Apúntes FMP Fisiología Molecular de Plantas PDF

.. FISIOLOGÍA MOLECULAR DE PLANTAS FMP  T1 – Concepto de la fisiología vegetal 1. Concepto y objeto de la Fisiología Vegetal. Concepto - Ciencia que estudia el funcionamiento de los vegetales. - La ciencia que estudia las respuestas de los organismos vegetales o partes vivas de los mismos,...

.. FISIOLOGÍA MOLECULAR DE PLANTAS FMP  T1 – Concepto de la fisiología vegetal 1. Concepto y objeto de la Fisiología Vegetal. Concepto - Ciencia que estudia el funcionamiento de los vegetales. - La ciencia que estudia las respuestas de los organismos vegetales o partes vivas de los mismos, frente a agentes externos o internos variables. - La ciencia que estudia las funciones y actividades de las plantas, abarcando los procesos de crecimiento, metabolismo y reproducción. - El estudio de los procesos que tienen lugar durante el desarrollo de las plantas, los mecanismos internos mediante los cuales realizan los diferentes procesos metabólicos, los sistemas de regulación implicados, y las relaciones con el ambiente físico y otros organismos. Por tanto, la fisiología vegetal, trata de comprender el funcionamiento de los vegetales desde el nivel molecular hasta el nivel ecológico mediante la combinación de datos biofísicos, bioquímicos, citológicos, genéticos y ecológicos. Objeto Las plantas se caracterizan por ser organismos vegetales y tener las características de las células vegetales (pared celular, vacuola central grande y cloroplastos). LAS PLANTAS Son organismos fotosintéticos terrestres (incluye algas rojas y verdes) que incluyen briófitos (musgos y hepáticas), pteridófitos (helechos) y espermatófitos (plantas con semillas). Existen muchas especies vegetales pero los estudios fisiológicos se reducen en nº, clasificándose según su interés: Interés económico: plantas hortícolas, cereales, leguminosas o frutales. Interés ecológico: adaptadas a determinados ambientes como las plantas CAM. Interés como modelos de estudio en el ámbito molecular genético (Arabidopsis thaliana). Arabidopsis thaliana es una planta de la familia de las brasicáceas. Se trata de una planta pequeña, muy apropiada para su cultivo en laboratorio y experimentación. A esta familia también pertenece el brócoli y la lechuga. Fue la 1ª planta superior cuyo genoma se secuencio del todo y tiene un uso muy extendido en el estudio de los mecanismos moleculares necesarios para comprender los cambios en el desarrollo vegetal. Ventajas: pequeña, ciclo de vida corto, por lo que se reproduce rápidamente y es fácilmente manipulable mediante técnicas de ingeniería genética. 2. Ámbito de estudio y relaciones de la Fisiología Vegetal con otras ciencias. Nacida de la botánica, la fisiología vegetal es una disciplina vinculada también a otras ciencias, habiendo adoptado de estas unas valiosísimas y variadas herramientas de trabajo. La biofísica y la bioquímica han permitido desvelar la base molecular de un gran nº de procesos fisiológicos: Análisis cristalográfico (rayos X) para determinar la estructura de los fotosistemas, cromatografía y espectroscopía para identificación y cuantificación de intermediarios metabólicos. 1 La biología celular, los desarrollos de la microscopía electrónica y de las técnicas histoquímicas han permitido el conocimiento de la ultraestructura de las células vegetales, localización intracelular de importantes moléculas biológicas y su relación estructura-función. La genética molecular, técnicas para el cultivo de tejidos in vitro, fusión de protoplastos, ingeniería genética y biología molecular, están permitiendo llevar a cabo programas de investigación aplicada como seleccionar las mejores variedades de plantas, obtener especies híbridas nuevas, transferencia de genes, plantas con una mejor composición de proteínas o de lípidos, plantas para la producción de medicamentos… El fisiólogo vegetal no debe olvidar nunca que su objetivo final continúa siendo comprender como opera la planta en su conjunto. Una vez que los metabolitos, reacciones o procesos han sido descritos por separado, el fisiólogo vegetal debe procurar integrarlos en términos de la propia organización de la planta. Por ejemplo, para mejorar el contenido en proteína de una leguminosa hay que probar el crecimiento en un invernadero ya que algunas condiciones (horas de sol) no las podemos controlar. También debemos probar nuestra planta en campo ya que se aumenta el nº de factores variables. La fisiología vegetal se conecta con la biología molecular y la genética (estructura de moléculas, regulación génica), citología histología y anatomía (relación estructura-función), bioquímica (procesos metabólicos, regulación enzimática), química (composición del medio), edafología (estudio del suelo, medio de la raíz), física (procesos de intercambio, factores climáticos), estadística (análisis de datos) y la microbiología (interacciones entre planta y microorganismo, simbiosis, patógenos). No se puede entender una planta sin los microorganismos que la rodean. No crecerá igual si esta en un ambiente sin estos. Las micorrizas son hongos beneficiosos que hacen simbiosis con las raíces de las plantas permitiendo que la planta este mejor nutrida y extendiendo las raíces ya que actúan como hifas (aumentan la superficie de absorción de la planta). Casi todas las plantas naturales se micorrizan. Existen otros microorganismos llamados rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPRs) que son bacterias asociadas a las plantas que también aumentan su crecimiento. La estructura planta-microorganismo está determinada por la estructura del suelo (dependiendo de las caract de este). 