolíticos comprende a microorganismos variados integrado por bacterias, actinomicetos (BACTERIAS), hongos y protozoos. Las bacterias son degradadoras activas y algunas de ellas comprenden estos microorganismos celulolíticos, es decir, que atacan a la celulosa nativa y la degradan hasta su fin. Los géneros de estos celuloliticos verdaderos comprenden al género Cytophaga y Sporocytophaga SON VERDADEROS PORQUE TIENEN EL C1 Degradación enzimática de la celulosa Polisacárido es hidrolizado por un complejo enzimático que no se encuentra completamente caracterizado y es conocido en su conjunto como celulasas. El primer paso en la degradación enzimática de la celulosa tiene que ver con la intervención del complejo enzimático C1. Este complejo enzimático está pobremente caracterizado y solamente lo contienen los celulolíticos verdaderos mencionados anteriormente. Las enzimas de este complejo enzimático 1 rompen los punte de hidrógeno entre las cadenas lineales paralelas de glucosa y la celulosa queda en un estado llamado celulosa activada. 1° EL C1 ROMPE EL PUENTE HIDRÓGENO DE LA CELULOSA ACTIVA PARA ACTIVAR LA GLUCOSA. Una vez que se rompen estos enlaces la celulosa nativa queda activada y es atacada por el complejo enzimático Cx Compuesto por tres enzimas que actúan extracelularmente. Estas enzimas actúan fuera de las células y pueden ser: - Endoenzimas: aquellas que actúan en la región interna de la molécula cortando y dando fragmentos más cortos. (Beta 1 - 4 glucanasa. Libera celobiosas y polisacáridos) - Exoenzimas: aquellas que actúan cortando desde los extremos de la molécula. (Beta 1 - 4 glucanasas. Libera celobiosas, celo triosas y polisacáridos de cadenas mas cortas). LA MAYORÍA SON EXTRACELULARES (LIBERADAS POR FUERA DEL MICROORGANISMO. PERO A LA VEZ, SON ENDO O EXO ENZIMAS A través de celobiosa, celotriosa y celotetralosa la Beta-glucosidasa libera los monómeros de glucosa que puede ser degradada bajo condiciones ecológicas de aerobiosis y anaerobiosis. 2° A TRAVÉS DEL Cx LAS ENZIMAS (EXO Y ENDO) QUE CORTAN LAS CADENAS FORMANDO CELOBIOSA, CELOTRIOSA Y CELOTETRALOSA (DE 2 A 4 MONÓMEROS). LIBERA ENZIMAS La última etapa de la degradación de la celulosa la cataliza la beta glucosidasa que hidroliza la celobiosa, celotriosa y otros polisacáridos en monómeros de glucosa. 3° TRANSFORMA LOS DÍMEROS Y TRÍMEROS EN GLUCOSA De acuerdo a las condiciones ecológicas de oxigenación del medio la glucosa puede tener dos vías de degradación: 61 - En condiciones aeróbicas los microorganismos siguen el metabolismo respiratorio y la glucosa se degrada a dióxido de carbono, agua material celular, ac. urónicos, di y trisacáridos (Estos últimos van a ir a parar al pool de humus). - En condiciones anaeróbicas son los procesos fermentativos los que predominan y la glucosa va a ser degradada a dióxido de carbono hidrógeno molecular, material similar, etanol y ácidos de cadena corta (ácido acético, ácido fórmico, ácido succínico, butírico y láctico ) Los microorganismos que pueden degradar totalmente la celulosa y contienen todos los complejos enzimáticos anteriormente mencionados son las bacterias de los géneros cytophaga y sporocytophaga. EL COMPLEJO ENZIMÁTICO LIMITANTE PARA DEGRADAR LA CELULOSA ES EL C1. NO TODOS LO TIENEN Factores que determinan la degradacion de la celulosa Nivel de N disponible: se requiere de 1 unidad de N por 35 unidades de celulosa oxidada. Tres partes de N se incorporan a la célula microbiana por 100 partes de celulosa que descompone. Son fuentes de N las sales de NH4, el estiercol y compuestos orgánicos nitrogenados. En algunos suelos, el P puede ser limitante del proceso. Temperatura: desde el punto de congelamiento hasta los 65°C. el calor aumenta la velocuidad de trasnformacion del sustrato, debido al efecto sobre la accion enzimatica. Aireacion y humedad: el metabolismo de la celulosa es reducido en medio deficiente de O2. A altos niveles de humedad proliferan bacterias celuloliticas