Técnicas de Separación PDF

LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN 1. Las técnicas de separación Las muestras biológicas son mezclas heterogéneas de moléculas de diversa naturaleza: Ácidos nucleicos Proteínas Lípidos Azúcares, etc. Sus componentes deben aislarse para obtener los distintos tipos de moléculas a anal...

LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN 1. Las técnicas de separación Las muestras biológicas son mezclas heterogéneas de moléculas de diversa naturaleza: Ácidos nucleicos Proteínas Lípidos Azúcares, etc. Sus componentes deben aislarse para obtener los distintos tipos de moléculas a analizar. En el laboratorio se someten las muestras a métodos analíticos con el objetivo de estudiar: Si uno o varios de sus componentes (analitos) están o no presentes. Si lo están, en qué concentración. Las técnicas de separación permiten obtener separadamente todos o algunos de los componentes de una mezcla. → Aplicaciones de las técnicas de separación: Purificar la muestra, separar las impurezas. Obtener alguna de las sustancias presentes en la muestra para su posterior estudio. Identificar la presencia de una sustancia en la mezcla (análisis cualitativo). Cuantificar la concentración de una sustancia en la mezcla (análisis cuantitativo). → La separación se basa en identificar una propiedad cuyo valor sea significativamente distinto en la sustancia que vamos a separar de lo que sería en otras: Tamaño de la partícula. Solubilidad en un disolvente. Densidad. Diferencia de movilidad en un campo eléctrico, etc. → Clasificación de las técnicas de separación segundo la propiedad en que se basan: Propiedades físicas: densidad, tamaño y forma de las partículas, etc. ◦ Filtración, decantación y centrifugación. Solubilidad: ◦ Extracción con disolventes, cromatografía y otras. Propiedades electroquímicas: diferencia de movilidad de las moléculas en un campo eléctrico. ◦ Electroforesis. → Clasificación de las técnicas de separación segundo la cantidad de la muestra: Técnicas que se aplican a toda la muestra (ej.: filtración para purificación). Técnicas que se aplican a una alícuota (ej.: electroforesis). → Clasificación de las técnicas de separación segundo la fase analítica: Técnicas para preparar la muestra en la fase preanalítica (ej.: purificación de una muestra líquida o centrifugación de la sangre). Técnicas que se aplican en la fase analítica y proporcionan resultados que se reflejan en el informe (ej.: electroforesis). 2. Separación a partir de propiedades físicas (filtración, decantación, centrifugación, otras) Separación segundo el tamaño de las partículas: Filtración. Separación segundo la densidad de las partículas: Decantación y Centrifugación. Separación segundo el punto de ebullición: Evaporación y vaporización. Y Destilación. Filtración La filtración o clarificación de líquidos es un método mecánico de separación de suspensiones en función del tamaño de las partículas. Se hace pasar la suspensión a través de un medio poroso, de un filtro, y se obtiene: ◦ El filtrado: fluído que atravesó el filtro. ◦ La torta o residuo: partículas sólidas retenidas en el filtro. Fuerza impulsora del movimiento: ◦ Gravedad ◦ También la presión o aspiración mediante vacío. Fuerzas contrarias al avance: ◦ Tamaño de los poros. ◦ Superficie de filtración. ◦ Número de partículas en disolución. ◦ Viscosidad Aplicaciones de la filtración: ◦ Concentración de disoluciones de macromoléculas al eliminar parte del disolvente. ◦ Eliminar sales y otros solutos de pequeño tamaño. ◦ Realizar filtraciones esterilizantes. ◦ Ultrafiltración: filtros con tamaño de poro tan reducido como para separar macromoléculas como las proteínas. Los filtros: ◦ Son dispositivos de material poroso que permiten el paso del líquido y retienen las partículas cuyo diámetro es superior al del poro del filtro. ◦ Filtro colmatado: cuando ya hay muchas partículas retenidas en el filtro y se debe sustituir. ◦ Tipos de filtros: ▪ De papel: liso o de pliegos. Pueden tener diversas formas y tamaños y distintos tamaños de poro. Filtro liso: cuando interesa conservar el sólido retenido. Filtro de pliegos: cuando interesa conservar el líquido filtrado. Son más rápidos, ya que tienen más superficie. Filtro redondo: discos para filtración al vacío con embudo Büchner. Se usan con un embudo. A veces, puede ceder fibras del papel al filtrado. ▪ De membrana: Para filtraciones esterilizantes. Compuestos de acetato o nitrato de celulosa, o polímeros de polivinilo. Forma de disco con diferentes tamaños de poro. ◦ Microfiltración: poros de 0,1-10μm. ▪ Sólidos, moléculas de gran tamaño, bacterias.  ◦ Ultrafiltración: poros de 50-1000Å. ▪ Macromoléculas (proteínas, hemoglobina, etc.) ◦ Nanofiltración: filtros de 2-50Å. ▪ Moléculas de pequeño tamaño, iones. ▪ De vidrio molido o placas filtrantes: Placas constituídas por polvo de vidrio molido, tamizado y aglomerado. Van montadas en un crisol o embudo filtrante. También pueden ser de porcelana. Gran resistencia química. El diámetro de los poros oscila entre 2 y 200μm. Limpieza después de cada uso: ◦ Poros grandes: hacer pasar por la placa agua o el disolvente en el que se filtró en sentido contrario. ◦ Poros pequeños: sumergir la placa en disolventes adecuados o bañarla en ácido sulfúrico caliente. ◦ Filtración por gravedad: Con filtros de papel. El filtro tiene que quedar bien ajustado y un poco por debajo del borde superior del embudo. Nunca llenar el filtro más que hasta unos 6 mm del extremo del papel. El extremo del vástago del embudo debe permanecer, durante toda la filtración, por encima del nivel del líquido filtrado. ◦ Filtración al vacío o por succión: Más rápida. Cuando interesa recuperar el sólido. Se coloca un filtro de papel redondo en el embudo Büchner. Se humedece con el disolvente para que quede adherido. Se acopla al embudo un matraz Kitasato. Se acopla un tubo de goma a la tubuladura lateral del matraz y se conecta a una bomba de vacío. Al final se puede lavar el sólido con agua u otro disolvente. ◦ Filtración esterilizante: Esterilización para eliminar los microorganismos de líquidos sensibles al calor (termolábiles) que no pueden esterilizarse en autoclave. Se hace pasar el líquido por filtros de membrana con poros suficientemente pequeños para que pase el líquido pero no los microorganismos. Antes de filtrar, hay que esterilizar el filtro y los demás utensilios empleados. La filtración puede hacerse con una jeringuilla o una bomba de vacío. Estos filtros se colmatan (se atascan) fácilmente y solo sirven para filtrar suspensiones muy diluídas. Es conveniente efectuar previamente una filtración de la suspensión con otro tipo de filtro para retirar las partículas de mayor tamaño.  