Cours Biologie Cellulaire SVI S1 2018 PDF

Cours de Biologie Cellulaire, SVI S1 Pr Qamar Lahlimi Alami Introduction à la biologie cellulaire I. Composition chimique de la cellule II. Méthodes d’étude de la cellule III. Membrane plasmique IV. Hyaloplasme V. Noyau VI. Système de conversion d’énergie (mitochondrie, chl...

Cours de Biologie Cellulaire, SVI S1 Pr Qamar Lahlimi Alami Introduction à la biologie cellulaire I. Composition chimique de la cellule II. Méthodes d’étude de la cellule III. Membrane plasmique IV. Hyaloplasme V. Noyau VI. Système de conversion d’énergie (mitochondrie, chloroplaste) VII. Système endomembranaire (Réticulum endoplasmique, Appareil de Golgi et Systèmes vésiculaires : endosomes, lysosomes, peroxysomes) 1 INTRODUCTION Théorie cellulaire émise au 18ème siècle : « La cellule est la plus petite unité structurale, fonctionnelle et reproductrice de tous les êtres vivants ».. Toute cellule dérive d’une cellule préexistante. Elle peut constituer, à elle seule, un organisme unicellulaire (ex : bactérie, protiste, champignon), soit s’assembler avec d’autres cellules pour former un organisme (animaux, végétaux). Une cellule méristématique est capable de se différencier en tous types de cellules d’un organisme : c’est la totipotence. Les cellules sont constituées de molécules (lipides, protéines, glucides), elles-mêmes formées d’atomes (C, O, H, …). Niveaux de structuration du monde vivant A partir des années 50, on caractérise deux grands types de cellules : cellule procaryote (pas de vrai noyau, ex : bactérie) et cellule eucaryote (noyau délimité par l’enveloppe nucléaire, ex : cellules animale et végétale, champignons). Cellule procaryote Cellule eucaryote 2  Caractères distinctifs Cellule procaryote Cellule eucaryote Pas de noyau Noyau délimité par une enveloppe nucléaire Division cellulaire par scissiparité Division cellulaire par mitose et méiose Pas d’organites, à part des replis de Nombreux organites la membranes :les mésosomes Paroi glycoproyéique Paroi pectocellulosique chez les végétaux Pas de cytosquelette Cytosquelette (microtubules, …) Les cellules eucaryotes sont des cellules différenciées, qui présentent une spécialisation structurale et fonctionnelle. Les cellules d’un organisme donné sont caractérisées par des états de différenciation différents mais possèdent le même génome : c’est l’expression de gènes spécifiques qui explique la différence. Les 2 grands types de cellules eucaryotes sont les cellules animales et les cellules végétales. 3  Cellule animale Cellule végétale Forme circulaire Forme géométrique Uniquement membrane plasmique Paroi pectocellulosique Plusieurs petites vacuoles Une seule grande vacuole Respiration Chloroplastes, photosynyhèse Les champignons sont aussi des organismes eucayotes, unicellulaires ou pluricellulaires. Ex : levures, Aspergillus. Et les virus, sont-ils des cellules ? Les virus, ne sont considérés ni comme cellules eucaryotes ni comme cellules procaryotes (ce ne sont pas des cellules) ; ce sont des éléments qui ne possèdent ni noyau ni cytoplasme et ne peuvent se reproduire qu’en parasitant une cellule hôte en détournant la machinerie cellulaire. C’est un état acaryote. 4 Chapitre I COMPOSITION CHIMIQUE DE LA CELLULE Les cellules sont en grande partie composées d’eau, jusqu’à 90% de leur poids. Toutes les réactions chimiques qui ont lieu dans les cellules sont en phase aqueuse. L’eau et les sels minéraux sont les molécules minérales. En s’associant à l’hydrogène, l’oxygène et l’azote (et d’autres atomes en plus faible quantité) les atomes de carbone forment les 4 grandes familles de molécules qui composent les cellules : protéines, lipides, glucides et acides nucléiques. Ce sont les molécules organiques. MOLÉCULES MINÉRALES : MOLÉCULES ORGANIQUES : Eau, sels minéraux Protéines, glucides, lipides et acides nucléiques Molécules ne contenant pas de Molécules à base de carbone sous carbone forme de chaînes carbonées Unies par des liaisons ioniques Unies par liaisons covalentes De petite taille, peuvent servir de très petites ou très grandes tailles support structural aux êtres vivants et servent de molécules structurantes Appelées aussi molécules inorganiques I – Les molécules minérales 1- L’eau a- Structure de la molécule d’eau : C’est une petite molécule. L’atome d’oxygène et l’atome d’hydrogène occupent les sommets d’un triangle. Ils sont liés par des liaisons covalentes. - La molécule d’eau est une molécule polaire : les électrons du nuage électronique sont inégalement répartis : défaut d’électrons au niveau de l’hydrogène et excès au niveau de l’oxygène. Cette électronégativité crée un dipôle électrique. 5  - Cette polarité conditionne les interactions avec les autres types de molécules : c’est le caractère hydrophile (affinité de l’eau pour les molécules polaires et les ions) ou hydrophobe (repousse les molécules apolaires). b- Loi d’osmose Le transport de l’eau est passif et obéit à la loi d’osmose. C’est le passage d’un solvant à travers une membrane hémiperméable (ex : membrane plasmique). Ce flux s’effectue d’une solution hypotonique (moins concentrée : diluée) vers une solution hypertonique (plus concentrée) jusqu’à l’équilibre osmotique ou isotonie. 2- Les sels minéraux Chimiquement, ce sont des éléments ionisés chargés soit positivement (cations) ou négativement (anions). Ils divisés en 2 groupes: - les éléments principaux ou macroéléments: Ca, P, K, Cl, Na, Mg - les éléments traces ou oligoéléments: Fe, Zn, Cu, Mn, I, Mo, etc. Outre le fait qu’ils font partie des os et des dents, ils interviennent dans divers mécanismes : contrôle de l'équilibre hydrique (pression osmotique), de l'équilibre acide-base (pH), en tant que catalyseurs de nombreuses réactions métaboliques, entrent dans la composition des enzymes, des hormones, … 6  Une carence en sels minéraux chez les plantes peut entrainer des symptômes tels un ralentissement dans la croissance, des chloroses voir même des nécroses. Exemple : Importance dans la Carence plante Azote Dans les acides aminés et Jaunissement, chute des protéines feuilles Phosphore P Dans les acides Faible croissance, nucléiques et molécules floraison retardée énergétiques Potassium K Régulation osmotique et Faible résistance au froid ouverture des stomates et à la sécheresse Calcium Ca Cohésion de la paroi Dommages sur les pectocellulosique méristèmes Magnésium Mg Constituant de la Dépérissement des chlorophylle feuilles Manganèse Mn Constituant de Dessèchement des nombreuses enzymes feuilles Certaines de ces carences peuvent être corrigées par un apport d’engrais. II- Les molécules organiques Ce sont des molécules constituées d’un squelette carboné sur lequel se greffent d’autres atomes comme l’hydrogène, l’oxygène, l’azote et le phosphore … Elles sont classées en 4 grands groupes : protéines, glucides, lipides et acides nucléiques. 1- Les protéines Ce sont des polymères d’acides aminés (les monomères) liés par une liaison peptidique, covalente CO-NH. La structure de base des acides aminés est toujours la même : - Un carbone central sur lequel se greffe un atome d’H, deux groupements: amine et carboxyle - Une chaîne latérale qui varie selon les 20 acides aminés. La succession des acides aminés varie d’une protéine à l’autre. On parle de séquence primaire. Différentes interactions au sein des chaînes peptidiques donnent une structure secondaire, tertiaire puis quaternaire aboutissant à une structure tridimensionnelle aboutissant à une protéine fonctionnelle. 7  Organisation structurale des protéines Structure Structure tertiaire Structure quaternaire Structure secondaire Deuxième Interaction de diverses chaînes Premier repliement par des déjà en structure tertiaire primaire repliement liaisons diverses à par des intervalle irrégulier. des aa liaisons H à La molécule prend intervalle la forme d’une régulier boule.(conformation native) La fabrication des protéines se fait par condensation d’acides aminés. Les polymères se coupent souvent par des réactions d’hydrolyse (hydratation) : Réaction chimique par laquelle une molécule est coupée par l’addition d’une molécule d’eau. C’est un processus qui libère de l’énergie. Il existe deux grands groupes de protéines : - Protéines de structure: dans les membranes, le cytosquelette … - Protéines enzymatiques, nécessaires à divers processus métaboliques, ex : protéases, hydrolases, … Les protéines peuvent se dénaturer (perdre leur conformation native) sous l’effet de la chaleur, d’un pH inadéquat ou d’une mauvaise concentration en sels (protéines non fonctionnelles) et elles peuvent reprendre leur forme si le milieu redevient normal. - La séquence des acides aminés d’une protéine est dictée par un « gène » de l’ADN. Si une mutation génétique survient, la protéine sera modifiée : mutée. 8 Il existe des regroupements d'atomes particuliers «accroché» aux squelettes carbonés des molécules. Ce sont les groupements fonctionnels qui donnent aux molécules une plus grande réactivité. Groupement amine Groupement Groupement phosphate hydroxyle Chaîne carbonée Groupement carbonyle Groupement carboxyle 2- Les glucides Ce sont des molécules, appelées aussi sucres, composées de C, H, O selon la formule brute (CH2O)n. Ce sont des molécules hydrophiles. Selon l’arrangement des atomes, on distingue plusieurs isomères qui n’ont pas les mêmes propriétés. Glucose : C6H12O6 Galactose (lait) Fructose (fruits) (pain, du riz, …) En fonction du nombre de monosaccharides, on distingue les disaccharides : association de 2 monosaccharides (maltose) et les polysaccharides : association de plusieurs monosaccharides pour former des polymères (amidon, glycogène, cellulose). Amidon : polymère du glucose  Rôle des glucides : Essentiellement, rôle de réserve (graines), énergie pour la cellule, composants de la paroi pectocellulosique, des acides nucléiques et des membranes et également rôle dans la jonction dans le mécanisme de reconnaissance cellulaire. 