anaerobias y disminuye el numero de hongos y actinoicetes. A niveles moderados de humedad crecen bacterias aerobias y hongos celuloliticos. Ph: el proceso se da en niveles de ph bajos (pH a 45°C inhibe nodulación - Si hay una combinación de temperatura + sequía → disminución de hasta 5 unidades log. en la superficie de la semilla - Siembra directa: evita calentamiento excesivo del suelo y protege a los rizobios en estos sistemas. En nuestra zona en maíz, hay una diferencia promedio de 2°C en suelos cubiertos, por lo tanto, el efecto es marcado. Nutrientes Algunos nutrientes tienen efectos positivos en el desarrollo del proceso de fijación biológica del nitrógeno. - El fósforo es positivo para el desarrollo ya que las leguminosas lo requieren en buenas cantidades si el suelo es deficiente en fósforo una fertilización adecuada con fósforo facilita o mejora el proceso de fijación. Esto se explica porque en general hay un mejor crecimiento de la planta y consecuentemente eso mejora el proceso simbiótico y de esa manera se facilita la fijación de nitrógeno. - Un déficit de azufre podría comprometer la formación de la nitrogenasa también hay un menor número de nódulos. El azufre se encuentra presente en la nitrogenasa. Los átomos de hierro se encuentran unidos a los átomos de azufre, por lo tanto cuando la planta establece simbiosis demanda un mayor consumo de S del suelo. cuando se encuentra en deficiencia genera un problema de fijación de N y del desarrollo de la planta. - Otros nutrientes que se necesitan en menor cantidad son los micronutrientes como hierro y molibdeno presente en la nitrogenasa y el magnesio (El ATP que utiliza la nitrogenasa viene en forma de sales de magnesio). Generalmente estos micronutrientes suelen venderse junto a los inoculantes como micronutrientes que facilitan el proceso de fijación. En general el micronutriente no está contraindicado pero puede ser problemático si los vehículos con los cuales son agregados junto al inoculante de la semilla no son los adecuados pueden generar algún tipo de problema. NO SON MALOS PERO SE DEBE TENER CUIDADO CON LOS VEHÍCULOS EN LOS CUALES SE AGREGAN EN EL PROCESO DE INOCULACIÓN. Fotosíntesis Si la fotosíntesis se encuentra comprometida de alguna manera, los microorganismos tienden a no formar los nódulos. Por lo tanto la planta va a estar afectada negativamente, va a producir menos carbohidratos necesarios para esta simbiosis. Pero a su vez cuando está desarrollándose en ausencia de suficiente luz como para hacer fotosíntesis elimina etileno (que afecta la formación de los nódulos). Presencia de nitrógeno mineral La presencia de N excesiva en el momento de la simbiosis juega un rol negativo al establecer esta simbiosis. Para que el N pase a amoniaco en un proceso fijador de N gasta 16 ATP y la planta gasta 8 ATP para absorber el N mineral presente en el suelo es obvio que van a existir mecanismos para anular el proceso de invasión por parte de los microorganismos cuando hay una cantidad de N mineral disponible en el suelo ya que la planta se ahorra energía. Si hay exceso de nitrógeno mineral se producen una serie de eventos para que los nódulos no se formen: - Disminuye la producción de flavonoides - Abortan canales infectivos - Disminuye la formación de pelos absorbentes (por donde ingresan los rizobios) - Disminuye la actividad de la nitrogenasa No es recomendable la fertilización con nitrógeno cuando se siembra una leguminosa. Si hay una cantidad de N presente en el suelo (nitrógeno mineral presente naturalmente del suelo provocada por mineralización del suelo) y nosotros agregamos nitrógeno en el fertilizante podemos comprometer el establecimiento de la simbiosis. Si se le agrega el fertilizante con nitrógeno a una leguminosa en las etapas tempranas de la planta, la misma va a empezar a utilizar este nitrógeno y llega un momento va a presentar hambre de nitrógeno ya que esta simbiosis no se pudo establecer pH En rizobios en alfalfa el PH