Aulas Práticas de Micologia 2024-2025 - Egas Moniz School

# Aulas Práticas de Micologia ## Egas Moniz School of Health & Science | Instituto Universitário Egas Moniz ## Teresa Nascimento [email protected] ## 2024-2025 ## Calendarização das Aulas Práticas de Micologia | Semana | Date | Tópicos | Professor | |---|---|---|---| | 7ª | 14/out...

# Aulas Práticas de Micologia ## Egas Moniz School of Health & Science | Instituto Universitário Egas Moniz ## Teresa Nascimento [email protected] ## 2024-2025 ## Calendarização das Aulas Práticas de Micologia | Semana | Date | Tópicos | Professor | |---|---|---|---| | 7ª | 14/out | Modo de funcionamento das aulas de Micologia. Caracterização macroscópica e microscópica dos fungos. Estudo dos fungos leveduriformes (exame direto e cultural). *Candida albicans*, *C. krusei*, *C. glabrata*, *C. parapsilosis*, *C. tropicalis*, *C. guilliermondii*, *Cryptococcus neoformans*, *Rhodothorula*, *Geotrichum spp* e *Trichosporon sp*. | Teresa Nascimento | | 7ª | 18/out | Avaliações intercalares sem aulas | Guilhermina e Teresa | | | 21-31 out | | | | | 01/nov | Feriado | | | 8ª | 4 e 8 nov | Identificação Laboratorial de Fungos Leveduriformes (Leitura do ex. Cultural, ID e antifungigrama) | Teresa Nascimento | | 9ª | 11 e 15 nov | Estudo de fungos filamentosos: *Aspergillus spp* ( *niger*, *fumigatus*, *versicolor*, *terreus*, *candidus*) | Teresa Nascimento | | 9ª | | Estudo de fungos filamentosos: Fungos hialinos e demácios (géneros *Penicillium*, *Verticillium*, *Cladosporium*, *Fusarium*, *Alternaria*) | Teresa Nascimento | | 10ª | 18 e 22 nov | Estudo de fungos filamentosos: Mucormicetes | Teresa Nascimento | | 11ª | 25 e 29 nov | Estudo de fungos filamentosos associados às dermatofitoses: *Trichophyton tonsurans*, *Microsporum gypseum*, *Trichophyton mentagrophytes*, *Epidermophyton floccosum*, *Trichophyton rubrum*, *Microsporum canis* | Teresa Nascimento | | 12ª | 2 e 6 dez | Avaliação Prática do módulo de Micologia | | | 13ª | 9 e 13 dez | Apresentação do trabalho OMS | | # Estudo dos Fungos Leveduriformes ## Egas Moniz School of Health & Science ### Aulas Práticas de Micologia ### Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas ### Teresa Nascimento ### [email protected] ## Leveduras - Unicelulares, 3-5 µm, reproduzem-se por gemulação (formação de blastoconídios) ou fissão binária - Identificam-se pela morfologia macroscópica e microscópica; - A identificação fenotípica das leveduras é baseada nas reações bioquímicas baseadas na fermentação e assimilação dos carbohidratos, utilização de enzimas e outras atividades metabólicas. - Identificação genotípica por biologia molecular ou proteómica ## Fungos Leveduriformes ### Géneros: - *Candida* - *Cryptococcus* - *Rhodotorula* - *Trichosporon* - *Magnusiomyces* (*Geotrichum*) ## Género Candida - *C. albicans* - *C. parapsilosis* - *C. glabrata* - *C. tropicalis* - *C. krusei* - *C. quilliermondii* ## Exame Microscópico - Células leveduriformes esféricas ou ovais, gemulação multilateral - Células filamentosas, unidas pela extremidade (pseudohifas) e produtoras de blastóporos; podem aparecer hifas verdadeiras. Estas constituem o micélio. - *C. albicans* é a única levedura que produz *in vivo* hifas e pseudohifas. ## Blastóporos ## Pseudohifas ## Hifas ## Exame Microscópico - Coloração com azul de lactofenol ## Técnica: - Colocar uma gota de lactofenol sobre a lâmina. - Retirar um pequeno fragmento da cultura do fungo com ajuda do fio de platina; - Colocar o fragmento da