Decantación, (clarificación o sedimentación) es un método mecánico de separación de mezclas heterogéneas sólido-líquido (suspensiones) o líquido-líquido (emulsiones) en función de la densidad de los componentes, gracias a la acción de la gravedad. Es menos eficaz que la filtración o que la centrifugación, por lo que suele usarse como método preparativo previamente. Cada fase tiene su propia densidad. Al dejar la mezcla en reposo: El componente de mayor densidad se depositará en el fondo. El componente de menor densidad quedará en la superficie. Entre ambas fases queda una línea de separación o interfase. ◦ Decantación de suspensiones: se puede llevar a cabo simplemente dejándolas en reposo el tiempo suficiente. Una vez que el sólido sedimenta en el fondo, recuperamos con mucho cuidado el líquido, usando una pipeta Pasteur, y lo vertemos en otro recipiente. ◦ Decantación de emulsiones: los dos líquidos deben ser inmiscibles, por ejemplo, agua y aceite. Se usa un embudo de decantación. Se dejan en reposo hasta que se separan en 2 fases. El más denso queda en la parte inferior. Para extraer el componente más denso se abre la llave del embudo. A continuación, se puede extraer el componente menos denso. Centrifugación: es un método mecánico de separación de mezclas heterogéneas sólido-líquido (suspensiones) o líquido-líquido (emulsiones) en función de la densidad de los componenten, gracias a la acción de la fuerza centrífuga. Es una técnica más rápida y efectiva, ya que se acelera la sedimentación al someter a la mezcla a una rápida rotación. El coeficiente de sedimentación se calcula dividiendo la velocidad de sedimentación de una partícula (en m/s) por la aceleración aplicada (en m/s2). El resultado tiene unidades de tiempo (s) y se expresa habitualmente en svedbergs (S). La velocidad de sedimentación es proporcional a la masa de la partícula, también afectan a su forma y tamaño. La centrífuga: equipo que consta de un rotor que gira alrededor de un eje central mediante un motor eléctrico. Tiene unos huecos en donde se colocan los tubos con la mezcla a separar. El rotor gira a una velocidad o revoluciones por minuto (rpm). La fuerza ejercida sobre las partículas es la fuerza centrífuga relativa (FCR). K: 1,118x10-5 (constante) r: radio entre el eje de la centríguga y el centro del tubo (en cm). Xg: n.º de veces la fuerza de la gravedad (981 cm/s2). Podemos calcular la velocidad de rotación (rpm) que se necesita para separar componentes de una muestra en diferentes centrífugas, conociendo la FCR y el radio de giro. Esta ecuación es útil para hacer conversión entre RPM y FCR. En ocasiones, se realiza protocolos que incluyen la FCR que debe aplicarse para hacer la separación en la centrífuga (Ej. 1500g) y a la centrífuga que tenemos en el laboratorio hay que darle el dato en rpm, o viceversa. En estos casos es útil conocer la ecuación. Existen nomogramas que facilitan el cálculo. Controles de la centrífuga: - el tiempo de centrigugación. - la velocidad de giro: entre 3000 y 50000 rpm. - la temperatura, si algún de los componentes es termolábil (centrífugas refrigeradas). En una centrifugación estándar, se produce la separación de mezcla en dos fracciones: ◦ Precipitado o pellet: componente de mayor densidad que sedimenta. ◦ Sobrenadante: componente de menor densidad. Podemos aprovechar el sobrenadante (decantándolo o recogiéndolo con una pipeta Pasteur), el pellet (tras separar el sobrenadante), o ambos. Tipos de centrífugas según la velocidad de centrifugación: ▪ Centrífugas de baja velocidad o de sobremesa: de pequeño tamaño velocidades entre 4000-15000 rpm no suelen tener sistema de refrigeración se usan para la separación de suspensiones con partículas grandes. ▪ Centrífugas de alta velocidad: velocidades entre 18000-25000 rpm están refrigeradas algunas cuentan con sistemas de vacío para muestras que se alteran en contacto con el oxígeno se usan para separar suspensiones de partículas muy pequeñas, por ejemplo, fracciones celulares en biología molecular. ▪ Ultracentrífugas: velocidades mayores de 50000 rpm están refrigeradas tienen sistemas de alto vacío permiten separar y estudiar subcelulares (lisosomas, ribosomas y mitocondrias). Tipos de centrífugas según el tipo de rotor: ▪ Angular o de ángulo fijo: los tubos se colocan en un ángulo fijo para volúmenes grandes de muestra el sedimento queda en el fondo y lateral del tubo ▪ ▪  ▪ Flotante, basculante u oscilante: el rotor, al comenzar a girar, coloca los tubos en una posición de 90º con el eje para volúmenes pequeños de muestra el sedimento queda en el fondo del tubo. ▪ Vertical: el rotor es un cilindro en el que se colocan los tubos en vertical para volúmenes grandes y centrifugaciones rápidas. ◦ Tipos de centrífugas según su función: ▪ Microcentrífugas: son de pequeño tamaño (para tubos Eppendorf), pero alcanzan velocidades altas algunos modelos tienen sistemas de refrigeración se usan en técnicas de biología molecular. ▪ Citocentrífugas: se usan para acelerar la sedimentación de células sobre un portaobjetos se obtiene una muestra concentrada del líquido en estudio (orinas, LCR, líquido sinovial, etc.)  ▪ Microhematocrito: para centrifugar la alta velocidad de un capilar con sangre total y obtener el hematocrito sanguíneo están en desuso. ▪ Centrífugas de microplacas: para microplacas de PCR, ELISA, … útiles para eliminar rápidamente las gotas de las paredes y mejorar los resultados experimentales suelen tener sistemas de refrigeración. Tipos de centrifugación: ▪ Analítica: medir las propiedades físicas de las partículas que sedimentan, tales como su coeficiente de sedimentación o su masa molecular. Aplicaciones: averiguar la pureza de un compuesto determinar la proporción relativa de sus componentes conocer e interpretar las estructuras moleculares de diferentes compuestos. Se parte de un volúmen pequeño de una mezcla lo más pura posible. Se hace ultracentrifugación. Durante la centrifugación se observan las moléculas mediante un sistema óptico. Los tubos de centrífuga deben ser de cuarzo. ▪ Preparativa: separación de los componentes de una mezcla. Se trabaja con grandes volúmenes. Aplicaciones: preparar o acelerar la muestra para su posterior análisis. Tipos: Centrifugación preparativa diferencial Es la técnica más común. Se usa para la sedimentación de células en sangre y en orinas. Procedimiento: ◦ Se centrifuga la muestra a velocidad baja y se recoge el sobrenadante. ◦ Se centrifuga el sobrenadante obtenido a velocidad media y se recoge el sobrenadante. ◦ Se centrifuga este nuevo sobrenadante a velocidad alta. Se hacen 3 centrifugaciones sucesivas obteniendo: ◦ 1 sobrenadante ◦ 3 precipitados o pellets con distintas densidades que, por lo tanto, corresponden a sustancias distintas.  