Biotechnologie: Genetische Code & Eiwitsynthese

Biotechnolo gie II Dr. Ilse Inho ud Deel I: Eiwitten, eiwitsynthese en eiwittechnologie 1 Samenstelling en structuur van eiwitten 2 Eiwitsynthese 3 Analyse van eiwitten 4 Zuivering van eiwitten Deel II: Genregulatie 5 Genregulatie in bacteriën 6 Genregulatie bij eukaryoten 7 Gentechn...

Biotechnolo gie II Dr. Ilse Inho ud Deel I: Eiwitten, eiwitsynthese en eiwittechnologie 1 Samenstelling en structuur van eiwitten 2 Eiwitsynthese 3 Analyse van eiwitten 4 Zuivering van eiwitten Deel II: Genregulatie 5 Genregulatie in bacteriën 6 Genregulatie bij eukaryoten 7 Gentechnologie voor het opsporen van functionele domeinen in DNA Biotechnologi 2 e II Inho ud 2 Eiwitsynthese 1. De genetische code 2. De codon-anticodon interactie 3. Het ribosoom als eiwitfabriek 4. Eiwitsynthese bij prokayoten (E. coli) 5. Eiwitsynthese bij 3 Biotechnologi e II eukaryoten  Centraal dogma Mol DNA Biol  replicatie  DNA Gen RN  < promotoractiviteit < ….. A transcripti Transcript e < natuurlijke half-life bepaald  door < poly A cel/ziekte-specifieke maturatie regulerende RNA  stabiliteit Polypept ide Biotechnologi 4 Proteïne e II  DN A RN A Biotechnologi 5 e II Genetische code De genetische code = UNIVERS Biotechnologi 6 e II Biotechnologi 7 e II Genetische code Polymerisatie van L- aminozuren Van N naar C Universele code, maar……. Codons vs anticodons Biotechnologi 8 e II Genetische code 64 mogelijke codons  20 AZ  degeneratie code Hoe werkt dit ? - - Biotechnologi 9 e II Genetische purines ? code Code georganiseerd pyrimidines ? om nadelige effecten mutaties te neutraliseren Hoe werkt dit ? - 1e positie mut  gelijkwaardig AZ - Pyrimidine 2e plaats  HFB - Purine 2e plaats  HFL -Biotechnologi 3e plaats mut < 1 0 e II Codon-anticodon interactie Biotechnologi 1 e II 1 Biotechnologi 1 e II 2  base in anticodon base in codon G U of C C G A U U A of G I A, U of C Wobble regels Vrijheidsgraad 5’ anticodon om te baseparen met 3’ eind van codon Enkel op die plaats Biotechnologi 1 e II 3 Codon-anticodon interactie Codonpreferenties per organisme  codongebruik niet willekeurig (codon bias) Startcodons  Met-tRNAFMet Prokaryoot  AUG (GUG) (UUG, CUG)  Met Eukaryoot  AUG  Met Stopcodons  releasing factors UAA UAG UGA Biotechnologi 1 e II 4 Codon bias Illustra tie Biotechnologi 1 e II 5 Inho ud 2 Eiwitsynthese 1. De genetische code 2. De codon-anticodon interactie 3. Het ribosoom als eiwitfabriek 4. Eiwitsynthese bij prokayoten (E. coli) 5. Eiwitsynthese bij 1 Biotechnologi e II eukaryoten 6 Biotechnologi 1 e II 7 Biotechnologi 1 e II 8  E site Biotechnologi 1 e II 9 Biotechnologi 2 e II 0 Inho ud 2 Eiwitsynthese 1. De genetische code 2. De codon-anticodon interactie 3. Het ribosoom als eiwitfabriek 4. Eiwitsynthese bij prokayoten (E. coli) 5. Eiwitsynthese bij 2 Biotechnologi e II eukaryoten 1 Biotechnologi 2 e II 2 Initia tie De eiwitsynthese begint met N-formyl- methionine De formyl-groep wordt pas aangebracht na overdracht van het AZ naar de tRNA adaptor. Er zijn twee verschillende tRNAMet waarvan één formylatie toelaat * Biotechnologi 2 e II 3 Beide tRNA Met herkennen een AUG codon alleenmaar tRNA herkent MetF het initiatiecodon Na aanvang van de eiwitsynthese wordt het initiërende methionine terug gedeformyleerd. Door deformylase Biotechnologi 2 e II 4 Er wordt een initiatiecomplex gevormd samengesteld uit: de ribosomale 30S subeenheid het mRNA het initiërend fMet-tRNAFMet Pas nadien komt de 50S subeenheid erbij om een 70S ribosoom te vormen (elongatie) Biotechnologi 2 e II 5 Een efficiënte initiatie vergt een ribosoombindingsplaats (RBS) op het mRNA mRNA omvat een SD-sequentie gevolgd door een AUG 8 tot 13 nucleotiden stroomafwaarts (naar 3’ toe) Bacterieel  polycistronisch  één SD voor elk startcodon