3. Características generales de los vegetales. 3.1. Características de los organismos vegetales 1. Autotrofía: capaces de alimentarse por si mismo a partir de materia inorgánica y energía luminosa u oxidando sustancias inorgánicas. Cogen agua y CO2 y construyen moléculas orgánicas. 2. Ausencia de sistemas cerrados de circulación: mecanismo de transporte. Xilema (abierto de la raíz a las hojas) y floema (abierto de hojas hacia abajo). Les sirve para transportar nutrientes. 3. Incapacidad de locomoción: desarrollo fijo al sustrato. Inmovilidad aparente debido a la presencia de una pared celular rígida. Las plantas son organismos sésiles (no se pueden mover). Excepciones a nivel celular y a nivel de órgano (sí se mueven). 4. Forma dendrítica: antena, intercambio de gases, volumen de terreno explorado. Tienen mucha superficie expuesta a la luz para obtener mayor energía y aumentar el intercambio gaseoso. La forma dendrítica se da en hojas y en raíz (para captar mas agua y nutrientes). 5. Plan de organización: bipolaridad del crecimiento, formación de tejidos y órganos a lo largo de la ontogenia (todos los ciclos de crecimiento por los que una planta pasa, germinación, crecimiento vegetativo, floración, fructificación y senescencia). 6. Totipotencia celular: se puede regenerar una planta completa a partir de un trozo vegetal (explanto: parte de un tejido; un tallo o una raíz) o incluso a partir de una sola cél. La totipotencia celular reside en los meristemos vegetales (zona de crecimiento hacia arriba y zona de crecimiento 2 hacia abajo). Son celulas indiferenciadas; células meristemáticas que presentan totipotencia celular. Se irán dividiendo y en un momento se diferenciarán gracias a diferentes estímulos. Meristemo caulinar o apical y meristemo radical (raíces). A partir de un protoplasma puedo conseguir regenerar una planta completa. 3.2. Características de las células vegetales 1. Pared celular: celulosa, hemicelulosa, pectinas… Dos tipos: pared primaria y pared secundaria. 2. Vacuola central: almacena sustancias de desecho y metabolitos útiles e intervienen en cambios de turgor. 3. Plastos: son exclusivos de células vegetales. 3 tipos principales: cloroplastos, cromoplastos y leucoplastos. Plasmodesmos: poros a través de los cuales se produce el intercambio de sustancias entre 2 células adyacentes. 3.3. La pared celular: composición Estructura común a todos los vegetales, aunque su composición varia en los distintos grupos taxonómicos. La pared se va depositando como una serie de capas. Funciones: - Soporte o esqueleto. - Control del crecimiento celular por pérdida controlada de la rigidez. - Barrera frente a la entrada de microorganismos. - No es una barrera de permeabilidad, pero su grado de porosidad puede limitar el intercambio de metabólicos entre el protoplasto y el medio. Pared celular primaria: es la que poseen las células en crecimiento. Grosor hasta 0,1 micra. Menos rígida, presente en cel meristemáticas. Muy porosa con contenido de agua alto y permite el paso de agua y solutos de bajo peso molecular. Pared celular secundaria: está presente en células maduras que han dejado de crecer, mucho más gruesa. Suele estar lignificada, suberificada o cutinizada, lo que disminuye la porosidad de la pared (menos permeable) y le confiere propiedades mecánicas (mucho mas rígida y resistente). 3.4. La vacuola Rodeada de una membrana lipídica llamada tonoplasto. En células maduras ocupa casi todo el volumen celular. En cel meristemáticas hay muchas pequeñas vacuolas. Funciones: - Vacuolas con pigmentos (en pétalos) - Turgencia celular (crecimiento, movimientos) - Almacenamiento de iones inorgánicos y metabólicos gracias a transportadores específicos del tonoplasto. - Acumulan acido málico durante la noche (plantas CAM) - Acumulación de cuerpos proteicos en semillas - Vacuolas líticas que liberan enzimas hidrolíticas en hojas senescentes. 3.5. Los plastos Los plastos son orgánulos exclusivos de células vegetales. 3 Cloroplastos: color verde debido a la clorofila, envueltos por una doble mb (externa e interna) y en el interior se encuentran un sistema de membranas llamadas tilacoides. Rodeando las membranas tilacoidales está el estroma. El aparato fotosintético se encuentra en los tilacoides. Cromoplastos: plastos de colores debido a la acumulación de carotenoides, dan color amarillo, naranja y rojo a muchos frutos, flores y hojas en otoño. Leucoplastos: no tienen pigmentos (no color), acumulan otros compuestos como por ejemplo almidón (amiloplastos). Estructura similar con doble membrana, pero no tienen el sistema de membranas internas. 