Centrifugación preparativa en gradiente de densidad: La muestra se deposita en un fluído con un gradiente de densidad, el cual hace que, al centrifugar, las partículas se distribuyan en fracciones de diferentes densidades dentro del fluído. La técnica permite la separación de varios componentes de la muestra o de todos ellos, y la realización de medidas analíticas. El método implica la utilización de un soporte fluído cuya densidad aumente de arriba a abajo, es decir, con un gradiente de concentración. Como solutos se utilizan: ◦ la sacarosa ◦ polisacáridos sintéticos como el Ficoll y el Percoll ◦ sales de metales alcalinos pesados como cloruro de cesio. La muestra se deposita en la parte superior como una fina banda. Se utilizan rotores basculantes. Tras centrifugar, los componentes de la muestra se presentan como diferentes bandas que pueden ser: ◦ separados con una pipeta ◦ o haciendo una punción en el fondo del tubo y recogiendo las fracciones. Tipos de gradiente: ◦ Preformado: se prepara antes de centrifugar. Hay: ▪ Discontinuo o escalonado: se depositan capas sucesivas de disolución, con concentraciones decrecientes. Por ejemplo, disoluciones al 25%, 20%, 15%, 10% y 5% de sacarosa. ▪ Continuo: se preparan dos disoluciones con distintas concentraciones, por ejemplo, una al 5% y otra al 30%, y se colocan en un dispositivo formador de gradientes. Se obtiene un fluído con un gradiente continuo de concentración, de la más alta a la más baja. ◦ Autoformado: Se prepara la disolución y el gradiente se crea mediante centrifugación. Al mismo tiempo que se separan los componentes de la muestra, se va formando el gradiente del fluído, que será un gradiente continuo. Es el más frecuente. Requiere velocidades muy altas (ultracentrifugación).  Variantes de centrifugación en gradiente: ◦ Centrifugación zonal: Gradiente preformado, continuo o discontinuo, cuya densidad máxima es menor que la del componente de mayor densidad de la muestra. La muestra se deposita en la parte superior del gradiente y se centrifuga. La centrifugación se debe detener antes de alcanzar el equilibrio para evitar que las partículas más densas lleguen al fondo del tubo, porque entonces se podrían mezclar varias bandas. Las partículas sedimentan en zonas o bandas discretas. Los componentes separados se recogen individualmente aspirando con mucho cuidado las diferentes bandas o, mejor, perforando el fondo del tubo y recogiendo en fracciones el líquido que cae. ◦ Centrifugación isopícnica: Se utiliza en gradiente continuo de densidad, cuya densidad máxima es mayor que la de el componente de mayor densidad de la muestra. Las partículas, células, etc. nunca sedimentan en el fondo del tubo, alcanzan una posición estable en el gradiente y se concentran en una banda muy estrecha donde la densidad del medio es igual a la suya. El tiempo de centrifugación es largo, de hasta 1 o 2 días. Aplicaciones de la centrifugación: La centrifugación es un método básico para separar sustancias sólidas en suspensión en un medio líquido: células y sedimento de orinas, sangre o líquidos orgánicos (cefalorraquídeo, pleural, etc.). ◦ Obtención de leucocitos libres del resto de células sanguíneas a partir de sangre circulante: ▪ centrifugación por gradiente de densidad zonal en la que se emplean medios comerciales formados por mezclas de Ficoll. Es un método rápido. ◦ Fraccionamiento subcelular a partir de un homogenizado tisular: ▪ centrifugación diferencial. Se obtienen los diferentes componentes celulares: células, orgánulos, macromoléculas y otros solutos. ◦ Concentración de células en líquidos corporales como las orinas o el LCR. ◦ Extracción de biomoléculas: separación de fases para posterior extracción con disolventes orgánicos. ◦ Obtención de suero o plasma: ▪ aplicando a la sangre una FCR de 1500 g durante 10 minutos se consigue una buena separación de suero o plasma. ▪ Para separar suero se usan unos tubos con un gel de silicona en el fondo (densidad intermedia entre el suero y el coágulo). Al centrifugar el tubo, el gel facilita la conservación de las biomoléculas presentes en el sobrenadante, ya que impide que contacten con las enzimas presentes en la fracción celular. Uso de la centrífuga El manual de instrucciones debe estar siempre disponible al lado del aparato. El equipo debe estar alejado de fuentes de calor y líquidos inflamables. Las de sobremesa deben colocarse sobre una mesa bien nivelada y estable. Comprobar que todos los tubos están correctamente tapados. Equilibrar la carga. Tapar bien la centrífuga una vez colocados los tubos. La mayoría cuentan con dispositivos que desconectan el rotor en caso de apertura o que bloquean la puesta en marcha si la tapa está abierta. Seleccionar la velocidad y el tiempo. Mantenimiento de la centrífuga Desconectar el equipo de la red cuando no se vaya a usar durante un período largo. Mantenimiento preventivo, ◦ Diario, limpiar las superficies con un trapo libre de pelusa humedecido con agua jabonosa. Si se rompe algún tubo, limpiar y desinfectar el interior. ◦ Mensual, verificar el ajuste de los rotores, lubricar los puntos que recomienda el fabricante y comprobar el estado del mecanismo de cierre de la tapa. ◦ Anual, lo realizan los servicios de electromedicina. Examinan la exactitud de los controles de tiempo; verifican la velocidad de rotación real con un tacómetro o fototacómetro; confirmar el funcionamiento del sistema de freno; verificar el funcionamiento del sistema de refrigeración si lo tiene. OTRAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN ◦ Diálisis: es un tipo de filtración. Una bolsa o vaina con estructura de membrana semipermeable se llena con la muestra. Las macromoléculas presentes en la misma quedan retenidas, mientras que el líquido y las moléculas de menos tamaño atraviesan la membrana. El intercambio de material se produce por difusión y, por lo tanto, es un proceso lento. Un método para acelerarla consiste en ejercer presión sobre la muestra que se va a dializar (filtración molecular). La filtración molecular se puede utilizar para el enriquecimiento proteico de fluídos biológicos que, como las orinas o el LCR, son pobres en proteínas.  El agua, las pequeñas moléculas y los electrolitos presentes atraviesan la membrana (diámetro de poro entre 15-0,025 µm), mientras que las macromoléculas, especialmente las proteínas, al no poder atravesarla, se van concentrando. ◦ Evaporación y vaporización: Si nos interesa el residuo sólido, es el paso de un líquido al estado de vapor para conseguir el sólido. Se diferencian en: ▪ Evaporación, solo afecta a la superficie del líquido y no se calienta el recipiente que lo contiene. ▪ Vaporización o ebullición, toda la masa de líquido pasa a estado gaseoso, y se aplica calor externa. Estas operaciones se diferencian de la destilación en que en ella interesa recuperar los vapores y en estas lo que se busca es el residuo. Se usan para secar un sólido o concentrar un líquido. Utilizar recipientes poco profundos de gran superficie, como cristalizadores o vidrios de reloj. Los líquidos inflamables o tóxicos se evaporan en vitrina (cabina de gases). ◦ Destilación: Si nos interesa el componente volátil (lo que se evapora). Es una operación que permite separar y purificar sustancias líquidas que llevan impurezas disueltas. Procedimiento: se calienta la mezcla hasta la temperatura de ebullición (P.E.) del líquido que se quiere separar, se condensan sus vapores y se obtiene el líquido puro. Tipos: ▪ Destilación simple: se realiza en una sola etapa. Se usa cuando se quiere separar el único componente volátil de una mezcla o, excepcionalmente, para separar dos líquidos volátiles cuyos P.E. están separados unos 80-100ºC. Se introduce la mezcla líquida en un matraz de fondo redondo y se añaden unos trozos de plato poroso. Se cierra el matraz con un tapón en el que se encaja un termómetro. Esa pieza de vidrio esmerilado se une al tubo de refrigerante por lo que circula agua y, al final del serpentín se coloca el tubo colector. Se comienza a calentar y, cuando la temperatura alcanza el PE del líquido, los vapores de este ascienden y pasan al tubo del refrigerante, donde se condensan. Finalmente, son recogidos. La destilación tiene que ser continua y lenta, de forma que caiga al colector una gota cada segundo, aproximadamente.  ▪ Destilación al vacío: Similar a la simple, pero se conecta al conjunto una bomba de vacío. Permite destilar líquidos a temperatras más bajas, ya que la presión es menor a la atmosférica. Se evita la descomposición térmica del destilado. ▪ Destilación fraccionada o por rectificación: Para separar líquidos cuyos PE difieren en 25ºC o menos (Ej.: agua y etanol). Se intercala en el montaje una columna (de Vigreux o de “relleno”), de forma que la mezcla vapor se enriquece en el componente más volátil y los líquidos en el matraz, del menos volátil. Tras varias destilaciones sucesivas, se podrían separar ambos líquidos. ▪ Destilación por arrastre con vapor: Se inyecta el vapor de agua a la mezcla (“vapor de arrastre”), con el que se vaporizan el componente volátil y otros no volátiles. 3. Separación a partir de la solubilidad Extracción con disolventes: consiste en separar uno de los componentes de una mezcla mediante el empleo de un disolvente adecuado. En la elección del disolvente hay que considerar: ◦ La solubilidad en el de la sustancia a separar. ◦ La solubilidad de las demás sustancias de la mezcla. ◦ La facilidad con la que puede separarse después. ◦ La peligrosidad. ◦ El precio. Extracción sólido-líquido: es la separación de un componente de una muestra sólida con un disolvente en el que los demás componentes de la muestra son insolubles. Se puede hacer de dos formas: ◦ A temperatura ambiente: Pulverizar la muestra y ponerla en contacto con el disolvente durante algún tiempo,  agitando periódicamente. Cuando el disolvente se satura, se separa por filtración y se vuelve a añadir a la muestra disolvente nuevo. Esta operación se repite hasta que la extracción sea completa. ◦ A reflujo: Se calienta la muestra con el disolvente hasta que este se satura. Se sustituye por disolvente nuevo y se repite la operación hasta que se completa la extracción. Este sistema es más rápido. La desventaja de estos procesos de extracción es que son muy lentos, por lo que fue necesario idear procedimientos que reduciesen el tiempo sin perder eficacia. Esto se logró con el extractor de Soxhlet. El extractor de Soxhlet consta de 3 partes: ◦ Inferior, en la que hay un matraz de fondo redondo y se coloca el disolvente y un trozo de plato poroso (evitar sobrecalentamientos). ◦ Media, con un recipiente donde se pone el sólido a extraer (previamente triturado) y que está comunicado con el matraz por 2 tubos, uno comunica el matraz con la parte superior y otro más estrecho, en forma de sifón. ◦ Serpentín, que contiene un refrigerante que condensa los vapores del disolvente. El extractor funciona de la siguiente manera: Comienza a calentar el matraz y los vapores del disolvente ascienden hasta el serpentín, donde se condensan y caen gota a gota sobre el sólido. Cuando el disolvente saturado de la sustancia a extraer alcanza un nivel en el recipiente, cae por el sifón y vuelve al matraz inferior. Se repite el ciclo hasta que concluye la extracción. Extracción líquido-líquido: es la separación de una sustancia con un disolvente no miscible con el disolvente en el que está inicialmente disuelta. Normalmente, la disolución que contiene la sustancia, es acuosa, y el disolvente con el que se extrae, es orgánico. La extracción consta de tres fases: ◦ Contacto de la sustancia a extraer con el disolvente. ◦ Separación de las fases formadas. ◦ Recuperación del disolvente.  Tipos: ◦ Extracción simple: queremos separar una sustancia A que está disuelta en agua y que es mucho más soluble en B, siendo el agua y B inmiscibles. Se lleva a cabo en un embudo de decantación. ◦ Extracción continua: la sustancia a extraer es mucho más soluble en el agua que en el disolvente orgánico empleado para la extracción. El montaje es distinto segundo si el disolvente de extracción es más o menos denso que el agua. Para evitar utilizar grandes volúmenes del disolvente de extracción, el proceso se hace en un sistema cerrado. El disolvente de extracción se calienta en un matraz y los vapores del disolvente se hacen condensar en un refrigerante colocado sobre un tubo o cámara de extracción que contiene la disolución acuosa a extraer. El disolvente condensado caliente se hace pasar a través de la disolución acuosa, para llegar finalmente, con parte del producto extraído, al matraz inicial, donde el disolvente orgánico se vuelve a vaporizar. Se repite un nuevo ciclo de extracción mientras que el producto extraído, no volátil, se va concentrando en el matraz. Las técnicas de extracción con disolventes se utilizan para la obtención de macromoléculas. → Extracción de lípidos: por el procedimiento de Folch que utiliza una mezcla de cloroformo y metanol. Los lípidos se disuelven en el cloroformo, después se elimina el cloroformo por evaporación y se recuperan los lípidos. → Extracción de ácidos nucleicos: Por ejemplo, la extracción de ADN genómico a partir de sangre periférica. Añadimos una solución de lisis que degrada las proteínas y el ARN. Centrifugamos y retiramos el precipitado. Obtenemos una fase acuosa donde está presente el ADN genómico. Añadimos etanol y el ADN precipita. Centrifugamos y obtenemos el sedimento → ADN puro. → Extracción de glúcidos: mediante diferentes técnicas que logran eliminar las proteínas, ácidos nucleicos y lípidos presentes. La mayoría de ellas terminan en una cromatografía. → Extracción de proteínas: mediante técnicas de centrifugación para separar las proteínas solubles de las unidas a membranas. Después se aplican métodos como la precipitación salina. Cromatografía: Conjunto de métodos analíticos utilizados para separar, identificar y cuantificar los componentes de una muestra. Mediante una cromatografía es posible separar analitos muy parecidos entre sí en cuanto a sus propiedades físico-químicas. Por ejemplo nos permite separar mezclas de aminoácidos; mezclas de proteínas; mezclas de ácidos grasos; pigmentos; pesticidas; etc. ¿Por