cultura sobre a gota de lactofenol e homogeneizar; - Cobrir com lamela e observar ao microscópio nas objetivas de 10X e 40; - Desenhar as estruturas ## Género Candida ## Exame Cultural - Em aerobiose, fácil de cultivar, no entanto o seu crescimento a partir de material clínico pode ser impedido por bactérias de crescimento mais rápido. - Sabouraud - Sabouraud + doranfenicol Meios cromogénicos - Meio Candida ID - Meio de CHROMagar/Brilliance Agar ## Exame ### Meios de Isolamento - O meio de cultura mais utilizado para o isolamento dos fungos responsáveis por micoses é o meio de Sabouraud. - Meio de Sabouraud- agar à base de glucose e peptona, pH 5.6, podendo ser adicionado de antibióticos como o cloranfenicol e/ou gentamicina. - No entanto, este meio deve ser adicionado de antibióticos como o cloranfenicol ou a gentamicina para impedir o desenvolvimento de bactérias que normalmente acompanham os produtos biológicos. - Os meios de cultura podem ser distribuídos em placa ou em tubo. ## Técnicas de Isolamento ### Fungos Leveduriformes - Isolamento de colónias de leveduras. Procedimento: - Escolha uma espécie de fungo leveduriforme. - Trabalhar SEMPRE junto da chama do bico de Bunsen. - Retirar uma UFC de levedura da placa (ou tubo de cultura) ### Nota: Tempo e temperatura de incubação variável de acordo com o género. ## Leitura do exame cultural e ID com base nas características morfológicas - O tempo de crescimento e desenvolvimento normal das colónias é variável de fungo para fungo. - Uma vez obtida a cultura, a identificação do fungo será feita pelo estudo das características morfológicas (macro e microscópicas) e fisiológicas. - A identificação dos fungos, de modo ideal, *deve* contemplar o género e a espécie; porém, muitas vezes, isso não é possível, pelo grau de dificuldade e complexidade do exame. ## Exame cultural ## Exame macroscópico das colónias ### Candida - As colónias apresentam-se de cor branca porcelana e consistência cremosa, após crescimento 24-48h /35°C ### Aspeto macroscópico das culturas de *Candida não-albicans* - *C. krusei* - *C. guilliermondii* - *C. parapsilosis* - *C. tropicalis* - As colónias apresentam-se de cor branca porcelana e consistência cremosa, após crescimento 24-48h /35°C ## Meios cromogénicos - CHROMagar *Candida* - *C. tropicalis* *C. albicans* - *C. parapsilosis* - *C. glabrata* - (*C. krusei*) ## Identificação - *Candida albicans* pode ser rapidamente diferenciada das outras espécies pela produção de: - Tubos germinativos - Clamidósporos (meio Corn-Meal-Agar) - Identificação bioquímica - Análise genotípica (diferenciação de espécies crípticas e identificação de espécies raras) ## Prova da Blastese - Tubos germinativos- crescimento no soro até 3h/37ºC, observam-se numa preparação a fresco. ## Prova da Blastese ## Clamidosporulação - Clamidósporos - pomme carotte bilis - Crescimento no meio CMA PCB 24h/28°C, observação microscópica a fresco. ## Observação de Clamidósporos ## Atividade bioquímica - Os resultados da fermentação (metabolismo anaeróbio) e a assimilação (metabolismo aeróbio) de diferentes carbohidratos, são utilizados na identificação das diferentes espécies de *Candida*. ## Identificação bioquímica ## Género *Cryptococcus* (cápsula - tinta da china) - *C. neoformans* - *C. gattii* ## Género *Cryptococcus* - Aspeto macroscópico - Colónias: brancas a ocre, cremosas, mucosas - Aspeto microscópico - Forma redonda ou oval - Cápsula - Gemulação multilateral - Caracteres fisiológicos - Urease + 4h *C. neoformans* - 24h