9  3- Les lipides - Ce sont des macromolécules formées d’une molécule de glycérol (alcool) et de 3 molécules d’acides gras. - Formule générale : CH3-(CH2)n-COOH - Hydrophobes ou amphiphiles, ils sont solubles dans l’éther. -Les lipides de réserve sont constitués d’acides gras (qui peuvent être saturés ou insaturés) et de leurs associations en triglycérides et en phospholipides. Les acides gras sont de longues chaînes carbonées à nombre pair de carbones et portant une fonction acide au niveau du carbone1. Les AG saturés ne comportent que des liaisons simples alors que les AG insaturés présentent des doubles et des triples liaisons. Les lipides membranaires sont constitués par un assemblage de 2 acides gras, de glycérol et de phosphate. Ils ont une manière particulière de s’organiser en présence d’eau : pôle hydrophobe et pôle hydrophile (voir chapitre « membrane plasmique ») → caractère hydrophobe des membranes.  Rôles des lipides : Réserves d’énergie (graines oléagineuses chez les végétaux et tissus adipeux chez les animaux), constituant des membranes, source d’énergie pour la cellule. 10  3- Les acides nucléiques Les acides nucléiques ont été isolés initialement des noyaux des cellules. On peut en distinguer deux grands types : - les acides désoxyribonucléiques (ADN) : localisés dans le noyau des cellules et constituent le support de l’information génétique - les acides ribonucléiques (ARN) : participent à l’expression de l’information génétique. Les acides nucléiques (ADN et ARN) sont des macromolécules et comportent des sous unités appelées nucléotides. 3.1. ADN : Acide DésoxyriboNucléique C’est une chaîne de plusieurs nucléotides, eux-mêmes composés de : Bases azotées dérivées de 2 noyaux hétérocyclés azotés : - Noyau Purine : Adénine (A), Guanine (G) : Bases Puriques - Noyau Pyrimidine : Cytosine (C), Uracile (U), Thymine (T) : Bases Pyrimidiques La Thymine (T) se trouve uniquement chez l’ADN et l’Uracile (U) uniquement chez l’ARN. Pentose : est soit le Ribose (dans l’ARN) ou le Désoxyribose (dans l’ADN) L’acide phosphorique (H3PO4) 11  La liaison Pentose–base est une liaison N-osidique. Cette association est appelée nucléoside. Chaque nucléotide d’ADN est composé de : - Thymidine = Thymine + Désoxyribose - Uridine = Uracile + Ribose - Guanosine = Guanine + Ribose/ Désoxyribose - Adénosine = Adénine + Ribose/ Désoxyribose - Cytidine = Cytosine + Ribose/ Désoxyribose La liaison acide phosphorique-pentose est une liaison phosphoester. L’ADN est une macromolécule de longue chaîne polynucléotidique orientée dans le sens de l’extrémité 5’ (comportant un groupement phosphate) vers l’extrémité 3’ qui possède un OH C’est la structure primaire. Elle a une structure secondaire importante : elle est formée d’une double chaîne nucléotidique: 2 brins anti-parallèles, disposés dans des directions opposées (5’à3’ et 3’à5’), hélicoïdaux (double hélice à rotation droite) et complémentaires (2 liaisons hydrogène entre A et T et 3 liaisons hydrogène entre C et G). L’ADN est le support qui sert de base à la biosynthèse des protéines. 3.2. ARN : AcideRiboNucléique Chaque nucléotide d’ARN est composé de : Les ARN sont des macromolécules composées d’une seule chaîne nucléotidique = Monocaténaires. Mais dans une même chaîne d’ARN des portions peuvent être sous forme bicaténaire avec une complémentarité suivant la règle : - 2 liaisons hydrogène entre A et U - et 3 liaisons hydrogène entre C et G Il existe 3 types d’ARN qui jouent un rôle essentiel dans la transcription (ARNm) et la traduction (ARNt et ARNr) de l'information génétique qui aboutit à la biosynthèse des protéines. 12 Chapitre II, TD1 et 2 Méthodes d’étude de la cellule : microscopes, fractionnement, cultures cellulaires I – Microscopes 1.1. Microscope optique ou photonique Il permet d’observer sur une coupe très fine les détails infiniment petits d’un objet ou échantillon. Il faut que l’objet soit mince pour que la lumière (photons) puisse le traverser.  Étapes de l’observation: - Préparation de l’échantillon - Mise au point - Changement de grossissement - Observation 1.2. Microscope électronique Le microscope électronique utilise le même principe de lentilles et de faisceaux qu'un microscope optique. Ce qui varie, c'est que le microscope électronique est doté de lentilles électromagnétiques et d'un faisceau d'électrons, alors qu'un microscope optique utilise un faisceau de lumière et des lentilles en verre. La résolution des microscopes électroniques est beaucoup plus grande (le grossissement atteint 2 millions de fois, contre 2.000 fois avec un microscope optique). 13  Virus Ebola a) Microscope électronique à transmission Le microscope électronique en transmission (MET ou TEM en anglais) utilise un faisceau d'électron à haute tension, émis par un canon à électrons. Des lentilles électromagnétiques sont utilisées pour focaliser le faisceau d'électrons sur l'échantillon. En traversant l'échantillon et les atomes qui le constituent, le faisceau d'électrons produit différentes sortes de rayonnements. En général, seuls les électrons transmis sont alors analysés par le détecteur, qui traduit le signal en image contrastée. Les échantillons doivent être préparés selon un protocole précis, qui doit à la fois conserver sa structure et être conducteur pour laisser passer le faisceau d'électrons. Des coupes très fines de l'échantillon sont réalisées à l'ultramicrotome (de 60 à 100 nanomètres). Des colorations aux métaux lourds sont également possibles pour augmenter les contrastes de structures particulières des échantillons, préalablement placées sur des grilles d'observation. 14  b) Microscope électronique à balayage Grains de pollen (Gr : 500x) Le microscope électronique à balayage (MEB ou SEM en anglais pour scanning electronmicroscopy) utilise un fin faisceau d'électrons, émis par un canon à électrons. Des lentilles électromagnétiques permettent de focaliser le faisceau d'électrons sur l'échantillon. L'interaction entre les électrons et l'échantillon provoque la formation d'électrons secondaires de plus faible énergie. Ils sont amplifiés puis détectés et convertis en un signal électrique. Ce processus est réalisé en chaque point de l'échantillon par un balayage du microscope. L'ensemble des signaux permet de reconstruire la typographie de l'échantillon et de fournir une image en relief. La préparation des échantillons est contraignante. Ils doivent être déshydratés puis subir un traitement pour devenir conducteur (fixation des tissus, nettoyage). L'échantillon est ensuite placé sur le porte-objet. c) Microscope à épifluoresecence Les cellules endothéliales de l'artère pulmonaire de la vache. Les noyaux cellulaires sont de couleur bleue; les microtubules sont de couleur verte; les filaments d'actine sont de couleur rouge. 15 La fluorescence est la propriété que certains corps ou molécules ont à émettre une lumière après avoir été excités avec une lumière d'énergie supérieure. Ainsi, un objet excité par une longueur d'onde émettra une fluorescence à une longueur d'onde supérieure. La technique du microscope en fluorescence est donc la même qu'un microscope optique, sauf que la lumière utilisée n'est pas blanche, mais possède une gamme définie de longueur d'onde. La lumière arrive sur l'échantillon par le haut (épi-fluorescence) et non par-dessous. À l'émission, on peut alors utiliser des lasers possédant une longueur d'onde unique ou des filtres d'excitation ne laissant passer que la lumière de longueur d'onde désirée sur l'échantillon. Après excitation de l'échantillon, celui-ci émet à son tour une lumière d'une longueur d'onde différente. On peut utiliser des filtres permettant de n'observer que la longueur d'onde désirée. Comparaison entre microscope électronique et microscope photonique MET MO Source d’énergie Électrons Photons Couleur Noir et blanc Couleurs:lugol,RN Etat des cellules Mortes: fixées Mortes ou vivantes Grossissement 2000 à 1million x 25 à 1000 x Pouvoir séparateur 4Ǻ 0.2 µm Lentilles Magnétiques En verre Image reçue Sur écran fluorescent Par l’oeil Préparations coupées A l’ultra microtome Au microtome II- Méthodes d’étude chimique Ce sont des méthodes de séparation de molécules (chromatographie et électrophorèse) ou d’organites (fractionnement cellulaire). a) Chromatographie La chromatographie est une technique de séparation des substances chimiques (mélange homogène liquide ou gazeux) qui repose sur des différences de comportement entre une phase mobile courante et une phase stationnaire (ou phase fixe). 16  On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature des phases utilisées ou celle des phénomènes mis en œuvre dans la séparation. La phase mobile en chromatographie peut être :  soit un gaz (chromatographie en phase gazeuse), la phase mobile est alors appelée gaz vecteur ou gaz porteur ;  soit un liquide (chromatographie sur papier, couche mince ou colonne), la phase mobile est alors appelée éluant. La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils peuvent être employés comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM). b) Electrophorèse L'électrophorèse est une technique biochimique de séparation fondée sur le fait que des molécules portant des charges électriques différentes migrent à des vitesses différentes lorsqu'elles sont placées dans un champ électrique. Si l’idée d’utiliser cette caractéristique pour séparer des molécules remonte à la fin du dix- neuvième siècle, c'est le biochimiste suédois Arne Tiselius (1902-1971), prix Nobel de chimie en 1948, qui réussit le premier à séparer par cette technique les protéines contenues dans des liquides biologiques complexes comme le sérum sanguin et le lait. L’électrophorèse des protéines peut être réalisée sur des supports variés, notamment sur gel de polyacrylamide ou sur gel d’agarose selon les informations recherchées. La séparation de l'ADN est souvent utilisée en biologie moléculaire pour identifier des fragments particuliers. Pour séparer des séquences, les chercheurs réalisent habituellement une électrophorèse avec un gel d'agarose : soumis à un champ électrique, les fragments d'ADN les plus petits migrent le plus vite, d'où leur séparation en fonction de leur taille. Cependant, cette technique est longue et, peu sensible, elle nécessite des quantités suffisantes d'ADN. La résolution pour de grosses molécules d'ADN (par exemple 40 à 50 kb) est limitée. 