qué cromatografía? La primera vez que se utilizó el método fue para separar pigmentos vegetales a partir de un extracto de hojas y el resultado obtenido fue una serie de bandas coloreadas (verdes y amarillas correspondientes a clorofilas y carotenoides) por lo que se denominó al método de separación CROMATOGRAFÍA, término que deriva del griego “cbromatos” que significa color (1903, Tswett). Técnica de separación de mezclas de solutos de una muestra en un solvente (líquido o gas) llamado fase móvil (FM), en función de su distinta afinidad por una fase estacionaria (FE) (sólida o líquida) que se mantiene fija en un soporte y que es el hecho a través del cual va a fluír la FM. → Fase estacionaria (FE): será un componente que estará contenido en un soporte adecuado y como su nombre indica permanecerá fija en un espacio determinado. Puede ser sólida o líquida. Segundo que tipo de soporte se emplee para contener a la fase estacionaria las cromatografías pueden ser planas o en columna. → Fase móvil (FM): será un compuesto químico, o una mezcla sencilla de compuestos químicos y como su nombre indica debe fluír (moverse) a través de la fase estacionaria. La fase móvil es la que arrastrará a la muestra obligándola a atravesar la fase estacionaria. Puede ser líquida o gaseosa. La FE está inmovilizada en un soporte y la FM arrastrará la muestra a través de la FE. Cada componente de la muestra se va a desplazar segundo sus propias características físico- químicas, las que van a determinar que interaccionen más con la FE o que prefiera a la FM. Las dos fases (FM y FE) se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de forma distinta entre ambas. Los componentes más retenidos por la FE se desplazan más lentamente con el flujo de la FM. Las sustancias que componen la muestra se separan, segundo su distinta movilidad, en una serie de bandas que pueden ser analizadas cualitativa y cuantitativamente. Clasificación de las cromatografías: ◦ Segundo el tipo de contacto entre la FM y la FE: ▪ Plana, en papel o en capa fina: Puede ser cromatografía en papel o en capa fina. La cromatografía en papel utiliza un papel de celulosa como FE. La cromatografía de capa fina usa alúmina o gel de sílice como su FE. Dependiendo de la disposición experimental la cromatografía puede ser ascendiente o descendiente. Por ejemplo: cromatografía ascendiente en capa fina :  Cromatografía descendente: la FM arrastra la muestra de arriba abajo por acción de la gravedad principalmente. Cromatografía ascendente: la FM arrastra la muestra recorriendo la fase estacionaria desde abajo hacia arriba por capilaridad. Fases de una cromatografía plana: 1. Siembra de la muestra: consiste en colocar una pequeñas cantidad de muestra a analizar en uno de los extremos del soporte de la FE. 2. Desenvolvimiento del cromatograma: la FM recorre la FE “empujando” a la muestra, cada analito se desplaza a una velocidad diferente. Esta etapa finaliza cuando la FM llegue cerca de otro extremo del soporte. 3. Si los analitos tienen color (por ej. los pigmentos vegetales), se puede observar a simple vista la separación de los mismos sobre la FE. Si los analitos no tienen color al finalizar el desenvolvimiento no poderemos ver la separación, es necesario realizar una etapa de REVELADO para poner en evidencia donde quedó cada analito separado. 4. Cálculo de Rf (Relación de frentes): realizar las medidas correspondientes para calcular los valores de Rf de cada analito.  El parámetro que se mide en una cromatografía plana se denomina relación de frentes, Rf, y representa la distancia que recorre un analito sobre la FE respecto a la distancia que recorre la FM en la cromatografía. RfA= distancia recorrida por el analito A / distancia recorrida por la FM. Este parámetro puede tomar valores entre 0 y 1. → Cuanto más próximo a 0 es el valor de Rf, significa que el analito tienen afinidad por la FE (es muy retenido). → Cuanto más próximo es a 1 significa que el analito tiene más afinidad por la FM, por lo tanto, es poco retenido por la FE. ▪ En columna: Las cromatografías en columna se caracterizan por tener una FE que se encuentra dentro de una columna de vidrio por la que se hace pasar una FM líquida o gaseosa que está en permanente movimiento. Segundo la afinidad de las moléculas por la FM o por la FE estas se separan. Fases de una cromatografía en columna: 1. Inyección de la muestra. 2. Desenvolvimiento de la cromatografía: la FM empuja a los analitos obligándolos a atravesar la FE contenida en la columna. Durante este proceso los analitos se separan dentro de la columna. 3. Elución: se hace circular FM hasta que los analitos se recuperen a la salida de la columna. Por este motivo muchas veces se nombra a la FM como “eluyente”. 4. Se mide el tiempo de retención: tR.  Cromatograma: Diagrama donde se representan los resultados de la separación de una mezcla mediante técnicas cromatográficas. En el eje de ordenadas (eje Y) se representa el valor medido de alguna propiedad física a partir del cual se detectó la presencia de una sustancia, o bien una unidad relativa que la cuantifica (igualmente, basada en la medición de alguna propiedad). En el eje de abcisas (eje X) se representa el tiempo. En el cromatograma se mide el tiempo que tardará en salir del sistema la FM (tiempo muerto) y el tiempo efectivo que es retenido cada componente (tiempo de retención). ◦ Segundo el estado físico de las fases: ▪ Líquidos: HPLC (Cromatografía líquida de alta eficacia o alta resolución): Cromatografía de reparto L-L, intercambio iónico y filtración en gel (exclusión molecular). Se realiza en columnas de acero inoxidable y se llena de un soporte sólido (gel de sílice, alúmina, etc.) sobre el que se deposita una fina capa de disolvente que actúa como FE (hexano, éter, etc.). Cuentan con un sistema de inyección de la muestra y una bomba para la FM. ▪ Gases: gas-líquidos o gas-sólido: Cromatografía de reparto G-L. La columna está rellena de un soporte sólido poroso finalmente dividido (Ej.: tierra de diatomeas). La FE es un líquido no volátil que impregna el soporte (siliconas líquidas, aceites de parafina…). La FM es un gas inerte (nitrógeno, argón, helio), que fluye por la columna a una velocidad constante. Los compuestos a separar tienen que volatilizarse sin descomponerse.  ▪ Fluidos supercríticos. ◦ Segundo la interacción de las moléculas con la FE: ▪ De adsorción: Puede ser L-S o G-S (FE sólida). La adsorción es un fenómeno de superficie que consiste en la retención de una sustancia en la superficie de un sólido. La separación se basa en las interacciones químicas que se producen entre las moléculas de soluto disueltas en la FM y el adsorbente (FE: gel de sílice, carbón vegetal, etc.): electroestáticas, puentes H, fuerzas de van der Waals, etc. Las sustancias con mayor afinidad por el adsorbente se desplazarán a menor velocidad. Puede hacerse en capa fina o en columna. ▪ De reparto o partición: Puede ser L-L o G-L (FE líquida). Se basa en las diferencias de solubilidad de los solutos de la muestra entre una FM (L o G) y una FE (soporte de papel, gel de sílice, etc., recubierto por un líquido como el agua) inmiscibles. Se puede hacer en papel o en columna. La distribución de los solutos entre las dos fases se expresa por el “coeficiente de distribución” (Kd) → relación entre la cantidad de soluto retenido por la FE entre el arrastrado por la FM. El valor de Kd es indicativo de la afinidad del soluto por las distintas fases. A mayor Kd mayor proporción de soluto es retenido en la fase estacionaria. ▪ De intercambio iónico: Es una cromatografía L-S. Se realiza en columna. Se basa en la afinidad de iones en disolución por sus contraiones presentes en la FE: interacciones electroestáticas. FE: grupos iónicos covalentemente unidos a un soporte sólido poroso (resinas de intercambio catiónico, que atraen iones con carga + o aniónico, que atraen iones con carga -. FM: solución acuosa tamponada que contiene un ión d ella misma carga que el analito y opuesta a la de los grupos iónicos de la FE. Se produce una competencia entre el analito y los iones de la FM por su unión a los grupos iónicos de la FE. Los analitos retenidos por la FE pueden ser forzados o eluír: Añadiendo un tampón muy rico en contraiones que compiten con el analito y lo desplazan de su inión a la FE. O, mediante un tampón de pH tal que invierta la carga eléctrica del analito y haga que se suelte y eluya. ▪ De penetrabilidad (Cromatografía de exclusión molecular o filtración por gel): Es una cromatografía L-S. Se realiza en columna, donde se encuentra empaquetada la FE. La separación se basa e los distintos tamaños y formas de los solutos, así como en el tamaño de los geles utilizados. FM: agua o soluciones acuosas.  FE: geles de polímeros de hidratos de carbono o poliacrimida (Sephadex, bio-gel o Styragel), que se hinchan al absorber el agua y forman tamices a nivel molecular. Las moléculas de la muestra que tienen un diámetro mayor que los poros del gel, pasan por los espacios que quedan entre las bolas de gel y salen primero. Por el contrario, las moléculas más pequeñas pasan por el interior de los poros y tardan más en salir. ▪ De afinidad: Es una cromatografía L-S. Se realiza en columna. Se utiliza para separar subclases celulares y obtener alguna de ellas pura (Ej.: linfocitos T). FE: adsorbente que tiene un ligado capaz de interaccionar bioespecíficamente con algún componente de la superficie de la células que se quieren separar. FM: disolvente apropiado para movilizar las células que se van a separar. La muestra celular, en suspensión en la FM, pasa por una columna rellena con la FE. Las células que se quieren separar quedan unidas al adsorbente y el resto eluye con la FM. Luego se fuerza la elución de las células retenidas con un flujo de eluyente a una concentración mucho mayor. Aplicaciones de la cromatografía ◦ Cromatografía en papel: para identificar azúcares en orinas. ◦ Cromatografía en capa fina: para separar lípidos, esteroides, aminoácidos, azúcares y, en general, sustancias de bajo peso molecular. ◦ Cromatografía en columna: para obtener y cuantificar hemoglobina glicosilada y hemoglobina A2. ◦ Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC): para separación de praguicidas, aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, azúcares, drogas, terpenoides, etc. ◦ Cromatografía de gases: paara determinación y fraccionamiento de esteroides, lípidos barbitúricos, fármacos, alcohol en sangre, y determinaciones de otras sustancias toxicológicas. Otras técnicas de separación ◦ Cristalización: Es el paso de una sustancia de una disolución a su estado cristalino. Los compuestos cristalinos tienen un elevado grado de pureza. Etapas básicas de la cristalización son:  ▪ Selección del disolvente. ▪ Trituración de la muestra. ▪ Preparación de la disolución. ▪ Arrefriamiento lento y filtrado. ▪ Lavado. ▪ Secado de los cristales. 4. Separación a partir de propiedades electroquímicas La electroforesis es una técnica de separación de mezclas basadas en las diferentes mobilidades de sus componentes en un campo eléctrico. Se dispone la mezcla en un soporte y se aplica un campo eléctrico. Las diferentes partículas (todas con igual carga) migrarán a diferentes velocidades dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas. Componentes del equipo de electroforesis: → Fuente de alimentación eléctrica: suministra la diferencia de potencial. Cable negro al electrodo negativo (cátodo). Cable rojo al electrodo positivo (ánodo). → Cubeta de electroforesis: dos recipientes en los que se deposita una disolución tampón. Están conectados a los electrodos. Un puente sobre el que se coloca el soporte con la muestra. → Soporte: matriz donde se deposita la muestra que se va a analizar. Se coloca sobre el puente, de forma que sus extremos estén en contacto con la solución tampón de los recipientes de la cubeta. Debe ser inerte, sin carga. Tipos de soportes: Soportes no restrictivos: tienen un gran tamaño de poro, por el que la separación es solo en función d ella carga eléctrica de las moléculas. ◦ Acetato de celulosa: muy habitual para proteinograma. ◦ Papel: en desuso. Soportes restrictivos: los poros del soporte actúan como un tamiz, por lo que la separación depende de la carga eléctrica y del tamaño de las moléculas. ◦ Gel de agarosa: para separar ácidos nucleicos y proteínas. A mayor porcentaje de agarosa, menor diámetro de poro. ◦ Gel de poliacrilamida (PAGE): tamaño de poro menor, para separar moléculas más pequeñas. ◦ Gel de almidón: poco utilizado, difícil preparación. Preparación y uso del equipo: Preparación de la muestra: se aplican otros medios de separación, como la centrifugación, para concentrar en lo posible la sustancia. Preparación del soporte: los geles. Preparación del tampón. Siembra de la muestra sobre el soporte: ◦ Si las moléculas tienen carga +, se colocan cerca del ánodo para que puedan migrar hacia el cátodo. Y viceversa.  ◦ Si el soporte es un gel se deposita una pequeña cantidad de muestra en los pocillos con la ayuda de una micropipeta. ◦ En otros medios se deposita una gota directamente sobre el soporte, controlando la cantidad depositada. Selección de los parámetros eléctricos y el tiempo. Puesta en marcha del equipo. Las sustancias empezarán a migrar por el medio. El resultado será una serie de bandas sobre el soporte, cada una de las cuales corresponderán a una sustancia distinta. A continuación, se realiza un revelado (observación de bandas), que suele consistir en la adición de un colorante y un posterior lavado. Por último, se interpreta la información obtenida: LECTURA. ◦ Se pueden observar las bandar en el transiluminador. ◦ Se puede realizar una cuantificación por espectrofotometría, por densitometría, etc. Factores que afectan a la migración: ◦ Forma y tamaño de las moléculas: ▪ Moléculas de mayor tamaño→menor velocidad. ▪ Moléculas de formas esféricas → mayor velocidad. ◦ Soporte: fenómenos que retienen la migración: ▪ Adsorción: retención inespecífica de las moléculas. ▪ Electroendósmosis: en soportes no restrictivos. Aparecen cargas negativas por estar en contacto con una disolución iónica y la propia solución migra en el campo eléctrico. ▪ Tamizado molecular: debido al diámetro de los poros del soporte, separa las moléculas por tamaño. ◦ Tampón: ▪ Mantiene una fuerza iónica adecuada, lo que depende de su concentración de iones. Debe ser suficiente para mantener el pH y la conductividad, pero no es muy elevada→0,05 – 0,10 M. ▪ Mantiene una carga neta constante en las moléculas y presentan carga + o – en función del pH. El punto isoeléctrico (pl) es el pH al que presenta carga 0 y no migrará. ◦ Campo eléctrico: ▪ Diferencia de potencial (V): 10-10000 V. A más V → más velocidad de migración. A más V → más aumento de la temperatura (efecto Joule). Las proteínas se desnaturalizan y el tampón se evapora. A demás, a más V, puede generarse una distorsión de las bandas. ▪ Intensidad de la corriente (I): 5-50 mA. A más I → más distancia recorrida.  ▪ Resistencia (R) en Ohmios: A más R → menor movilidad electroforética. ◦ Tiempo de electroforesis: Al aumentar el tiempo → aumenta la distancia de separación entre moléculas. Principales técnicas electroforéticas: ◦ Electroforesis en Cellogel o acetato de celulosa: → Para realizar proteinogramas: electroforesis de proteínas plasmáticas (semicuantitativo). → Se usan tiras comerciales que se hidratan 10 minutos en solución tampón y se secan entre papel de filtro. → Tampón: Veronal (pH 8,5) o TRIS (pH 8,6). → Colorante: negro amidoo, azul de Coomasie o rojo Ponceau. → Solución decolorante: metanol y ácido acético. → Solución transparentizadora: metanol y acético. 1. Colocamos el acetato de celulosa en el soporte. 2. Siembra de la muestra y colocación sobre la cubeta para que se establezca contacto con el tampón. 3. Tapamos la cubeta y conectamos la fuente de alimentación. Ajustamos intensidad y tiempo. Revelado: Retiramos la tira de la cubeta y la dejamos 10 minutos sumergida en un colorante. Decoloramos la tira con el líquido decolorante hasta observar las bandas en un fondo claro. Pasamos la tira por una solución transparentizadora. Situamos la tira entre dos hojas de papel de filtro para eliminar el exceso de soluciones decolorantes. En el informe suele aparecer el % de cada fracción respecto a la concentración total. ▪ Espectrometría: se recortan las distintas franjas y se introducen en tubos con un disolvente que saca las proteínas del Cellogel → disolución de cada franja. Se mide la absorbancia de cada disolución. ▪ Densitometría: un fotómetro cuantifica el colorante fijad en cada una de las franjas y lo representa mediante un proteinograma. ◦ Electroforesis en gel de agarosa: Para separación de fragmentos de ADN (se puede hacer también en gel de poliacrilamida). 1. Extracción de los fragmentos de ADN y amplificación mediante PCR. 2. Se prepara la disolución con la muestra en el mismo tampón que usaremos en la electroforesis. A demás, se le incorpora sacarosa, glicerol o Ficoll para aumentar su densidad. 3. Se prepara el gel y se hacen los pocillos de siembra con un peine. Se debe elegir la concentración de agarosa en función del tamaño de los fragmentos de ADN (cuanto mayor sea la concentración, menor será el tamaño de los poros y por lo tanto se separan mejor los fragmentos pequeños) → si necesito separar fragmentos pequeños tengo que utilizar geles de agarosa de mayor concentración.  ▪ Tampón: Tris-acetato 0,04 M (pH 8) o TBE 5X. Se suelen añadir marcadores electroforéticos o también llamados tampones de carga (DNP-Lys o azul de bromofenol): moléculas coloreadas con mayor velocidad de migración. ▪ Sustancia reveladora: emite fluorescencia cuando se ilumina con luz UV. Bromuro de etidio (mutagénico), Fash Blue o SYBR Green. Se puede añadir en la fase de revelado o incorporarse al gel. ▪ Marcadores de peso molecular: ADN de tamaño conocido y se usa como patrones. ◦ Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE): ▪ Para separación de: Proteínas. Pequeños fragmentos de ADN (5-500 pb). La mayoría de los ARN. ▪ Soporte: acrilamida y bisacrilamida (neurotóxicos por inhalación y absorción por la piel antes de polimerizar). ▪ Electroforesis vertical. ▪ Se adiciona a las muestras: El tampón. Glicerol para aumentar la densidad. Marcadores electroforéticos: azul de bromofenol. ▪ Modalidad de geles en gradiente: la concentración de acrilamida aumenta progresivamente en sentido descendente → las bandas se estrechan y mejora la resolución. Tipos principales de PAGE: En condiciones no desnaturalizantes: no se altera la conformación nativa de las proteínas → estudios de funcionalidad. En condiciones desnaturalizantes: las proteínas pierden su estructura nativa en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, ditiotreitol o DTT, urea o determinados detergentes como el dodecil sulfato sódico o SDS). Se incluyen en el tampón y en los geles. SDS – PAGE: es la electroforesis más utilizada. Es muy rápida. La separación depende de la masa molecular. Se utilizan marcadores de peso molecular (proteínas de peso molecular conocido). Aun que es muy común en proteínas, también se puede usar para visualizar las diferencias entre pequeños fragmentos. Electroenfoque (EEF) o Isoelectroenfoque: Las proteínas se separan según su punto isoeléctrico (pl: pH al que una molécula tiene una carga eléctrica neta igual a cero): efecto focalizante.  Se usa un gradiente continuo de pH. Se emplean compuestos de bajo peso molecular: anfolitos portadores con pl de 2,5 a 11. Se hacen en gel de poliacrilamida. Cada anfolito migra hacia un electrodo en función de su carga hasta alcanzar la zona de su pl y se detiene formando el gradiente de pH. Electroforesis bidimensional: Dos electroforesis distintas realizadas sobre una misma muestra: ◦ Electroenfoque en la primera dimensión. ◦ PAGE-SDS en la segunda dimensión. Máxima resolución. Las proteínas se transfieren del gel a una membrana: blotting y se pueden poner en contacto con anticuerpos para su identificación.  