outras espécies - Fermentação de açúcares - Assimilação alguns açúcares - Inositol sempre assimilado - Actidiona S ## Características micológicas - Exame Direto - Exame Cultural - Exame Histopatológico - Hematoxilina e Eosina - Ácido Periódico de Schiff ## Exame Cultural - A sementeira de produto biológico em meio de Sabouraud dará origem, após 48h/30-35ºC, a colónias brancas amareladas e de aspecto mucoso. - Produz fendoxidase, detetada pela formação de colónias castanhas, (devidas à presença de melanina) em meios gelosados, adicionados de extrato de sementes para canários. ## Género *Rhodotorula* - Aspeto macroscópico - Colónias: rosas, cremosas, mucosas - Aspeto microscópico - Forma redonda ou oval - Gemulação unipolar - Caracteres fisiológicos - Fermentação- - Assimilação do inositol - - São leveduras que formam colónias salmão, crescem à temperatura ambiente, mas não a 37ºC, e apresentam uma grande afinidade para os plásticos. ## Género *Malassezia* - *M. furfur* - *M. pachydermatis* ## Género *Malassezia* - Leveduras lipofílicas - Pequeno tamanho - Gemulação unipolar base larga - Temperatura ótima crescimento 35ºC ## Meio de Dixon - Le milieu de Dixon est un milieu de culture spécialisé utilisé principalement pour l'isolement et la culture de levures lipophiles, ## Género *Malassezia* ### Exame Direto - Amostra de pele retiradas de doentes com pitiríase versicolor; - cora rapidamente em KOH 10%, glicerol e solução de tinta da china - Mostra agrupamentos característicos “boquet de flores", a gemulação de células leveduriformes e hifas curtas formas angulares até 8μm de diâmetro (média mm de diâmetro). - Estas características microscópicas fazem o diagnóstico de *Malassezia furfur* e o exame cultural geralmente não é necessário. ## Diagnóstico micológico - Exame direto das escamas superficiais da pele (técnica da fita cola). observação de "bouquets" de formas arredondadas, - Exame a fresco (KOH) escama cutânea ## Descrição micológica - Leveduras lipofílicas (crescem no meio de Dixon- meio suplementado com azeite) - Leveduras de pequeno tamanho e reproduzem-se por gemulação unipolar - Temperatura ótima de crescimento 35°C ## Género *Trichosporon* - Aspeto macroscópica - Colónias: brancas ou amarelas, pregueadas ou cerebriformes - Aspeto microscópico - Forma variada pseudomicélio, artrósporos, blastosporos - Caracteres fisiológicos - Fermentação açúcares- - Urease +/- ## Género *Magnusiomyces* (ex. *Geotrichum*) - Aspeto macroscópico - Colónias brancas, aveludadas e pulverulentas - Aspeto microscópico - Artrósporos, pseudomicélio- e blastósporo - Caracteres fisiológicos - Urease- - Assimilações reduzidas ## *Magnusiomyces candidum* - Identificação: bioquímica, proteómica, genómica ## Critérios para a identificação de leveduras - Caracteres macroscópicos das colónias - Caracteres microscópicos - Características fisiológicas (essenciais para a determinação da espécie) ## Orientação do diagnóstico através da cultura em meio sabouraud ## Características macroscópicas das colónias - Em meios gelosados - Aspeto - Cor - Textura (superfície) - Forma - Em meios líquidos - Anel, véu, depósito ## Características microscópicas - Forma - Tamanho - Modo de agrupamento - Modo de reprodução - Presença de cápsula - Presença de filamentos (pseudomicélio e micélio verdadeiro) - Presença de clamidósporos ## Caracteres morfológicos ### *Candida* - Culturas cremosas leveduriformes que se desenvolvem em 24-48h Observação microscópica: elementos leveduriformes ### *Cryptococcus* - Culturas