17  c) Fractionnement cellulaire Afin d'analyser leur structure ou leur composition, il faut d’abord séparer les différentes structures présentes dans la cellule. Pour cela, on broie une culture de cellules. La séparation des constituants peut alors se faire par centrifugation.  Centrifugation différentielle On centrifuge en fonction de la taille et de la densité de ses constituants et donc à différentes vitesses : à chaque vitesse, différents organites se déposent dans le culot, qui sera prélevé.  Centrifugation par gradient préformé Cette technique consiste à déposer une mince couche d’homogénat au-dessus de la solution de saccharose dont la concentration varie de façon régulière et décroissante du bas vers le haut. Les différents constituants de l’homogénat sédimentent tous à des vitesses différentes, on obtient ainsi différentes bandes (la couche la plus dense étant au fond) qui seront alors séparées. 18  III- Méthodes d’étude physiques a) Autoradiographe : Cette technique permet de suivre et de localiser des substances au sein d'un organisme. Elle repose sur l'utilisation de produits radioactifs qui possèdent 2 propriétés essentielles: - ils sont utilisés par les êtres vivants exactement comme leurs isotopes non radioactifs. - Ils émettent un rayonnement qui peut être repéré par l'utilisation d'une émulsion photographique. On fournit à l'organisme un composé radioactif (contenant le plus souvent du 14C ou du 3H = tritium) soit par injection directe ou par incubation de cellules : c’est le « pulse ». On réalise des coupes dans les tissus à étudier, ou on prélève les cellules en culture. On fixe le matériel et les composants radioactifs non incorporés sont éliminés par lavage. On recouvre le matériel d'une émulsion photographique (mélange de gélatine et de cristaux de bromure d'Ag). On maintient le tout plusieurs jours ou plusieurs semaines à l'obscurité. Pendant ce laps de temps, les rayonnements émis par les éléments radioactifs vont transformer l'AgBr en Ag métallique. C’est le « chase ». On développe le film pour faire apparaître en noir les zones impressionnées (présence des grains d'argent opaques). L'observation simultanée du matériel permet de localiser les molécules ayant incorporé l'élément radioactif (molécules marquées). a. Autoradiographie après 15 min de culture sur milieu contenant de l’uracile radioactif. b. Autoradiographie après culture sur milieu radioactif pendant 15 minutes puis transfert sur un milieu de culture non radioactif pendant une heure et demi. L'ARN est formé dans le noyau (a) mais, contrairement à l'ADN, on le retrouve peu après dans le cytoplasme (b). On peut donc observer que l’ARN radioactif se déplace. b) Fluorescence : L’imagerie en fluorescence utilise un éclairage à haute intensité pour exciter les molécules fluorescentes dans l’échantillon qui absorbent l’énergie lumineuse (lumière d’excitation) et la restituent sous forme de lumière fluorescente (lumière d’émission). 19 Chapitre III LA MEMBRANE PLASMIQUE 1. Définition C’est la membrane qui limite la partie vivante de la cellule et la sépare du milieu extérieur. De faible épaisseur: 75 Å, son ultrastructure est observée au microscope électronique. Toutes les membranes des organites cellulaires et du système endomembranaire ont une structure similaire à celle de la membrane plasmique. On parle d’unité membranaire. 2. Isolement des membranes plasmiques Exemple des hématies ou globules rouges : le fractionnement se fait par fractionnement cellulaire ou hémolyse. Un simple choc osmotique dans une solution hypotonique permet de faire éclater ces cellules et éliminer le cytoplasme (hémoglobine). Une centrifugation permet de récupérer la fraction « membrane plasmique». Remarque importante : Les hématies sont des cellules anucléées. Elles sont faciles à obtenir (sans tuer l’animal), très nombreuses, isolées et dépourvues d’organites. 3. Composition chimique de la membrane 60% de protéines et glycoprotéines 40% de lipides (surtout des phospholipides) 20  4.Structure de la membrane plasmique 4.1. Observation au microscope électronique à transmission Gr >150 000x: structure en 3 feuillets: A faible Gr (3000-100 000x): structure simple, dense et noire 2 feuillets denses protéiques (20Å) entourant un feuillet clair lipidique (35Å) 4.2. Les lipides membranaires Au sein de la membrane ; les lipides sont présents sous différentes formes :  Phospholipides : présentent tous une tête hydrophile (phosphate et groupement spécialisé) et une queue hydrophobe (glycérol et acides gras). On distingue 2 types de phospholipides : - les glycérophospholipides : association de glycérol, 2 acides gras, 1 acide phosphorique et alcools ou acides aminés. - les sphingophospholipides : association de sphingosine, acides gras, acide phosphorique et alcools ou acides aminés.  Glycolipides : 2 types : glycéroglycolipides et sphingoglycolipides Ce sont les glycolipides des membranes des érythocytes qui définissent les groupes sanguins.  Cholestérol : uniquement présent dans les membranes des cellules animales, il est composé d’un noyau stéroïde hydrophobe, d’une queue hydrophobe et d’une fonction alcool hydrophile. C’est donc une molécule amphiphile qui représente environ le quart des lipides membranaires et influence la fluidité membranaire. 21  4.3. Les protéines membranaires Les protéines membranaires ont des rôles spécifiques au sein de la bicouche phospholipidique : récepteurs, transporteurs, adhérence cellulaire, catalyse enzymatique, messagers intracellulaires, … Chaque protéine possède une extrémité N-terminale et une extrémité C-terminale. Elles sont ancrées de différentes manières dans la membrane.  Observation au microscope électronique à balayage  Les protéines extrinsèques : localisées en dehors de la bicouche phospholipidique, elles sont soit entièrement intracellulaires soit entièrement extracellulaires. Elles interagissent avec la membrane par des liaisons hydrogènes qui peuvent être facilement rompues par des variations de forces ioniques et de pH.  Les protéines transmembranaires traversent les 2 feuillets de la membrane. Elles sont liées de manière stable avec l’environnement hydrophobe de la face interne de la membrane par les acides aminés apolaires. Elles ne peuvent ainsi être séparées de la double couche phospholipidique que par des détergents. 4.4. Revêtement fibreux glucidique La grande majorité des glucides membranaires sont sous forme de glycoprotéines et une petite partie de glycolipides. Ils n’existent pas à l’état libre : ils sont liés aux protéines par des liaisons N-glycosidiques et des liaisons O-glycosidiques sous forme de petites glycoprotéines. 22  4.5. Modèle moléculaire de la membrane plasmique: Mosaïque fluide (Singer et Nicholson, 1972) 4.6. Asymétrie et mobilité  Lipides : les membranes sont constituées de feuillets dont les compositions lipidiques sont différentes, sauf le cholestérol qui se trouve en quantité équivalente dans l’un ou l’autre des feuillets, pouvant basculer facilement de l’un à l’autre. L’asymétrie des lipides entraîne ainsi une asymétrie de la charge globale de chaque feuillet. La mobilité des lipides est nécessaire pour l’activité cellulaire. Ils peuvent se mouvoir de différentes manières au sein de la membrane : rotation, diffusion latéral et flip flop (passage d’un feuillet à l’autre). Le cholestérol renforce la solidité et rigidité membranaire et correspond jusqu’à 50% des lipides totaux de la membrane.  Glucides : La plus grande asymétrie est celle présente au niveau des glucides : tous les motifs glucidiques sont localisés sur le feuillet externe de la membrane plasmique. Pour les organites intracellulaires les sucres sont dirigés vers la lumière de l’organite formant l’arbre glucidique (glycocalix). Plus les chaînes carbonées des acides-gras sont courtes et insaturées plus la membrane est fluide.  Protéines : Les protéines diminuent la fluidité membranaire. 5. Perméabilité membranaire Passage de l’eau et des molécules dissoutes à travers la membrane. 5.1. Transport de l’eau (solvant biologique) La petite taille de la molécule d’eau et son manque de charge lui permettent de traverser la bicouche lipidique ou d’emprunter des pores hydrophiles. Son transport est assuré par les aquaporines. Les échanges d’eau suivent la loi d’osmose, d’un milieu hypotonique (le - concentré) vers un milieu hypertonique (le +concentré) à travers la membrane plasmique. 23  5.2. Perméabilité aux molécules dissoutes : Influencée par 3 facteurs : - liposolubilité: facteur positif à cause de la nature hydrophobe (lipophile) de la bicouche lipidique membranaire. - taille: les petites molécules traversent plus vite que les grandes (à liposolubilité égale). La membrane est imperméable aux macromolécules (trop grandes). Ex: protéines, polysaccharides et acides nucléiques. Ces molécules peuvent quand même entrer ou sortir de la cellule par endocytose ou exocytose. - Charge électrique: les ions (Mg++, K+, Cl-) sont hydrophiles et très hydratés ce qui les empêche de traverser la bicouche lipidique. Cependant, il existe dans la cellule des mécanismes de transport spécifiques pour faire entrer et sortir certaines molécules hydrophiles. 