Electroforesis en campos pulsantes (PFGE): Para la separación de grandes fragmentos de ADN induciendo su reorientación mediante cambios periódicos del campo eléctrico: 2 campos eléctricos perpendiculares entre si que se repiten de forma sucesiva a modo de secuencia. A mayor tamaño de los fragmentos → mayor duración de los campos aplicados (duración del pulso: desde fracción de segundo hasta 2 horas). Inmunoelectroforesis: Para separar proteínas. Electroforesis en gel de agarosa seguida de inmunodifusión sin hacer tinción. Se hace un canal sobre el gel paralelo a la dirección de migración y se deposita en el un antisuero con anticuerpos específicos frente a las proteínas separadas. Se mantiene a temperatura ambiente 24-48 horas y se producen complejos Ag-Ac que precipitan. Electroforesis capilar: Se utiliza como soporte un capilar de diámetro interno muy pequeño. Dentro del capilar se encuentra la disolución con la muestra y el tampón. Alta voltaje: 500 V → tiempo de análisis más corto y mejor resolución. Se puede aplicar a cualquier compuesto y acoplarlo a un detector UV, de fluorescencia, un espectrómetro de masas, etc. 5. Selección de la técnica de separación Para elegir una técnica de separación, a demás de criterios económicos y de accesibilidad, hay que tener en cuenta: → Propiedades físicas y estructurales de las moléculas a separar. → Los objetivos de análisis posterior (sensibilidad, resolución, rapidez, especificidad, etc.). Centrifugación y decantación: diferencias de densidad entre las distintas sustancias. Filtración y diálisis: diferencias de tamaño. Extracción con disolventes: diferencias de solubilidad. Destilación: separación por acción del calor de un líquido volátil de otro que no lo es o de un líquido cuyo punto de ebullición sea distinto. El tamaño es una de las propiedades físicas que más se utiliza para separar los distintos tipos de biomoléculas de una muestra: → Si las moléculas difieren mucho en tamaño: filtración o diálisis. → Si las diferencias son más pequeñas: centrifugación. Electroforesis: diferencias en cuanto a la carga eléctrica (también influyen otros factores como la forma, el tamaño, etc.). Cromatografía: diferencias en cuanto a la solubilidad, afinidad, capacidad de absorción, etc. La centrifugación es muy útil en: → Separación del suero del plasma. → Concentración de células (Ej.: sedimento urinario). → Aclarar líquidos orgánicos. → Fraccionar las distintas lipoproteínas (ultracentrifugación). → Separación de sustancias (Ej.: las LDL y VLDL precipitadas de las HDL). → La electroforesis en acetato de celulosa es empleada en la rutina clínica, sobre todo, para separar proteínas séricas y aminoácidos. → La electroforesis en gel de agarosa se emplea en biología molecular y también con técnicas inmunoquímicas (inmunoelectroforesis y otros). → La electroforesis en gel de poliacrilamida se usa en la separación de isoenzimas de la fosfatasa alcalina (FAL), en métodos de determinación de pesos moleculares de proteínas y en investigación. → El isoelectroenfoque se emplea para separar inmunoglobulinas, isoenzimas y proteínas, segundo su pl. → Comatografía en papel: para identificar azúcares en orinas. → Cromatografía en capa fina: para separar lípidos, esteroides, aminoácidos, azúcares y, en general, sustancias de bajo pero molecular. → Cromatografía en columna: para obtener y cuantificar hemoglobina glicosilada y hemoglobina A2. → Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): para separación de praguicidas, hidrocarburos, aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, azúcares, drogas, terpenoides, etc. → Cromatografía de gases: para determinación y fraccionamiento de esteroides, lípidos, barbitúricos, fármacos, alcohol en sangre y determinaciones de otras sustancias toxicológicas. En la actualidad, cada vez es más frecuente que los métodos de separación más sencillos sean solo pasos preparatorios para el óptimo desenvolvimiento de otros análisis más complejos como: → HPLC → CG-Masas: Cromatografía de gases combinada con espectroscopía de masas. (que es pl.; preguntar si son todos esos tipos de electroforesis)  ACTIVIDADES DE REPASO UD4 PARTE I 1. Analiza as seguintes afirmacións e descubre se son verdadeiras ou falsas. Naqueles casos que sexan falsas, xustifica a resposta. a. Os filtros de vidro molido poden empregarse para filtracións esterilizantes. Falsa, se usan los filtros de membrana con poros suficientemente pequeños para que pase el liquido pero no los microorganismos. b. A ultrafiltración pode separar macromoléculas como proteínas e hemoglobina. Verdadero. c. O filtro de pregos emprégase cando se quere conservar o sólido da suspensión (torta). Falso, se usa cuando se quiere conservar el líquido filtrado. d. A decantación é un método de separación baseado na solubilidade das substancias. Falsa, es basado en la densidad. e. A centrifugación utiliza a forza centrífuga para acelerar a sedimentación de partículas. Verdadero. f. A forza centrífuga relativa (FCR) é independente do radio do rotor da centrífuga. Falsa, es dependiente. Es directamente proporcional. g. Unha ultracentrífuga pode alcanzar velocidades superiores a 50000 rpm. Verdadero. h. Nunha centrifugación en gradiente de densidade, as partículas distribúense en función do seu tamaño e forma. Falso, se distribuyen en fracciones de diferentes densidades dentro del fluído. i. A destilación simple permite separar compoñentes con puntos de ebullición moi similares. Falso, sería la destilación fraccionada. j. A centrifugación analítica úsase para medir propiedades físicas das partículas, como a súa masa molecular. Verdadero. k. Na diálise, as macromoléculas atravesan a membrana semipermeable. Falso, se quedan retenidas. l. A filtración con filtro de papel redondo úsase principalmente na filtración por gravidade. Falso, sirve para la filtración al vacío. m. A decantación é máis eficaz que a filtración para separar partículas sólidas en líquidos. Falso, es menos eficaz que la filtración. n. Os filtros de vidro molido pódense limpar con ácido sulfúrico quente. Verdadero. ñ. A evaporación diferénciase da destilación porque nesta última búscase recuperar o líquido evaporado. Verdadero o. Na centrifugación isopícnica, as partículas máis lixeiras sempre se acumulan na parte superior do tubo sen posibilidade de migrar a zonas máis densas. Falso, no tienen por que quedar en la parte superior, se va a colocar donde corresponda por su gradiente de densidad. 2. Responde as seguintes cuestións: a. Que propiedade física se utiliza na filtración para separar partículas dunha mestura? El tamaño. b. Que nome recibe o líquido que atravesa un filtro durante a filtración? Filtrado. c. Cal é a principal forza que actúa na decantación? La gravedad. d. Que equipo se utiliza para acelerar a sedimentación de partículas mediante rotación? Centrífuga. e. Como se denomina a fracción sólida que se obtén na centrifugación? Pellet o precipitado. f. Que tipo de centrífuga se utiliza para separar orgánulos celulares comoos ribosomas? Ultracentrífuga. g. Que líquido se soe utilizar nos gradientes de densidade para a centrifugación isopícnica? Cloruro de cesio. h. Que tipo de destilación se usa cando os puntos de ebullición dos compostos son moi cercanos? Destilación fraccionada o por rectificación. i. Que variable se debe controlar nunha centrifugación se se traballa con mostras termolábiles? La temperatura. (Centrífugas refrigeradas hay que usar). 3. Tendo en conta que rotor da centrífuga ten un diámetro de 20 cm, transforma as seguintes unidades (as rpm en g; e as g en rpm). FCR=K*RPM2*R a. 1000g b. 3500g c. 12000 rpm d. 1500 rpm