4  T2 – Introducción a la fotosíntesis 1. Fotosíntesis: Definición. La conversión de la radiación luminosa en potenciales energético y reductor, que posteriormente serán utilizados para formar moléculas orgánicas reducidas (hidratos de carbono) a partir de sustancias inorgánicas oxidadas (CO2 y H2O) y con el desprendimiento de oxigeno. Las reacciones de luz ocurren en la membrana de los tilacoides y las del carbono en el estroma. La fotosíntesis puede considerarse como un proceso único descrito por la ecuación: CO2 + H2O -> (CH2O)n + O2 (en presencia de luz y pigmentos verdes). 2. Originalidad e importancia de la fotosíntesis. Originalidad de la fotosíntesis Único proceso biológico que permite utilizar la energía luminosa y transformarla en energía química y que devuelve oxigeno a la atmósfera contrarrestando los procesos respiratorios de los seres vivos. Procesos: 1. Transformación de la energía luminosa en energía química: ATP y NADPH (poder reductor). 2. Síntesis de moléculas orgánicas complejas reducidas muy energéticas a partir de moléculas inorgánicas sencillas oxidadas, poco energéticas y muy abundantes: CO 2 y H2O. 3. Oxidación-reducción: donador (H2O) -> aceptor en contra de gradiente de potencial, gracias a la energía de la luz. Importancia: - Produce O2: mantiene constante la concentración atmosférica. - Consume CO2 que se produce en la respiración y combustiones. - Transforma la energía luminosa en energía química necesaria para los procesos vitales - Produce materia orgánica necesaria para la nutrición de los ssvv heterótrofos siendo la base de la red trófica y el punto en el que se cierran los ciclos de los elementos. Durante el día las plantas hacen fotosíntesis, pero durante la noche no. Esto es debido a que no hay luz, por lo que no funciona ni la enzima rubisco para fijar C ni la cadena de transporte de electrones de los tilacoides. La respiración de las plantas ocurre tanto de día como de noche. Existen diferentes tasas de intercambio de gases: durante el día se consume mas CO 2 y se libera mas oxigeno (predomina la fotosíntesis frente a la respiración) mientras que por la noche al no haber luz solo se consume oxigeno y se libera CO2. La fotosíntesis neta por tanto va a depender de la tasa respiratoria. No pueden ocurrir eficientemente ninguno de los 2 procesos a no ser que haya una absorción de agua eficiente por las raíces. Además, se necesita de absorción de nutrientes como Fe, Mn, Cu… Se necesitan todos estos procesos para una eficiencia fotosintética y una traducción de esta en el crecimiento vegetal. 3. La ecuación global de la fotosíntesis CO2 + H2O -> CH2O + O2 (luz y clorofila) 3.1. Procedencia del oxígeno en la fotosíntesis Se descubrió que el oxígeno provenía de la fotólisis del agua gracias a un experimento realizado por Ruben y Kamen, que marcaron el isótopo 18 del oxígeno y comprobaron que todo el O 2 provenía del H2O y no del CO2. 3.2. Primer producto de la fotosíntesis La técnica de cromatografía en papel y la disponibilidad de CO2 marcado con C14 hicieron posible el estudio de la asimilación de CO2. 1 Calvin, Benson y Bassham, con suspensiones de un alga las exponían a 14CO2 y a periodos de luz cada vez más cortos. Detenían el proceso y sometían el extracto a cromatografía bimidensional en papel y autorradiografía. Cuanto menor sea el tiempo de exposición a la luz, menos tiempo ha dado a que el CO2 se asimile en forma de compuestos orgánicos. Por eso a mayores tiempos se obtenían aa y grandes azucares marcados y a tiempos bajos solo azucares pequeños (ácido 3-P glicérico). Gracias a este experimento lograron establecer el Ciclo de Calvin. 3.3. Etapas de la fotosíntesis Hill definió la existencia de 2 etapas utilizando un aceptor endógeno de e- en una suspensión de cloroplastos aislados. Tras la iluminación observo que los e- del agua se transferían al aceptor exógeno, reduciéndolo y desprendiendo O2 (fotooxidación del H2O). La reacción se llevó a cabo en ausencia de CO 2. 1) Fase luminosa o fotoquímica: 2 H2O + 2X -> O2 + 2H2X (en presencia de luz y clorofila). X representa un aceptor endógeno de e- y H+. 2) Fase bioquímica: 2H2X + CO2 -> CH2O + 2H2O + 2X Ochoa descubre la naturaleza del aceptor endógeno y de la energía química: NADP. Ornon define las 2 fases de la fotosíntesis. Etapa fotoquímica: caracterizada por la fotólisis del agua, formación del poder reductor y poder energético y desprendimiento de oxigeno. El agua cede sus electrones al NADP formando NADPH. Interviene la luz directamente. - Rápida. - Dependiente de la luz. - No dependiente de la Tª: en un rango de temperaturas en transporte de electrones no se ve inhibido. - Ocurre durante el día en la membrana de los tilacoides. Fijación fotosintética del CO2/ asimilación del carbono: se utiliza el NADPH y el ATP para reducir el CO2 inorgánico hasta C orgánico. - Lenta - Dependiente de la temperatura: debido a que las enzimas tienen una T óptima de actuación. - No dependiente directamente de la energía de la luz. - Si depende de la luz para la activación de las enzimas (RUBISCO). - Ocurre durante el día. Ambas etapas son dependientes de la luz, una de forma directa y otra para que funcione la enzima rubisco y esté activa. ¡! La 1ª etapa es muy rápida ya que el transporte electrónico es muy rápido y sin embargo el enzimático es más lento. 