5.3- Mécanismes de transport A travers la membrane plasmique, s’effectuent des échanges entre les deux milieux intra et extra cellulaire. Ces échanges sont possibles grâce aux propriétés structurales (présence de transporteurs) de la membrane et des propriétés physicochimiques (liposolubilité) des substances qui la traversent. - Transport passif: dans le sens du gradient de diffusion (solution hypotonique vers solution hypertonique), sans apport d’énergie. - Transport facilité : des transporteurs protéiques spécifiques permettent le passage de molécules non liposolubles de grande taille telles que le glucose dans le sens du gradient de concentration. C'est donc un transport passif, car il ne nécessite pas d'énergie. - Transport actif : Les pompes membranaires transfèrent spécifiquement un soluté dans le sens inverse du gradient de concentration. Ce transport nécessite donc de l'énergie (fournie par l'hydrolyse de l'ATP). 24 Ex: pompe Na+/K+ dans la cellule épithéliale de l’intestin Du côté où les cellules sont en contact avec les aliments, leur surface présente environ 3000 microvillosités qui constituent une bordure en brosse (plateau strié) qui ne sont visibles qu’au microscope électronique. A leur niveau se fait l’absorption des aliments contenus dans le tube digestif. Si on calcule la surface de la membrane plasmique hérissée, on constate qu’elle est 10 000 fois supérieure à ce qu’elle serait si la membrane était plane. La membrane plasmique est imperméable aux molécules polaires comme le glucose d’où nécessité d’un captage cellulaire via des transporteurs. L’absorption du glucose se fait conjointement avec celle du Na+. La concentration en K+ est 30 à 40 fois plus élevée à l’intérieur des cellules qu’à l’extérieur et l’inverse pour le NA+. La pompe Na/K, protéine (enzyme) membranaire expulse 3 ions Na+ vers l’extérieur et importe 2 ions K+ vers l’intérieur, contre leur gradient électrochimique. Ce transport est couplé à l’hydrolyse de l’ATP : transport actif primaire. Le gradient Na/K généré à travers la membrane est impliqué dans différentes fonctions : régulation du pH et du volume cellulaire, transport de glucose (transport actif secondaire) et d’acides aminés et transport du signal dans le système nerveux 25  5.4- Fonctionnement d’un transporteur Les transporteurs fonctionnent donc selon trois systèmes:  Système uniport : transport d’1 molécule à travers la membrane à l’aide d’un transporteur  Système symport : transport simultané de 2 molécules dans le même sens Ex : glucose et Na+  Système antiport : transport simultané de 2 molécules dans des sens opposés Ex : Na+/K+ La diffusion par un transporteur augmente très largement la vitesse et la sélectivité de transport par rapport à la diffusion simple. Ex :Le transporteur de glucose : la perméase GLUT1 26  5.5. Perméabilité aux macromolécules 5.5.1. Endocytose a- Phagocytose : Ingestion de grosses molécules, d’organites et de cellules. Elle est réalisée essentiellement par des cellules spécialisées comme les macrophages et de façon moins importante, chez les fibroblastes, les cellules épithéliales et les cellules endothéliales. La phagocytose intervient essentiellement dans le système de défense de l'organisme et entraîne la destruction de l'élément absorbé. Son déclenchement se fait par reconnaissance entre des récepteurs dans la membrane et la particule à ingérer. Ex: phagocytose d’une bactérie - Les anticorps se lient à la surface des bactéries infectieuses en laissant une région Fc exposée à l’extérieur. Ces régions Fc seront reconnues et liées aux récepteurs Fc dans la membrane des macrophages et neutrophiles. - Cette liaison déclenche la formation de pseudopodes qui enveloppent la particule et fusionnent à leur extrémité pour former un phagosome. b- Pinocytose : Existe chez toutes les cellules et semble impliquer des zones particulières des membranes cellulaires avec reconnaissance de certains composés. C'est la voie normale d'absorption d'éléments indispensables comme le cholestérol transporté par les lipoprotéines de faible densité (LDL) ou le fer transporté par les transferrines. Les voies de pinocytose sont classées en fonction des protéines et des médiateurs impliqués : o pinocytose indépendante de la clathrine : cette catégorie rassemble plusieurs voies en fonction de l’enzyme qui intervient ( caveoline, tyrosine kinase, pinocytose Arf6 dépendant, pinocytose flotilline dépendant, …) o pinocytose dépendant de la clathrine Le macrophage ingère 3% de sa membrane plasmique chaque minute soit 100% en 30 min. 27 Les « puits recouverts de clathrine » sont recouverts à la surface cytoplasmique par une matière dense constituée d’un réseau protéique : les clathrines qui forment un panier autour de la vésicule d’endocytose qui se détache de la membrane. Très vite, cette enveloppe est perdue par les vésicules permettant leur fusion. 5.4.2. Exocytose : La matière est expulsée de la cellule. Ce sont normalement les déchets mais également certaines protéines : hormones, enzymes, … La surface et le volume cellulaire restent constants donc la même quantité de membrane est restituée par exocytose. On peut parler d’un cycle endocytose – exocytose. 28 6 - Signalisation C’est le système de communication entre les cellules. Il est à la base de leurs processus métaboliques, leur développement, leur organisation et leur activité. Les molécules impliquées dans ces échanges peuvent être des hormones, des neurotransmetteurs, des facteurs de croissance...). Ce sont des molécules informatives : elles assurent le transport de l'information entre les cellules et à l’intérieur d’une même cellule. Il s’agit de communication intercellulaire, souvent à distance se faisant entre deux types de cellules:  La cellule de transmission qui synthétise le signal (molécule informative) etlefaitsortir, souvent par exocytose, dans le milieu extracellulaire.  La cellule cible capte le signal grâce à des récepteurs sur sa membrane plasmique. Un récepteur est une protéine spécifique composée de deux parties: un récepteur externe et une partie catalytique interne qui provoque une réponse cellulaire: c’est la transduction c’est-à-dire la réception d’un signal externe et formation d’un deuxième signal intracellulaire pour y répondre. Ex 1 : l’insuline est synthétisée dans le pancréas et agit au niveau du foie. Ex 2 : Visualisation d'une partie du réseau dans lequel des protéines de la levure sont impliquées dans des mécanismes de signalisation (logiciel "Cytoscape").  TD3 : Répondre aux questions de la série (3). 29 TD 4 : Cultures cellulaires et marquage radioactif On appelle culture cellulaire, le maintien en dehors de l'organisme, des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser in-vitro et d'exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques. 1- Intérêts de la culture cellulaire - Etudes de toxicologie: en raison des problèmes d'expérimentation animale, qui ne peut malgré tout être supprimée car les effets sur l'animal entier ne sont pas les mêmes que sur des cellules isolées - Etudes chromosomiques (caryotype fœtal) - Suivre le déroulement de la mitose, dans les conditions normales ou après application de substances antimitotiques. - Production de peau neuve par culture pour autogreffe ultérieure (pour les grands brûlés) - Culture de virus (production de vaccin ou diagnostic). - Observation des cellules cancéreuses et leur comportement. 1.1. Techniques d'obtention des cellules On distingue 2 types de cellules:  Les cellules libres et circulantes comme les cellules du sang  Les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu. Les techniques d'obtention de ces 2 classes de cellules sont différentes.  Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et centrifugation.  Les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en oeuvre de techniques plus originales qui peuvent être divisées en 2 groupes: la méthode par dissection et la méthode par digestion enzymatique. - La méthode de dissection consiste à couper en fragment d'environ 1 à 4 mm3 le tissu que l'on réduit encore à l'aide de pince. Ces fragments sont ensuite placés dans un flacon de culture contenant un milieu nutritif. Les cellules vont migrer à partir des différents fragments puis se multiplier. Cette méthode s'appelle également la méthode des explants. La méthode par dissection est souvent utilisée quand le tissu à mettre en culture est très petit. - La méthode par digestion enzymatique: Les enzymes utilisées sont des enzymes protéolytiques qui digèrent la trame protéique qui entoure les cellules. On utilise souvent la trypsine à une concentration de 0,5 à 2,5 g/l dans une solution saline. La méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode. 30  1.2. Méthodes de culture 1.2.1. Culture stationnaire ou monocouche Le principe général de cette méthode est lié à l'affinité des cellules au support qui peut être du verre ou du plastique traité pour la culture. Le plastique peut être recouvert d’un support physiologique: collagène, fibronectine ou d'une membrane basale reconstituée ou encore l'utilisation de gel d'agarose, de gel de collagène pour une orientation vers la culture 3D. Les cellules sont placées dans des boites micropuits de diamètres différents ou sur des microporteurs (microbilles en plastique) recouverts ou non de support physiologique. Les microporteurs sont ensuite placés dans des récipients puis soumis à une agitation modérée et continue permettant aux cellules de demeurer dans le milieu de culture. 1.2.2. Culture en suspension Les cellules sont cultivées dans un bouillon contenant tous les éléments nécessaires à la croissance cellulaire, sous agitation.  Contrôles fonctionnels des cellules en culture On vérifie les conditions d'asepsie lors de la dissection et augmente la dose d'antibiotique et fongique si nécessaire. On vérifie l'état des cellules recueillies par le bleu de trypan qui est un colorant qui pénètre dans les cellules et entraîne un mécanisme d’exclusion qui va éjecter certaines molécules vers le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et restera bleue.  