Biotechnologi 2 e II 6 Een efficiënte initiatie vergt een ribosoombindingsplaats (RBS) op het mRNA Deze omvat een SD-sequentie gevolgd door een AUG 8 tot 13 nucleotiden stroomafwaarts (naar 3’ toe) Biotechnologi 2 e II 7 De SD-sequentie wordt herkend door het 3’-eind van het ribosomale 16S rRNA aanwezig in de ribosomale 30S subeenheid Het zorgt voor een correcte positionering van 30S ten opzichte van het mRNA Biotechnologi 2 e II 8 Tijdens de initiatie hebben we twee RNA-RNA interacties: 1. tussen het mRNA en het 16S rRNA ter hoogte van de SD Met 2. tussen het tRNAF , opgeladen met fMet, en het initiërend AUG-codon Er zijn ook initiatiefactoren nodig Binding van de 50S subeenheid vergt een molecule GTP (GTPGDP+P) Biotechnologi 2 e II 9 Initiatiefact oren Biotechnologi 3 e II 0 Initiërend tRNA bevindt zich op de P- plaats van het ribosoom Biotechnologi 3 e II 1 Biotechnologi 3 e II 2 Initia tie GTP stabiliseert de IF-30S binding, GTP interageert met IF2 IF1 blokkert de A-plaats, IF1 vergemakkelijkt de binding van IF2 en IF3 IF2 bevordert de binding van initiator tRNA IF3 verhindert associatie 50 S met 30S en bevordert 30S- mRNA binding 30S initiatie complex : IF-30S-GTP- tRNAfMet-mRNA Biotechnologi 3 e II 3 Elonga tie De mRNA-moleculen worden door de ribosomen in de 5’-3’ richting “gelezen” Elk ribosoom heeft drie tRNA- bindende centra Peptidyl (P) plaats aminoacyl (A) plaats Exit (E) plaats Elongatie vergt 2 GTP moleculen per ingebouwd aminozuur Binding aminozuur-tRNA complex vergt EF-Tu en EF-Ts Translocatie van A naar P plaats Biotechnologi 3 e II 4 Elonga tie B otechnologi 3 i e II 5  Activiteit vervat in 50S subunit GEEN apart enzyme! Biotechnologi 3 e II 6 Elonga tie Elongatie vergt 2 GTP moleculen per ingebouwd aminozuur Binding aminozuur-tRNA complex vergt EF-Tu en EF-Ts Translocatie van A naar P plaats vergt EF-G Biotechnologi 3 e II 7 Biotechnologi 3 e II 8 Groeiende polypeptideketen gaat reeds tijdens synthese over tot secundaire en tertiaire structuur Een mRNA wordt door verschillende ribosomen tegelijkertijd vertaald. Biotechnologi 3 e II 9 Polyso om Biotechnologie II 40 Terminatie Prokaryoten!! Vergt: stopcodon: UAA, UAG of UGA releasing factors (RF) RF1 RF2 RF3  stimuleert RF1 en RF2 werking, verbruikt 1 GTP Biotechnologi 4 e II 1 Biotechnologi 4 e II 2 Samenvatt ing Prokaryotische https://www.y outube.com/ watch? translatie v=KZBljAM6B1s Initiatiehttps:// www.youtube.com/watch?v=glsrY4dJzh Elongatihttps:// 8 www.youtube.com/watch?v=PpAg2K_7ID e 4 https:// Termina www.youtube.com/watch?v=MNMc28EEkK 0 tie Biotechnologi 4 e II 3 Oefeni ng MVAP is de aminozuur sequentie van een polypeptide. Schrijf de sequentie in de 3- letterafkorting? Hoeveel moleculen GTP vergt de aanmaak van dit polypeptide? Biotechnologi 4 e II 4 Synthese van geëxporteerde eiwitten Eiwitten die door de celmembraan migreren hebben een signaalpeptide Het signaalpeptide heeft volgende eigenschappen: 15-30 AZ lang (extra) aan NH2-eind één of meer “basische” aminozuren intern hydrofoob wordt aan andere kant van Biotechnologi 4 e II 5 Biotechnologi 4 e II 6 Migratie door celmembraan : cotranslationeel of post- translationeel Belangrijke signaalweg (pathway) voor secretie = SEC pathway SecYEG proteïne complex  kanaal SecB  “losse” conformatie polypeptide SecA  binding preproteïne met translocatiecomplex  binding/hydrolyse ATP Signaalpeptide + sequentie volledig polypeptide bepalen export * Signaalpeptide  antiparallelle haarspeld SRP-afhankelijke pathway  SRP-receptor in het celmembraan Biotechnologi (FtsY) 4 e II 7 Biotechnologi 4 e II 8 Inho ud 2 Eiwitsynthese 1. De genetische code 2. De codon-anticodon interactie 3. Het ribosoom als eiwitfabriek 4. Eiwitsynthese bij prokayoten (E. coli) 5. Eiwitsynthese bij 4 Biotechnologi e II eukaryoten 9