4. El aparato fotosintético de plantas superiores: El cloroplasto Tipos de aparato fotosintético: - Bacterias fotosintéticas y algas Verdi-azuladas (cianofíceas): laminillas mas o menos paralelas en la parte mas externa del citoplasma (ectoplasma), pero no existe membrana de separación con el resto del citoplasma. No es un verdadero orgánulo. - Algas verdes y algunas bacterias: poseen aparato fotosintético diferenciado con la membrana que lo separa del resto de la célula denominado cromatóforo. Hay 1 o 2 por célula, de gran tamaño y forma variada. - Algas rojas y pardas: son las especies más evolucionadas de las algas, ya poseen verdaderos orgánulos fotosintéticos (rodo- y feoplastos, respectivamente). De pequeño tamaño, lenticulares y en gran nº por célula. - Plantas superiores: cloroplastos. 2  T3 – Aparato fotosintético 1. Tipos de plastos en plantas superiores Proplastidios - Son los precursores del resto de los plastos. - Están presentes en las regiones meristemáticas (20 por célula); en las células meristemáticas. Esto es porque son plastos indiferenciados. - Contenido interno del proplastidio se denomina estroma, es muy denso con depósitos de fitoferritina. - Sistema de membranas interno muy poco desarrolladas y poco organizadas. Amiloplastos: Plastos que carecen de pigmentos y que contienen gran cantidad de gránulos de almidón. Proteoplastos o preteinoplastos: acumulan proteínas. Oleoplastos: acumulan lípidos y ácidos grasos. Leucoplastos: Son plastos incoloros y su función es la síntesis de monoterpenos. Etioplastos: Plastos muy similares a los cloroplastos y se considera el estado intermedio entre proplastidios y cloroplastos maduros. Sus membranas internas están empezando a organizarse. Cromoplastos: Similares a los cloroplastos, pero varían en el color (amarillos, naranjas o rojos) dependiendo de la combinación de los pigmentos carotenoides y xantofilas. Se pueden formar directamente de los proplastidios o a partir de los cloroplastos. Les dan color a las hojas. ¡! Casi todos los plastos se pueden formar a partir de proplastidios y de cloroplastos desdiferenciándose. Gerontoplastos: Sitte (1977) introduce este término para definir la transformación de los cloroplastos durante el proceso de senescencia. Plastos típicos de las hojas en senescencia (hojas que están degradándose). La formación del gerontoplasto a partir del cloroplasto implica: 1. Modificaciones estructurales y desorganización de las membranas tilacoidales. 2. Formación de numerosos plastoglóbulos que almacenan lípidos procedentes de los tilacoides. Las membranas internas al degradarse forman vesículas llamadas plastoglóbulos. 3. Degradación de la clorofila y pérdida de eficiencia fotoquímica. 4. Mantenimiento de las membranas que rodean al cloroplasto. Si a los gerontoplastos los pongo en contacto con las hormonas citoquininas se pueden revertir a cloroplastos funcionales. 1 SARK es un promotor que se induce en sequía y conduce la transcripción de un gen IPT (enzima clave en la biosíntesis de citoquininas). Cuando hay sequía se expresa el gen. Los genes que rodean al gen mutante pueden ser distintos dependiendo de en qué parte se inserta mi gen (el entorno genético es diferente en cada evento de transformación, se introduce en una parte diferente del genoma). Por esto tengo varias líneas diferentes. Dejo un periodo las plantas sin regar. Cuando vuelvo a regar las plantas silvestres siguen muertas pero las transgénicas al regarlas otra vez gracias al gen, reverdecen. Durante la sequía el promotor se ha inducido y se han estado produciendo citoquininas (porque está debajo del promotor inducido por sequía). Gracias a esta contínua síntesis de citoquininas, se ha evitado que mis cloroplastos se conviertan en gerontoplastos. Esto demuestra que las citoquininas evitan que los cloroplastos pasen a gerontoplastos. 