Conservation des cellules La conservation des cellules est indispensable pour les cellules à durée de vie limitée et pour les cellules difficiles à entretenir. Elle se fait par cryoconservation. La conservation de longue durée se réalise dans de l'azote liquide à -180°C. Les cellules sont placées en présence de DMEM (Dulbecco’sModifiedEagle’s Medium), de FCS à 10% et de DMSO (diméthyle sulfoxide)à 10% ou de glycérol (Le DMSO et le glycérol sont des agents cryoprotecteurs) dans des tubes de congélation de 1ml. La concentration des cellules doit être de 10 milliards de cellules par ml. La conservation de court durée se réalise à -20°C. La décongélation des cellules se fait de manière rapide, en plaçant celles-ci sous une ampoule dégageant une température de 37°C.  Evolution des cellules en culture Les cellules in-vitro présentent 2 propriétés fondamentales qui sont: la capacité proliférative et leur fonction différentiée. Les cellules conservent la plupart du temps leur potentiel de division, pouvant être stimulé au 31 début de la culture par des facteurs de croissance. Même si au cours du temps, on peut noter un ralentissement de celui-ci. - Cellules normales: Se multiplient rapidement. En quelques jours, lorsque tout le milieu est recouvert, les mitoses s'arrêtent, les cellules meurent. Ce mécanisme d'arrêt est l'inhibition de contact qui dépend de la transmission de signaux entre les cellules. D’où la nécessité de repiquages pour conserver des cellules longtemps mais elles ne sont pas immortelles. On peut réaliser des cultures à partir d'une seule cellule. Toutes les cellules issues de cette multiplication constituent un clone: elles possèdent toutes le même patrimoine génétique. - Cellules cancéreuses: Les cellules cancéreuses ont perdu l'inhibition de contact et donc le signal d’arrêt des divisions : elles sont devenues immortelles. Leur mort est conditionnée uniquement par l'appauvrissement du milieu de culture. Des repiquages successifs les maintiennent en vie. 2. Marquage des molécules et immunocytochimie 2.1- Marquage : C’est la fixation sur une molécule, d'un signe de reconnaissance facilement identifiable qui permet le suivi d'un composé dans un organisme, un organe, un tissu ou dans la cellule. 2 types de marqueurs: isotopes radioactifs (autohistoradiographie) et composés fluorescents. a- Marquage par des isotopes radioactifs : auto historadiographie Ex: marquage de la cystéine par du soufre 35 permet de connaître le chemin qu'elle parcourt dans le cartilage. La cystéine marquée est injectée à plusieurs rats qui sont sacrifiés à des intervalles réguliers. b- Marquage par des substances fluorescentes  Analogue fluorescent: molécule à étudier couplée avec un colorant fluorescent.  Cet analogue est introduit dans la cellule par micro-injection avec une micropipette de verre d’1micron de diamètre. EX : noyaux vus au ME à fluorescence 32  2.2- Immunocytochimie : C’est une technique qui repose sur l'antigénicité des protéines. Elle permet de révéler spécifiquement des molécules qui ne pourraient l'être avec les plus puissants microscopes électroniques. On peut produire des anticorps contre n'importe quel constituant cellulaire. a- Préparation des anticorps  Par injection d’un antigène purifié (protéine) à un animal d’une autre espèce que celle dont on a extrait l'antigène injecté.  L’animal traité développe une réaction immunologique: des macrophages phagocytent la protéine, la fragmentent en peptides et les exposent à leur surface grâce au CMH Il (complexe majeur d'histocompatibilité de type Il).  Chacun de ces peptides déclenchent la multiplication de lymphocytes T différents. Les lymphocytes T activent ensuite les lymphocytes B qui se transforment en cellules productrices d'anticorps, les plasmocytes.  L’anticorps ainsi obtenu se fixe sur la protéine qui est à l'origine de sa fabrication. Anticorps = Glycoprotéine de la famille des immunoglobulines b- Marquage de l'anticorps Pour visualiser le complexe antigène-anticorps, on associe à l'anticorps un système marqueur (ou révélateur) composé d'une molécule détectable en microscopie:  une substance fluorescente (ex: l'isothiocyanate de fluorescéine) : technique d'immunofluorescence utilisable uniquement au MO.  une enzyme (peroxydase du raifort, phosphatase alcaline). La visualisation du marqueur se fait par la production de précipité coloré par l'enzyme: technique immunoenzymologique utilisable au MO et ME.  marqueurs métalliques (ferritine, or colloïdal) utilisés en ME car spontanément opaques aux électrons. 33  c- Technique de détection - Immunocytochimie directe: Les anticorps repérables par leur marqueur se fixent sur leur antigène. Le complexe antigène anticorps marqueur est alors détectable en microscopie. - Immunocytochimie indirecte: Augmente la sensibilité de la réaction, en combinant deux types d'anticorps: les anticorps anti-protéine (anticorps primaires) et des anticorps « anti-anticorps primaires » (=anticorps secondaires) porteurs de marqueurs. d- Exemple d’application : la mobilité des protéines Les glycoprotéines de la face externe de la membrane plasmique sont spécifiques d'un type cellulaire donné. Lorsqu'une cellule est introduite dans un organisme étranger, elle déclenche la production d'anticorps qui se fixent sur les antigènes leur correspondant et les neutralisent. Les anticorps spécifiques peuvent être préparés au labo, puis ils sont marqués avec un composé fluorescent. Ces anticorps rendus fluorescents sont utilisés comme marqueurs spécifiques des glycoprotéines.  Mise en évidence de la diffusion des protéines dans le plan membranaire Cette diffusion des glycoprotéines a été mise en évidence lors de la fusion de cellules d'espèces différentes. Ex: cellules de souris et cellules humaines 34  On injecte à un lapin des cellules de souris maintenues en culture in vitro. Le lapin réagit en produisant des anticorps « anti-cellule de souris ». Ces anticorps sont marqués à la fluorescéine (fluorescence verte au microscope à UV).  On injecte à un autre lapin des cellules d'homme en culture. Le lapin réagit en produisant des anticorps « anti-cellule d'homme », ces anticorps seront marqués à la rhodamine (fluorescence rouge au microscope à UV).  Fusion des deux types de cellules On provoque la fusion entre les cellules de souris et les cellules humaines. Il se forme des hétérocaryons contenant chacun un noyau de souris et un noyau humain. à t=0mn: on ajoute à l'hétérocaryon un mélange d'anticorps marqués par la rhodamine et la fluorescéine, pour identifier la position des glycoprotéines (antigènes) de l'homme et de la souris dans la membrane de l'hétérocaryon. Résultats: À t=5mn, on observe au microscope à UV, une fluorescence rouge d'une hémisphère de l'hétérocaryon et une fluorescence verte de l'autre hémisphère. Donc les anticorps marqués se sont fixés sur les antigènes correspondants: les glycoprotéines membranaires. À t=40mn, on observe une fluorescence homogène (verte et rouge) sur toute la surface de l'hétérocaryon. Donc le complexe antigène-anticorps de type souris et de type humain se sont mélangés dans la membrane de l'hétérocaryon. Conclusion: les protéines membranaires se déplacent ou diffusent dans la membrane plasmique. 35 Chapitre IV LE HYALOPLASME 1. Définition C’est la substance fondamentale de la cellule qui représente 50 – 60% du volume cellulaire. C’est une solution aqueuse complexe (cytosol) consolidée par un réseau de filaments protéiques: le cytosquelette. Cytoplasme = hyaloplasme + organites (sans le noyau) 2. Composition chimique du cytosol - Eau: 70% - Protéines: 15-20% - ARNm et ARNt - Divers solutés: sucres solubles, acides aminés, nucléotides, composés organiques, ions… - pH 7 (cellule animale) et pH 5,5 à 6 (cellule végétale) 3. Réserves granulaires du hyaloplasme - Réserves de glucose: particules de glycogène (polymère de glucose) dans les CA. - Réserves de lipides: globules lipidiques observés dans les CA et CV. 4. Cytosquelette : Ensemble de protéines fibreuses, uniquement chez les eucaryotes. 36  Trois réseaux sont identifiables au ME et en immunofluorescence chez les CA: Microtubule Filaments d’actine Filaments intermédiaires (Tubuline) (Actines) (Protéines hétérogènes) 4.1 Microtubules Structures tubulaires linéaires de 25 nm de diamètre, apparaissent sous forme de « rails » en coupe longitudinale et sous forme circulaire en coupe transversale. - Le constituant principal est une protéine globulaire de 50 kDa: la globuline qui elle-même comprend 2 s/u: les tubulinesα et β. - Les tubulines α et β constituent spontanément des filaments linéaires : protofilaments (cylindres de 25 nm). - La paroi du microtubule est constituée de 13 protofilaments. Ce sont des structures polaires avec une extrémité (+) dirigée vers la périphérie de la cellule et une extrémité (-) associée au centrosome qui est un complexe protéique constitué de 2 centrioles. Les microtubules sont des structures dynamiques : ils sont constamment en cours de polymérisation et de dépolymérisation. 37 Ces structures sont stabilisées par les MAP (microtuble-associated-proteins) qui sont regroupées dans 2 groupes : - MAP2 et 4 ainsi que Tau (principalement dans les cellules nerveuses) - Les protéines motrices : kinésines et dynéines qui assurent le transport des organites et des vésicules vers différents compartiments de la cellule en se déplaçant sur le microtubule : les kinésines se déplacent vers l’extrémité(+) et les dynéines vers l’extrémité (-). Ces protéines motrices utilisent l’énergie dérivée de l’hydrolyse de l’ATP pour se déplacer. 38  4.1.1- Constitution des cils et flagelles A la base des cils et flagelles, on trouve les corpuscules basaux ou cinétosomes :9 triplets périphériques (comme les centrioles) et des lames rayonnantes partant de chaque triplet et orientées vers le centre du cinétosome. Axonème de type (9+2) Principe de courbure des cils et flagelles (a) Glissement de 2 doublets de microtubules adjacents, les têtes de dynéine se déplacent de l’extrémité (+) vers l’extrémité (-) grâce à l’hydrolyse de l’ATP. (b) Courbure des 2 doublets fixés par leur extrémité (-) au sein de l’axonème. Le mouvement des têtes de dynéine provoque la flexion de l’ensemble. (c) La molécule de néxine agit comme un élastique, permettant le retour à la position initiale. 