cremosas leveduriformes. Colónias de aspeto mucoso ou liso, pigmentadas de ocre ao fim de uma semana. - Culturas não filamentosas envolvidas por uma cápsula visível após preparação com tinta da china. ## Caracteres morfológicos ### *Geotrichum* - Colónias cremosas filamentosas. - Filamentos fragmentados em artrósporos retangulares que se tornam ovais. ### *Trichosporon* - Colónias cremosas filamentosas - Observação microscópica: filamentos, artrósporos e blastóporos. ### *Rhodotorula* - Colónias cremosas, de cor rosa - Observação microscópica: elementos leveduriformes. ## Características fisiológicas (essenciais para a determinação da espécie) - Auxonograma - Zimograma - Assimilação dos nitratos - Produção de enzimas ## Caracteres fisiológicos das leveduras - O conhecimento dos caracteres fisiológicos do fungo a estudar é responsável para a determinação da espécie no caso das leveduras. - A determinação de todas as espécies de leveduras de interesse médico é feito através de testes bioquímicos e moleculares. - API *Candida* - API 20C - API 20Caux - Fungiscreen - MALDI-TOF MS ## Características mais importantes de alguns fungos patogénicos oportunistas nas amostras biológicas e culturas |Fungo|Micromorfologia nas amostras biológicas|Macroscópicas|Microscópicas|Testes adicionais para identificação| |---|---|---|---|---| |*Candida spp*| Leveduras ovaladas, de 2-6 µm de diâmetro, em gemulação; Pode também observar-se pseudomicélio e micélio verdadeiro|Colónias de morfologia variável. Geralmente cremosas, brancas a beges, opacas, lisas a rugosas. Algumas têm bordos franjados devido à formação de pseudomicélio e/ou micélio|Grupos de blastósporos. A maioria das espécies produz pseudomicélio e/ou micélio verdadeiro e algumas clamídosporos (*C. dubliniensis*)|Produção de tubo Morfologia em meios de milho; Cor da colónia em cromogénio ; Estudo da assimilação dos hidratos de carbono| |*Cryptococcus neoformans*|Leveduras redondas, 3-15 µm de diâmetro. Podem ter cápsula|Colónias cremosas ou mucosas (cápsula +), brilhantes e de cor a castanho creme|Células esféricas de diâmetro variável. Na presença de cápsula, pode observar-se o seu halo transparente (pesquisa com tinta da China)|Testes da urease fenoloxidase (+) e nitrato redutase (-). Deteção de antigénios polissacáridos capsular por EIA. Estudo da assimilação dos hidratos de carbono| |*Trichosporon sp.*|Artrósporos hialinos, blastósporos, pseudofilamentos e filamentos verdadeiros|Colónias remosas e lisas, secas e rugosas ou cerebriformes|Artrósporos, blastósporos, pseudomicélio e micélio verdadeiro|Estudo da assimilação dos hidratos de carbono| ## Antifungigrama - Métodos de diluição e difusão ## Procedimento experimental - E-test ## Método de difusão-e test ### Protocolo experimental (meio de cultura, concentração do inóculo, metodologia de inoculação) ## Resultados ## Antifungigrama em meio líquido (galeria ATB Fungus 3®) 1. Placa de ATB Fungos 3; - Com uma micropipeta, 20 µL da suspensão leveduriforme para a solução específica deste teste (suspensão de ATB Fungos); 2. Misturar bem a suspensão com a ponta da micropipeta; 3. Com uma micropipeta de 1000 µL, encher todos as cúpulas com a suspensão ATB Fungos; 4. Incubar 24h a 37°C. - Meio de Cultura: RPMI (ou Mueller-Hinton adicionado de 2% de glucose) - Concentração do inóculo: 0,5-2,5x105 - Metodologia de Inoculação: espalhamento - Fazer uma suspensão 0,5 McFar. - c'est la dilution du flacon mais nous quand on met la bactérie on veut atteindre une densité de 3