2. Definición de aparato fotosintético. Estructura del cloroplasto. Definición: El aparato fotosintético es el lugar donde se realiza la captación de la energía luminosa y la síntesis de moléculas orgánicas reducidas (carbohidratos fundamentalmente). CLOROPLASTO EN PLANTAS SUPERIORES. Estructura del cloroplasto: Forma lenticular o elipsoidal, 5 x 2 μm - Envoltura: dos membranas (externa e interna) - Sistema de laminillas (lamelar): Granum (grana), laminillas granarías, tilacoides granales o apilados. Lumen (locus) intratilacoidal: espacio hueco dentro de los tilacoides. Laminillas intergranales o laminillas estromáticas, tilacoides estromáticos, tilacoides no apilados. - Estroma amorfo - ADN - Gránulos de almidón dentro del cloroplastos (no son amiloplastos!) Movimientos del Cloroplasto: los cloroplastos se pueden orientar, contraer y dilatar *Orientación que depende de la intensidad luminosa. Intensidad baja se orientan de forma perpendicular a los rayos. Intensidad elevada se orientan de perfil. Cuando hay poca luz se distribuyen de forma homogénea por la célula y si la intensidad es elevada se pegan a las paredes de la célula vegetal para que la luz que les llegue sea menor (evitan el exceso de luz: efecto negativo). *Contracción y Dilatación: Existencia en el cloroplasto de cloromiosina y cloroactina. Dilatación: aumenta la superficie del cloroplasto 2.1. Composición de los tilacoides: pigmentos, complejos proteicos, otros componentes. a) Gran cantidad de pigmentos, sobre todo clorofila a y b, y carotenoides. b) Proteínas que forman complejos con múltiples polipéptidos como los fotosistemas I y II, el complejo citocromo b6-f, y el complejo Cf0-Cf1 ATP sintasa, todos ellos anclados en la membrana tilacoidal, aunque con algunas porciones extrínsecas por la cara del lumen o del estroma. c) Transportadores de electrones y protones: plastoquinona, citocromos b y f, plastocianina y ferredoxina. 2 d) Lípidos (diacilglicéridos, fosfolípidos, galactoldiacilglicerol, etc) e) Carbohidratos: glucolípidos y muy pocas glucoproteínas f) Micronutrientes: Fe, Mn, Cu, Zn, Mo, y CI: - Cadena fotosintética de transporte de e-: Fe, Cu, Mn, CI - Asimilación fotosintética del C02: Zn y Fe (Mg) - Integridad del aparato fotosintético (SOD): Mo, Fe, Cu y Zn Estructura del sistema lamelar Paolillo (1970): varias laminillas estromáticas se unen con todos los tilacoides de un granum, todas ellas en espiral alrededor del granum, el modelo más complejo. Por cada tilacoide granario tengo un tilacoide intergranario que comunica con los otros tilacoides de otra grana. Todos los tilacoides de la grana están unidos a otros tilacoides de grana a través de tilacoides intergranarios (todos unidos con todos). Por tanto, solo existe un lumen. 1. LOS PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS - Son moléculas con capacidad para captar fotones gracias a que poseen numerosos dobles enlaces conjugados. - Están asociados a proteínas, formando complejos pigmento-proteína, en unión no covalente (al desnaturalizarse la proteína se liberan los pigmentos que se pueden separar por cromatografía). - Los más importantes son: clorofilas (a y b) y carotenoides (tienen la capacidad de captar la luz gracias a los numerosos dobles enlaces conjugados). Las clorofilas siempre están unidas a proteínas de forma no covalente (fácilmente liberables). - Máximos de absorción en el rojo y el azul. A) Clorofilas La molécula de clorofila está formada por un anillo tetrapirrólico (porfirina), en el cual se inserta un átomo de Mg (parecido a un grupo hemo). Además, las clorofilas poseen una cadena de 20 átomos de carbono hidrofóbica denominada cadena fitol unida a través de un ácido propiónico. Las diferencias entre clorofilas son los diferentes sustituyentes. - Tetrapirrol: Anillos I a IV (A, B, C, D). - Anillo V no pirrólico junto al anillo III (o C). - El anillo IV es un pirrol reducido, se une en la posición 7 con un resto propiónico esterificado con un fitol: cadena isoprenoide de 20 carbonos, de naturaleza hidrofóbica, el anillo porfirínico es hidrosoluble. Tiene 4 sustituyentes R1, R2, R3 y R4 y en función de lo que haya habrá una clorofila u otra. La cadena ácido propionico+fitol se une en R4 para dar una clorofila típica. 3 Síntesis de clorofilas La síntesis de las clorofilas comienza con el ácido aminolevulínico, al cual le ocurren unas reacciones hasta llegar a la protoporfirina-9. Dependiendo si se le une Fe o Mg en el anillo tetrapirrólico dará un grupo hemo o clorofilas. Llegamos a malonil protoclorofilida A, precursor en cloroplastos no maduros para convertirse en cloroplasto funcional cuando le llegue la luz (favorece la reducción del malonil a clorofilida a), gracias a la actividad de una enzima POR (NADPH-protoclorofilida oxidoreductasa). Gracias a la luz la protoclorofilida A pasa a clorofilida A. Ahora la clorofila sintasa coge los 20 átomos de C y los une al anillo porfirínico dando clorofila A. La clorofila a es el precursor de la B. POR es limitante en la síntesis de las clorofilas, realiza una reacción de fotoreducción dependiente de la luz asociada a una fotomorfogénesis (transformación del cuerpo prolamelar del etioplasto a la membrana tilacoidal del cloroplasto). POR es codificada en el genoma nuclear, peso molecular de 36 kD. Tres isoformas (plántulas y adultas): POR B, típica de las plántulas (cuando las semillas están germinando), la síntesis de clorofilas se da bajo la isoforma POR B y POR A, encargada de la síntesis de clorofilas en plantas adultas. ¡! La síntesis de clorofilas va asociada al paso de un cloroplasto no maduro a maduro. La actividad de la POR está asociada a la luz (necesita luz para estar activa). La POR actúa en presencia de luz, y sin ella, los cloroplastos no madurarán. * Mecanismo de Acción: Se une físicamente a la protoclorofilida y hace la reacción de reducción. 