39  4.1.2- Constitution des faisceaux de division Les protéines motrices jouent un rôle important au moment de la division cellulaire. Elles permettent le transport des chromosomes après leur division le long du fuseau achromatique. Au cours de la mitose, le centrosome se duplique en 2 centrosomes fils : chaque centrosome devient un pôle du fuseau. Le fuseau est constitué de deux types de microtubules: les polaires et les kinétochoriens. 4.1.3- Différenciation de la forme cellulaire Le terme "différenciation" désigne l'ensemble des évènements qui transforment une cellule méristématique en cellule mature. La cellule acquiert donc la structure et la fonction qui seront les siennes, à l'état mature. Cellule méristématique Cellule xylémienne mature Les microtubules et les myofibrilles participent à l’orientation de l’allongement cellulaire lors de la différentiation. 4.2. Microfilaments d’actine Ce sont des fibres fines contractiles, organisées en faisceaux de 7 à 8 nm d’épaisseur, constituées d’une protéine globulaire: l’actine. Elles sont souvent localisées dans le cortex (près de la membrane plasmique). Elles existent dans toutes les cellules animales, particulièrement abondantes dans les cellules musculaires (myofilaments) et les microvillosités de l’épithélium intestinal où elles jouent un rôle de soutien et de mouvement cellulaire. Elles sont relativement instables (labiles): peuvent s’allonger ou se raccourcir assez rapidement. 40  Ces microfilaments sont associés à plusieurs types de protéines accessoires : protéines de rassemblement, de stabilisation ou de fragmentation, de coiffage et les myosines. Une autre protéine peut se fixer sur l’actine et glisser dessus : la myosine. Dans le cas des cellules végétales chlorophylliennes, la myosine XI se fixe par une extrémité à la membrane des chloroplastes et parcourt l’actine par son autre extrémité. C’est le mouvement de cyclose. 4.3. Filaments intermédiaires ou tonofilaments Ce sont des fibres de 8 à 12 nm d’épaisseur, constituées de protéines fibreuses sous forme de monomères qui diffèrent selon le type cellulaire (ex: kératine).Ils existent en particulier dans les cellules épidermiques et les cellules nerveuses (neurofilaments). Ils jouent un rôle de jonction entre les cellules animales. 41  5. Activités métaboliques du hyaloplasme Cytosol: milieu aqueux riche en enzymes et millions de substrats qui subissent des modifications en chaîne constituant des voies métaboliques. Ex: la glycolyse : dégradation de glucose-6P pour former deux molécules d’acide pyruvique. Rappels  ATP: adénosine-tri-phosphate (nucléotide), forme d’énergie directement utilisable par la cellule. Les deux derniers phosphates sont reliés à la molécule par des liaisons riches en énergie, sous l’action d’une enzyme ATPase. La réaction est réversible. ATP ADP + P + énergie  Co-enzymes transporteurs d’H2 : NAD+, NADP+:nicotinamide-adénine-dinucléotide (P): formes oxydées, accepteurs d’H2 NADH,H+, NADPH,H+ : formes réduites, donneurs d’H2 Une co-enzyme (molécule non protéique) travaille en collaboration avec une enzyme en effectuant une fonction précise: ici le transport d’H2. Glucose + 2 NAD+ + 2ADP + 2 Pi 2 pyruvate + 2NADH,H+ + 2ATP + H2 Le pyruvate produit par la glycolyse peut être utilisé de différentes manières : - chez les animaux, en présence d'oxygène, il est oxydé et produit de l'eau et du CO2. - Si l'oxygène est en quantité limitée, il est converti en lactate ou éthanol. 42  5. Les ribosomes Ce sont des complexes ribonucléoprotéiques présents dans les cellules procaryotes et eucaryotes. Leur fonction est de synthétiser les protéines en décodant l’information contenue dans l’ARN messager. Ils sont constitués d’ARN ribosomique (65%) et de protéines (35%). Ils se trouvent dans le cytoplasme, libres ou associés aux membranes du réticulum endoplasmique, à l’enveloppe nucléaire ou à la membrane interne de certaines bactéries ainsi que dans certains organites comme la mitochondrie. Ils peuvent être isolés par fractionnement et sous-fractionnement : Broyage et fractionnement cellulaire : obtention des membranes (du RE par exemple Addition d’un détergent dans le milieu : séparation entre les mb (microsomes lisses ) et les ribosomes. Diminution de la concentration de Mg 2+ dans le milieu : séparation des 2 sous-unités du ribosome. 43 Chapitre V Le noyau C'est l'organite qui caractérise les cellules eucaryotes. Observé au cours du XVIIe siècle, le noyau fut pour la première fois interprété comme un constituant essentiel et permanent de la cellule par Robert Brown, à la suite de ses observations sur des épidermes d'Orchidées, en 1831. 1. Caractéristiques  Nombre : En général, la cellule contient un noyau : cellule mononucléée. Il existe cependant certaines cellules anucléées (hématies) ou bien polynucléées (fibres musculaires striées squelettique).  Forme : Pendant l’interphase, la forme du noyau est sphérique ou ovoïde. Il peut aussi être polylobé.  Taille : elle varie entre 3 et 10 m de diamètre. Elle est quantifiée par le Rapport NucléoPlasmique (R.N.P) RNP= volume du noyau / volume du cytoplasme Plus une cellule est différenciée, plus le R.N.P augmente. Par contre, le R.N.P d’une cellule en division diminue de façon très importante. 2. Organisation du noyau 2.1. Enveloppe nucléaire C’est une double membrane (70% protéines et 30% lipides) séparée par un espace périnucléaire de nature protéique et de 20-50 nm d’épaisseur : - Membrane nucléaire externe, recouverte de ribosomes et en continuité directe avec les membranes du réticulum endoplasmique rugueux. - Membrane nucléaire interne, recouverte d’une couche protéique fibreuse: la lamina. 44 L’enveloppe nucléaire est percée de pores nucléaires qui permettent la communication entre le cytoplasme et le nucléoplasme : - molécules transportées du cytoplasme vers le noyau: protéines de formation de la chromatine, protéines de formation de la lamina et protéines qui régulent l’activité de réplication et de transcription de l’ADN. -les molécules synthétisées dans le noyau et exportées vers le cytoplasme : les ARN. Chaque pore est formé par une structure appelée le complexe du pore nucléaire, qui semble être composé d’au moins 100 protéines différentes (les nucléoporines), arrangées selon une symétrie octagonale (d’ordre 8). Ce complexe correspond à une fusion des membranes externes et internes. Leur nombre varie de 3 000 à 4 000 par noyau (2 à 60 /µm²). 2.2. Lamina C’est une couche protéique (10 à 20 nm d’épaisseur) constituée de filaments intermédiaires assemblés à partir de 3 protéines: lamines nucléaires A, B et C. 45  2.3.Nucléoplasme Le nucléoplasme (matrice gélatineuse) renferme la quasi-totalité de l'information génétique, soit 2m d'ADN double brin enfermé dans une structure chromatinienne présentant dans le temps différents niveaux de condensation. Il contient également des ions, des protéines, des enzymes et des nucléotides. S’y trouvent également les nucléoles et la chromatine. 2.4. Chromatine C’est la forme sous laquelle apparaît le matériel génétique quand la cellule n’est pas en division: enchevêtrement de filaments qui est la forme la plus décondensée des chromosomes. C’est un assemblage d’ADN et de protéines, principalement histones et non histones (PNH). L’hétérochromatine est dense, très opaque aux e-. Située contre l’enveloppe nucléaire et en amas isolés au centre du noyau. L’euchromatine est diffuse, claire et dispersée. Constituée de fines fibres associées à l’hétérochromatine. 2.5. Nucléole C’est une structure de quelques micromètres de diamètre dans le noyau qui peut être isolée et caractérisée. Elle contient de l'ADN (chromatine condensée et non condensée), des protéines et des ARN. Il est le siège de transcription des gènes ribosomiques et des gènes de transcription des ARN.  Centre fibrillaire: c’est le siège de l'allongement des ARN pré-ribosomique.  Composant granulaire (zone de stockage des pré- ribosomes): contient des particules pré-ribosomiques (ribonucléoprotéines) à aspect granulaire de 15-20 nm de diamètre.  Centre fibrillaire dense: entourant les centres fibrillaires, c'est une chromatine compacte. Elle correspond aux organisateurs nucléolaires (segments d’ADN qui expriment les gènes sous forme d’ARNr). 46 C’est donc le lieu de synthèse de l’ARNr, qui sera assemblé avec les protéines ribosomales cytoplasmiques pour former les s/u des ribosomes. Ils correspondent sur les chromosomes en division à des constrictions secondaires. 3. Chromosomes C’est le support physique des gènes, constitués surtout d’ADN et de protéines. Ils sont présents dans les cellules de tous les êtres vivants, en forme de bâtonnet dans le noyau des cellules eucaryotes et circulaires chez les bactéries. Le nombre chromosomique est caractéristique de chaque espèce, ex: 46 chez l’homme. Caryotype humain 47  4. L’ADN En 1953, James Watson, physicien anglais, et Francis Crick, biologiste américain, qui travaillent au Cavendish laboratory à Cambdrige, proposent une structure hélicoïdale de la molécule d’ADN. a- Structure primaine Un nucléoside est constitué d'un sucre + une base azotée. Un nucléotide est constitué d'un phosphate + un sucre + une base azotée. L’ADN est un polymère de nucléotides.  Acide phosphorique: Donne un groupement phosphate.  