1. Complejo POR-protoclorofilida (etioplasto) 2. Luz: reducción de la protoclorofilida a clorofilida 3. Formación del complejo POR-clorofilida B) Carotenoides Son tetraterpenos con 40 átomos de carbono sintetizados a partir de dos moléculas de geranilgeranildifosfato (acetilCoA+gliceraldehido+piruvato). Pigmentos secundarios en la captación de luz y su función principal es evitar la fotoinhibición ante intensidades lumínica muy intensas, captando e- tanto de las clorofilas como de los propios ROS. Tienen muchos dobles enlaces que le dan capacidad de absorber luz. Son antioxidantes, ya que eliminan las ROS para evitar que la fotosíntesis se vea mermada. Síntesis de carotenoides Partimos del geranilgeranildifosfato y llegamos al β-caroteno o al alfa caroteno. El β-caroteno es un pigmento que evita que las clorofilas se fotoinhiban. Lo hace gracias al ciclo de las Xantofilas. 2. COMPLEJOS PROTEICOS DE LOS TILACOIDES FSII: 25 polipéptidos, en laminillas apiladas, intrínsecos, formado por: centro primario de reacción, polipéptidos con pigmentos (antenas), y complejo oxidador del agua. FSI: 13 polipéptidos, en laminillas no apiladas, polipéptidos con pigmentos (antenas) y centro primario de reacción. Citocromo b6-f: 7 polipéptidos, en laminillas apiladas y no apiladas, no capta luz, es transportador de e-. ATP sintasa o complejo CFO-CF1: en laminillas no apiladas, varios polipéptidos, CF1 extrínseco hacia estroma, CFO intrínseco. LHC I y II (light harvesting complex; antenas): varios polipéptidos con clorofila a y b, pigmentos accesorios, captan luz (antenas) no realizan fotoacto, LHCII son MÓVILES. LHCI están asociados al fotosistema I y LHCII al II. Están formados por clorofilas y proteínas, amplifican, recogiendo la luz para llevarla a los fotosistemas. Las antenas no realizan el fotoacto (separación de cargas). 4 Los complejos antena están asociados a los fotosistemas. Como consecuencia del transporte electrónico se genera un gradiente de protones que la ATP sintasa aprovecha para la síntesis de ATP. El PS II está mayoritariamente en las mb apiladas (verde oscuro) y menos en las mb no apiladas, también está en la cara externa de tilacoides apilados. El PS I está en tilacoides no apilados o en la cara externa del tilacoides apilados. Citocromo b6f está homogéneo. ATP sintasa debe estar en las zonas no apiladas debido a interacciones estéricas (no caben en la grana). Tienen que dar al estroma (también puede estar en la cara externa de tilacoides apilados). El hecho de que los PS y los LHCII estén posicionados en grana ayuda a que los tilacoides apilados continúen estándolo. 3. TRANSPORTADORES DE ELECTRONES Y PROTONES Componentes de los tilacoides que poseen la capacidad de poder ser sometidos alternativamente a oxidación y reducción: - Citocromos (f, b6 y b3 ó b559): Son compuestos con Fe (anillo porfirínico 1 con Fe central). Solo transportan electrones. - Plastocianina: Compuesto con 2 átomos de Cu, uno de los cuales puede intercambiar su valencia. Solo transporta electrones. Es azul debido al cobre. - Ferredoxina: sulfoferroproteína con Fe y azufre que también puede aceptar y ceder electrones. *Quinonas (plastoquinonas). Intervienen en el transporte de electrones y protones. Pasan de plastoquinona oxidada a reducida, debido a 2e- y 2H+. Importancia del potencial redox en la bioenergética vegetal - La fotosíntesis y respiración son fenómenos electroquímicos donde la energía libre se libera de forma controlada a través de reacciones de oxidación-reducción o reacciones redox. En estas reacciones se transfieren electrones y protones. Molécula donadora: capaz de reducir a otro compuesto porque cede los e-. Molécula aceptora: es oxidante ya que recibe los e-. ¡! Un compuesto está reducido cuando tiene e- y H+. Ej de par redox: NAD+ y NADH - Para que las reacciones redox ocurran de forma consecutiva en los procesos de Fotosíntesis y Respiración las moléculas deben de estar dispuestas según la capacidad que tengan en donar y/o aceptar e- o H+: POTENCIAL REDOX ESTÁNDAR (Eº'). · Disposición según su capacidad oxidante creciente. · Dirección del flujo de e- y/o H+ siempre es desde valores negativos a valores más positivos de potencial. · El par NAD+/NADH es oxidado fácilmente por el sistema piruvato/lactato, y así sucesivamente. ¡! El flujo de electrones siempre va de potenciales redox más negativos a más positivos. Los potenciales redox son los que permiten que se de la bioenergética vegetal. 5 El agua tiene un potencial redox de 0,7 y es el donador de e-, que viajan de esta hasta el NADPH. En condiciones normales el agua no podría cederle- al PSI debido a que su potencial redox es mayor, pero debido a la luz el P680 pierde 1e- y su potencial redox se hace + positivo, permitiendo que los e- del agua viajen hasta el P680. 