Sucre : Désoxyribose, qui est un pentose (sucre à 5 carbones) cyclique. Le sucre de l'ARN est un ribose. Les carbones du sucre sont notés de 1' à 5'. Un atome d'azote de la base azotée se lie au C1' (liaison glycosidique), et le phosphate se lie au C5' (liaison ester) pour former le nucléotide. Le nucléotide est donc: phosphate - C5' sucre C1' - base. 48   Bases azotées - Purines: adénine (A) et guanine (G). - Pyrimidines: cytosine (C) et thymine (T) - La thymine est remplacée par l'uracyle (U) dans l'ARN). b- Structures secondaire et tertiaire de la molécule : Conformation tri-dimentionelle de l' ADN b1. Dinucléotides Les dinucléotides se forment par liaison phosphodiester entre 2 mononucléotides. Le phosphate d'un mononucléotide (en C5' de son sucre) se lie au C3' du sucre du mononucléotide précédant. Ainsi, nous partons d'un phosphate, puis un 5' sucre (+base) et le 3' de ce sucre, lié à un second phosphate - 5' sucre, dont le 3' est libre pour la prochaine étape d'élongation. L'orientation de la molécule est par conséquent 5' -> 3'. Les polynucléotides sont faits donc de l'addition successive de monomères dans une configuration 5' -> 3' et le squelette de la molécule est fait de la succession de phosphate-sucre (nucléotide n) - phosphate-sucre (nucléotide n+1) - …, liés de manière covalente, les bases étant à l'extérieur. 49  b2. Molécule d’ADN La succession des nucléotides au niveau d’un brin d’ADN varie au sein de la même molécule et entre les molécules de différents individus et différentes espèces: on parle de séquence d’ADN. Cette séquence constitue une information génétique écrite avec un alphabet à 4 lettres. Les deux chaînes de nucléotides sont reliées au niveau des bases azotées. L’adénine est toujours associée à la thymine (A-T) par 2 liaisons hydrogène, la cytosine est associée à la guanine (G-C) par 3 liaisons hydrogène : les deux chaînes sont complémentaires. L’ADN d’un individu donné est divisé en différentes parties, chacune gouverne un caractère donné. Ces fragments sont appelés gènes. Les différentes versions du même gène issues généralement de mutations sont appelées allèles. 5- De la chromatine aux chromosomes La longueur totale de la double hélice d’une cellule humaine est de 1,90m alors que la longueur totale du chromosome métaphasique est de 220µm. Donc pour être contenu dans le chromosome, l’ADN doit être condensé 8600 fois. 50   Nucléosome : L’ADN des cellules eucaryotes se combine avec des protéines basiques appelées histones pour former des structures appelées nucléosomes. Ces structures contiennent 4 paires de particules protéiques histones (H2A)x2, (H2B)x2, (H3)x2 et( H4)x2 entourées deux fois par le filament d’ADN d’une longueur de 60 paires de base (pB). Entre les nucléosomes, il y a les liens internucléosomiques constitués d’ADN associé à l’histone H1.  Fibre nucléosomique : L'étape suivante est une étape de maturation nécessitant la présence d'ATP, au cours de laquelle les nucléosomes sont régulièrement espacés et forment le nucléofilament. Pendant cette étape, les histones nouvellement incorporées sont désacétylées. Cette étape condense l’ADN de 6 à 7 fois.  Nucléofilament :La formation de ce filament cylindrique de 10 nm induit un raccourcissement de la fibre nucléosomique d’un facteur 7 (structure en collier de perles). Fibre chromatinienne ou chromosomique : Ensuite l'incorporation des histones internucléosomales est accompagné par le repliement (d’ordre 7) du nucléofilament en fibre de 30 nm dont la structure n'est pas élucidée à ce jour. Deux modèles principaux existent : le modèle de type solénoïde et le modèle de type zig zag.  Au MEB, la surface de cette fibre chromatinienne apparaît couverte de boucles, les microconvules: formations provenant du repliement du nucléofilament avec un facteur de condensation de cette fibre d’ordre 10 51   Enfin, au cours de la prophase ces microconvules vont à leur tour s’enrouler autour d’une colonne axiale formée de protéines non-histones (ordre 20). Ce processus permet de passer d’une longueur totale de 1,90 m pour l’ADN humain à une longueur de 220μm correspondant à la longueur totale des chromosomes. C’est une condensation d’environ 8000 fois. Le degré de condensation et la visibilité maximale des chromosomes sont atteints à la métaphase: ils sont constitués de 2 chromatides identiques liées au niveau du centromère.  Le centromère ou constriction primaire est une région étranglée du chromosome où les 2 chromatides sont reliées entre elles. Chaque chromatide porte un centre organisateur de microtubules: le kinétochore qui joue un rôle dans les mouvements des chromosomes lors de la division. Les bras du chromosome sont situés de part et d’autre de ce centromère.  Les constrictions secondaires correspondent à l’emplacement d’un nucléole en période interphasique, il s’agit de l’organisateur nucléolaire qui contient les gènes ribosomiques.  Les télomères sont des séquences d’ADN particulières situées aux extrémités des chromosomes. Ils sont composés de répétitions d’une courte séquence qui contient un ensemble de nucléotides G voisins. Par exemple, chez l’homme : GGGTTA 52 Ils jouent un rôle de stabilisation et de protection des extrémités chromosomiques empêchant les chromosomes de fusionner entre eux.  6- Transmission de l’information génétique En prenant l’exemple du cycle biologique humain, il est possible de connaître la progression du nombre de chromosomes. L’être humain a reçu 46 chromosomes, 23 du père et 23 de la mère. Ces chromosomes paternels et maternels se sont assemblés dans le noyau d’une cellule unique appelée zygote formée par la fusion d’un spermatozoïde et d’un ovule. A partir de ce zygote, la mitose produit les milliards de cellules somatiques qui composent l’organisme humain. Ce même processus continue d’engendrer de nouvelles cellules pour remplacer les cellules mortes ou endommagées. Par contre, les spermatozoïdes et les ovules sont produits par un autre type de division cellulaire, la méiose, qui produit des cellules filles non identiques à la cellule mère et qui contient 2 fois moins de chromosomes (23 seulement). La méiose se produit uniquement au niveau des organes reproducteurs. 6.1. Mitose Un cycle cellulaire complet comporte 2 phases :  La mitose = la division cellulaire proprement dite  L’interphase qui sépare 2 mitoses. a) Interphase : constituée de 3 périodes : G1, S et G2.  La phase G1, du terme anglais Gap (= vide), c'est-à-dire pas d’activité réplicative de l’ADN. Pendant cette phase, il y a une synthèse intense de divers ARN (ARNm, ARNr...), de divers enzymes (ADN polymérase, ARN polymérase...) et de diverses protéines (histones...) : la cellule se prépare à la réplication de son ADN.  La phase S: C’est la phase de la biosynthèse de l’ADN. La cellule duplique son ADN, à ce moment la cellule diploïde aura 4C d’ADN et 4N de chromosomes. 53   La phase G2 : La cellule est toujours en condition tétraploïde (4N et 4C). La synthèse protéique est intense et concerne surtout les protéines de l’appareil mitotique. A ce moment la cellule augmente grandement de volume mais elle n’est pas encore en division, la mitose est en préparation. b) Mitose : S’articule autour de 4 phases, suivies par la division cytoplasmique (cytodiérèse).  Prophase : La chromatine se condense (se spiralise) en chromosomes bien visibles au microscope. Chaque chromosome est formé de deux chromatides sœurs unies par un centromère. Durant cette phase, le nucléole se désintègrepeu à peu puis disparaît totalement. Le centrosome (qui comporte deux centrioles) qui a commencé à se dupliquer depuis la fin de la phase S, se dédouble et chaque centrosome s’entoure de microtubules rayonnants (aster) et se déplace vers un pôle opposé de la cellule formant ainsi deux asters diamétralement opposés. La membrane nucléaire a disparu et les fuseaux des microtubules commencent à irradier des centrosomes.  Métaphase: Les chromosomes, dont la spiralisation est maximale, sont animés de mouvements par les fibres du fuseau achromatique. Ils finissent par se placer dans la région médiane de la cellule à égale distance des deux pôles formant la plaque équatoriale (ou plaque métaphasique). Les microtubules kinétochoriens sont dirigés de part et d’autre des chromatides vers les centrioles. Les chromatides sœurs ne sont pas encore séparées. La métaphase est la phase durant laquelle la plupart des études morphologiques sur les chromosomes mitotiques sont réalisées. 54   Anaphase : Au cours de cette phase, les centromères se fissurent et les chromatides sœurs se séparent en deux chromosomes indépendants. Chacun de ces chromosomes contient un centromère qui est lié à un pôle de la cellule par une fibre du fuseau achromatique. Chaque chromosome se déplace vers un pôle de la cellule par raccourcissement des microtubules kinétochoriens qui se dépolymérisent. C’est donc dans cette phase que chaque copie du chromosome est distribuée à chaque cellule fille.  Télophase: Au cours de la télophase, les chromatides atteignent les pôles de la cellule, les microtubules kinétochoriens deviennent de plus en plus courts et se dépolymérisent. A ce moment, les chromosomes fils se regroupent autour de l’aster, se déroulent et deviennent moins apparents. Le nucléole réapparaît de nouveau et de nouvelles membranes nucléaires se reforment autour des noyaux des cellules filles. Le fuseau mitotique et les microtubules disparaissent. c) d) e) c) La cytodiérèse: La division cytoplasmique débute en fin d’anaphase ou lors de la télophase. Au cours de cette phase finale de la mitose, la membrane plasmique de la cellule en division s’invagine dans la région médiane de la cellule formant un sillon de division qui se creuse peu à peu jusqu’à scinder la cellule en deux cellules filles. Dans la cellule animale, un anneau contractile d’actine et myosine se forme dans la zone équatoriale et se contracte, tirant la membrane vers l’intérieur. Ainsi, une rainure de clivage est provoquée qui étrangle le cytoplasme jusqu’à ce que les 2 cellules filles se séparent. 55 Dans la cellule végétale, des vésicules golgiennes chargées en substances pariétales se placent à l’équateur de la cellule pour former une paroi. Puis la membrane cellulaire se développe des deux côtés, formant 2 cellules filles complètement séparées. 