2.2. Composición del estroma Es el líquido en el que está inmerso el sistema lamelar, y disuelto en él encontramos: Glúcidos: monosacáridos intermediarios del Ciclo de Calvin; otros como disacáridos o almidón. Lípidos, glucolípidos y galactolípidos, fosfolípidos, acilglicéridos y carotenoides. Aminoácidos, muchos sintetizados en el cloroplasto. Gran cantidad de enzimas: Ciclo de Calvin, la más abundante la rubisco (ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa) el 50% de la proteína soluble de la hoja. Ácidos nucleicos de todos los tipos: ADN: circular (parecido al de las bacterias), ARN ribosómico: ribosomas más pequeños (70 S), ARN de transferencia: unos 30 transferentes, ARN mensajeros: muy abundantes. 2.3. Composición y propiedades de las membranas. Funciones. Transportadores Membrana externa: Rica en galactolípidos, proporción de proteínas menor que la membrana interna, muy permeable. Parecida en composición a la mb plasmática eucariota. lnespecíficamente permeable a las pequeñas moléculas (canales proteicos: porinas) Membrana interna: Mayor proporción de proteínas, muy selectiva (transportadores), permeable al C02 y ácidos monocarboxílicos, no permeable a compuestos iónicos, sacarosa, hexosas, aminoácidos. Contiene la mayoría de transportadores, por lo que selecciona lo que entra en el cloroplasto. -Auténtica barrera selectiva del cloroplasto -Presencia de transportadores (propia del cloroplasto) -Membrana interna presenta mayor proporción de MGDG y carotenoides que la externa donde predominan los fosfolípidos -La membrana interna presenta el sistema enzimático para la síntesis de: oxylipinas (compuestos de defensa que actúan ante estímulos externos). Composición *Galactolípidos: MGDG: monogalactosildiacilglicerol, DGDG: digalactosildiacilglicerol, PG: fosfatidilglicerol 6 *Fosfolípidos: PC: fosfatidilcolina, PI: fosfatidilinositol. *Carotenos *Glucoproteínas Transportadores de la membrana interna 1. Transportador de triosas-P/Pi: Exporta carbono asimilado. 2. Transportador de dicarboxilatos: "lanzadera" de dicarboxilatos, ácidos dicarboxílicos de 4 o 5 átomos de carbono, (malato, aspartato, succinato y 2-oxoglutarato). Exporta poder reductor 3. Transportador de PEP/Pi: especialmente importante en plantas C4 4. Transportador de G6P/Pi: importa G6P en plastidios de tejidos no fotosintéticos para síntesis de almidón 5. Transportador de glucosa 6. Transportador de adenilatos Transportadores específicos de iones - Cadena fotosintética de transporte de e-: Fe, Cu, Mn y Mg - Asimilación fotosintética del C02: Zn, Fe y Mg - Integridad del aparato fotosintético (SOD): Fe, Cu y Zn - Transportadores tipo ABC - Permeasas que realizan un cotransporte de solutos y nutrientes con H+ (dependientes -PATPasa) - Transportadores específicos de cationes - Transportadores de fosfatos y ácidos dicarboxílicos 2.4. Formación de cloroplastos En las células meristemáticas hay proplastidios, que pueden replicarse y tienen el mismo material genético que los cloroplastos. Los proplastidios, en presencia de luz, se transforman en cloroplastos. En ausencia de luz forman un cuerpo prolamelar que, en presencia de luz, puede evolucionar a sistema lamelar. Los cloroplastos (y mitocondrias) se dividen independientemente de la división de la célula. Para ello dependen de una proteína de origen nuclear. Los etioplastos contienen protoclorofilida y membranas tubulares que forman el cuerpo Prolamelar. A los pocos minutos tras la exposición a la luz, se diferencia en cloroplastos, el cuerpo prolamelar se transforma en tilacoides y la protoclorofilida en clorofila. El protoplasto con luz evoluciona a un cloroplasto maduro con grana. Si no tiene luz formará un etioplasto con los cuerpos lamelares desorganizados (sin grana). Si le doy pulsos de luz al etioplasto, podrá evolucionar hasta un cloroplasto maduro. 3. Origen evolutivo del cloroplasto. El genoma del cloroplasto Teoría endosimbiótica: Células eucarióticas fagocitaron procariotas fotosintéticos iniciando una simbiosis. Con el tiempo el procariota perdería potencialidades y se especializó en la función fotosintética. Transferencia de genes del procariota al núcleo de la célula eucariota hospedadora. El organismo fotosintético podría ser una cianobacteria que son los fotosintéticos más antiguos conocidos. Pruebas: Genoma similar al de procariotas, Ribosomas del tipo 70S, Doble membrana, la externa análoga a membrana plasmática pero más permeable, el genoma de Arabidopsis thaliana codifica 800 proteínas homólogas de cianobacterias, aproximadamente 3000 proteínas de origen nuclear funcionan en el cloroplasto, maquinaria que transporta las proteínas al interior del cloroplasto (TIC y TOC). 