6.2. Méiose C’est une division cellulaire particulière dans laquelle une cellule diploïde à 2n chromosomes donne naissance à 4 cellules haploïdes à n chromosomes. C’est une division réductionnelle qui réduit d moitié le nombre de chromosomes. La seconde division est équationnelle : elle scinde chaque chromosome en deux chromatides. a) Méiose I :  Prophase I : constituée de cinq stades. - Leptotène (=condensation) l’ADN se condense en chromosomes déjà constitués de 2 chromatides. - Zygotène (=disposition par paire) les chromosomes homologues s’apparient formant des bivalents. - Pachytène (=échange de matériel génétique) les 2 chromatides ne sont plus reliées que par le centromère formant des tétrades. A ce stade, commence le crossing-over. - Diplotène : les chromosomes ne restent unis qu’au niveau des crossing-over. - Diacinèse : nouvelle condensation des chromosomes et séparation des chromatides qui restent attachées au niveau des chiasmas. Le nucléole et la membrane nucléoles disparaissent.  Métaphase I: les bivalents se disposent en plaques équatoriales avec formation du fuseau achromatique et disparition dela membrane nucléaire et des nucléoles. 56  Anaphase I: les chromosomes homologues se séparent et migrent vers les pôles. La rupture des chiasmas aboutità l’échange de morceaux de chromosomes entre les chromosomes homologues.  Télophase I: formation de noyaux fils haploïdes. b) Méiose II :  Prophase 2: Disparition de l’enveloppe nucléaire et Formation du fuseau achromatique.  Métaphase 2: Les chromatides se placent au centre de la plaque équatoriale.  Anaphase 2: séparation des chromatides qui migrent vers les pôles opposés.  Télophase 2 : Formation de 4 cellules haploïdes résultant des 2 divisions chromatiques 57 58  7- La synthèse protéique C’est le processus par lequel une cellule assemble une chaîne protéique en combinant des acides aminés isolés présents dans son cytoplasme, guidé par l'information contenue dans l'ADN. Elle se déroule en deux étapes au moins : la transcription de l'ADN en ARN messager et la traduction de l'ARN messager en une protéine. L’information est localisée dans le noyau (sous forme d'ADN) et la synthèse des protéines s’effectue dans le cytoplasme (au niveau des ribosomes du réticulum endoplasmique) : l'ADN ne sort pas du noyau. L'information passe au cytoplasme sous forme d'une copie : l'ARN. 7.1. Transcription : première étape de la synthèse d'une protéine C’est la copie du gène (ADN) en une molécule d'ARN. Les ARN sont synthétisés à partir de segments bien définis de l’ADN. Ce sont des unités de transcription ou gènes. Chaque unité de transcription présente un site promoteur et un site de terminaison que les enzymes de transcription, ARN polymérases (ARNpol) reconnaissent. La transcription commence par l'ouverture et le déroulement d'une portion de la molécule en double hélice d'ADN. Au fur et à mesure de sa progression le long de l'ADN, l'ARN-polymérase incorpore des nucléotides présents dans le milieu cellulaire. Cette incorporation s'effectue par complémentarité des bases azotées avec l'un des brins de la molécule d'ADN : l'adénine (A) se place en face de la thymine (T) et l'uracile (U) se place en face de l'adénine (A), la cytosine(C) se place en face de la guanine (G) et inversement. 59 Le brin d'ARN messager ainsi synthétisé est complémentaire du brin d'ADN transcrit. L'information contenue dans l'ARN messager est identique à celle du brin d'ADN non transcrit. Le nucléotide uracile (U) occupe dans l'ARN la place du nucléotide thymine (T) de l'ADN. L'ARN-polymérase se déplace toujours dans le même sens sur un brin et dans le sens opposé sur l'autre brin. Elle se détache sur un site présentant des caractéristiques particulières signalant la fin du gène. Ensuite, lorsque l'ARN-polymérase s'est détachée, les deux brins d'ADN s'associent de nouveau au fur et à mesure de l'avancée de l'enzyme, et se retrouvent comme ils étaient avant la synthèse d'ARN. Remarque importante : De l'ARN est produit très rapidement et en grande quantité : plusieurs molécules d'ARN-polymérase effectuent simultanément la transcription du même gène. Plusieurs gènes peuvent être transcrits simultanément dans le noyau d'une même cellule. 7.2. Traduction : de l'ARN à la protéine La traduction se déroule dans le cytoplasme des cellules eucaryote, au sein de structures spécialisées : les polysomes comprenant  une molécule d'ARN messager mature.  des ribosomes  des acides aminés précurseurs. Chaque ribosome se lie à l'ARN au niveau du codon AUG ou codon d’initiation puis progresse le long de l'ARN jusqu'à un codon stop (UAA ou UAG ou UGA) où le ribosome se détache et libère le polypeptide synthétisé. Au cours de son déplacement, le ribosome met en place chaque acide aminé en fonction du codon correspondant sur l'ARN. Au cours de sa progression la chaîne peptidique s'allonge donc d'un acide aminé tous les trois nucléotides de l'ARN. 60 L’anticodon est un groupe de 3 nucléotides localisé dans la structure des ARN de transfert. Ce triplet s’apparie spécifiquement à la séquence complémentaire du codon présent sur le brin d’ARNm. Cette complémentarité spécifique « codon-anticodon » permet de faire correspondre un acide aminé à un codon, selon le code génétique. Lorsque l’appariement « codon-anticodon » se fait dans le ribosome, celui-ci peut ajouter l’aa à la protéine en cours de synthèse. 61  7.3. Le code génétique C'est la correspondance entre les codons c'est-à-dire les triplets de nucléotides des ARNm et les acides aminés enchaînés lors de la production d'une protéine (séquence peptidique). - Un codon code toujours pour le même aa. - Un aa peut être codé par plusieurs codons différents : le code génétique est redondant. - Il existe des codons-stop: triplets de nucléotides marquant la fin de l'information le long d'un ARN m -Il existe un codon d’initiation: le codon AUG qui marque le début de l'information génétique sur un ARN m. - le code génétique est universel: il est le même chez tous les êtres vivants. La reconnaissance entre une molécule d’ARNt et l’acide aminé approprié se fait grâce à des enzymes :les aminoacyl-ARNt synthétases. Il existe 20 enzymes, toutes présentes dans le cytoplasme, capables de reconnaître à la fois l’acide aminé et l’ARNt correspondant et de permettre leur couplage. L’enzyme d’activation libère l’ARNt chargé (ARNt attaché à son AA) et peut ensuite charger un autre ARNt.L’énergie libérée par la rupture de la liaison AA - ARNt permet la création d’une liaison AA-AA. Schéma de la synthèse protéique chez les eucaryotes Rmq : Les introns sont donc des régions non-codantes (supprimés par épissage) et les exons des régions codantes (exprimées). 62 Chapitre VI : Système de conversion d’énergie : mitochondries et chloroplastes MITOCHONDRIE 1. Caractéristiques - Forme: bâtonnet ou sphérique - Longueur: 1 à 4 µm - Diamètre: 0,3 à 0,7 µm - Localisation: dans toutes les cellules des Eucaryotes - 1000/cellule, en moyenne - Volume: 20% du cytoplasme 2. Ultrastructure 2.1. Membranes  Membrane externe (60 Å d’épaisseur): 60% protéines et 40% lipides  Espace intermembranaire (100 Å de largeur)  Membrane interne (60 Å d’épaisseur): 80% protéines et 20% lipides - Forme des replis vers l’intérieur ce qui augmente sa surface: crêtes, perpendiculaires au grand axe de la mitochondrie. - Imperméable à la diffusion de H+ (protons). - La surface des crêtes est tapissée de sphères de 90 Å de diamètre reliées à la crête par un pédoncule. Il s’agit de l’ATP synthase qui catalyse la synthèse d’ATP. 2.2. Matrice : C’est la substance fondamentale où se produisent des réactions métaboliques et qui contient: - des granules denses de 300Å environ (accumulations de cations) - des mitoribosomes, plus petits que ceux du hyaloplasme (synthèse protéique) - ADNmt sous forme de chromosome circulaire qui permet à la mitochondrie de synthétiser certaines de ses protéines (environ 20%).La mitochondrie reste cependant dépendante de l’ADN nucléaire pour la synthèse de la plupart de ses protéines : organite semi-autonome. 3. Respiration cellulaire (mitochondriale)  Ensemble de réactions complexes qui aboutissent à la formation d’ATP et qui sont accompagnées par des échanges gazeux respiratoires: absorption d’O2 et dégagement de CO2.  On peut la diviser en trois étapes qui fonctionnent simultanément. 63  3.1. Première étape: oxydation des substrats (Lieu: la matrice) L’acide pyruvique et les acides gras sont oxydés par perte d’H2 (déshydrogénation) qui sont captés soit par le NAD+ pour devenir NADH,H+ soit par le FAD pour devenir FADH2. Ces 2 substrats fournissent l’acétyl-CoA qui permet le fonctionnement du Cycle de Krebs (Cycle de l’acide citrique). Les co-enzymes réduits vont participer à la chaîne respiratoire (2ème étape) en tant que donneur d’H2. 3.2. Deuxième étape: chaîne respiratoire (Lieu: membrane mitochondriale interne: crêtes mitochondriales) Le NADH,H+ subit une déshydrogénation au niveau du complexe NADH déshydrogénase dans la membrane interne mitochondriale. NADH+H+ → NAD+ + 2H+ + 2e- Seuls les e- seront transportés le long de la chaîne respiratoire qui comporte 3 complexes enzymatiques respiratoires principaux ainsi que 2 transporteurs intermédiaires: a- Complexe NADH déshydrogénase (Plus de 22 chaînes polypeptidiques) Accepte des e- du NADH,H+ et les transporte à l’ubiquinone. b- Complexe cytochrome b-c 1 (8 chaînes polypeptidiques) Contient un atome de fer ou de cuivre qui permet le transport des e- de l’ubiquinone vers le cytochrome c. c- Complexe cytochrome oxydase(9 chaînes polypeptidiques au moins) Accepte des e- du cytochrome c et les transmet à O2qui capte en même temps des protons (2H+)  production d’eau : 2H+ + 2e- + ½ O2 → H2O 64 3.3. Troisième étape: formation d’ATP: phosphorylation oxydative Le transport des électrons entraîne une chute importante de l’énergie qui est utilisée pour le pompage de protons (H+)de la matrice vers l’espace intermembranaire. Comme la membrane interne est imperméable aux