7 Casi todo el ADN del cloroplasto ha llegado al núcleo celular y por esto el núcleo es capaz de controlar la división de estos, ya que la síntesis de muchas proteínas es controlada por él. Transferencia de genes del procariota al núcleo de la célula eucariota hospedadora permite que las proteínas sintetizadas por el núcleo funcionan en el interior del cloroplasto. La rubisco no es funcional sin las proteínas que vienen del núcleo. TIC y TOC son GTP asas, que con gasto de ATP transportan proteínas hacia el interior del estroma. El genoma del cloroplasto: *ADN circular (similar a bacterias), entre 1130.000 y 160.000 pares de bases, 120 genes, 108 kDa, Doble hebra, unos genes están codificados en la hebra A leída en sentido contrario a las agujas del reloj, y otros en la hebra B leída en sentido de las agujas del reloj, Dos regiones: - genes no repetidos, dividida en larga y corta (LSC y SSC) - genes repetidos, región duplicada (Ir A e IR B). Existen genes que si se leen hacia un lado codifican un gen y si se leen hacia el otro codifican otro gen distinto. 8  T4 – Formación fotoquímica del poder reductor 1. Utilización de la energía luminosa en la fotosíntesis 1.1. Naturaleza de la luz Radiación electromagnética que es percibida por nuestra retina, es visible. De la radiación emitida por el Sol sólo una pequeña parte corresponde a radiación visible. Hay λ mayores que las de la luz roja, que no afectan a la retina, ondas infrarrojas o las ondas de radar, TV, radio. Hay λ más pequeñas que las de la luz violeta que tampoco son visibles, pero que son peligrosas, porque pueden dañar a las células: rayos ultravioleta, rayos X y rayos γ. Toda esta escala de radiaciones, incluyendo las visibles se conoce como espectro electromagnético. Dentro de los colores del espectro visible, los que tienen mayor longitud de onda (rojo), tienen menor frecuencia y transmiten menor energía, mientras que los de menor longitud de onda (violeta), mayor frecuencia y mayor energía por fotón. 2. Reacciones fotoquímicas iniciales 2.1. Estados de excitación de las moléculas de pigmento El proceso de la fotosíntesis se inicia al captar los pigmentos fotosintéticos la energía de la luz incidente sobre el cloroplasto, energía que es utilizada para lograr una excitación que provoca una oxidación (cesión de e-) de los pigmentos fotosensibles. En una molécula los electrones (2e-) tienden siempre a ocupar los orbitales de menor energía ("estado fundamental o estable"), existiendo la posibilidad de orbitales de más alta energía que la del estado fundamental, los cuales permanecen desocupados. Un orbital ocupado contiene siempre 2e- que cumplen la ley de tener sus spines antiparalelos ya que 2e- con spines paralelos no pueden coexistir en el mismo orbital. El suministro de energía exógena hace que los e- puedan pasar a un orbital de mayor energía. Así, se pueden dar varios casos posibles de ocupación de orbitales por los e- de una molécula: - Estado fundamental o estable, los e- están en estado de singlete. - Cuando los e- ocupan un orbital de mayor energía se habla de estado de singlete excitado (primer singlete, segundo siglete...) - Orbital de mayor energía el e- revierte su dirección: estado de triplete: se da en espines paralelos. Vías de retorno al estado basal: - De segundo singlete a primer singlete es mediante pérdida de calor. - De primer singlete a estado basal: la energía se dispersa en forma de calor, en forma de fluorescencia o se puede utilizar la energía para fotosensibilizar a los pigmentos accesorios (pasar la energía a una clorofila que esté cerca). - De estado triplete a estado basal: su energía puede disiparse en forma de calor, fosforescer (diferente a fluorescencia) o que la energía se invierta en fotosensibilizar a los pigmentos principales. 1 La longitud de onda empleada para llegar al 2º singlete debe ser menor (mayor energía) que la empleada para llegar al 1er singlete. Estas longitudes de onda coinciden con el azul y el rojo. Cuando una clorofila se excita con luz azul sus e- caen en el 2º singlete y si se excita con luz roja cae en el 1er singlete. Todos los carotenoides y clorofilas tienen los máximos de excitación en el entorno del rojo y del azul. Cada clorofila tiene sus máximos de absorción a diferentes longitudes de onda (aunque todas estén en el entorno del rojo y azul). Por tanto, en el rango de la fotosíntesis los rangos óptimos son entre 400-500nm y 600-700nm. 2.2. Reacciones de fotosensibilización: papel de los pigmentos fotosintéticos Pigmentos accesorios: antenas extrínsecas de los fotosistemas (LHCI y LHCII) y pigmentos que forman parte de las antenas intrínsecas de los fotosistemas. Pigmentos principales: pigmentos de los centros de reacción de los PS; P680 del PSII y P700 del PSI. Reacciones importantes desde el punto de vista fotosintético, ya que son la únicas donde la energía luminosa captada por una molécula de pigmento puede ser cedida a otras moléculas ya sean de pigmento o no. Las radiaciones luminosas eficientes en la fotosíntesis son la azul y la roja. Esto es porque la clorofila absorbe estos dos tipos de radiaciones luminosas. Espectro de absorción de la clorofila: 2 máximos de absorción. Todos los pigmentos (en especial la clorofila a) llevan a cabo reacciones de fotosensibilización, cediendo energía de excitación a otras moléculas vecinas de pigmento (LHCI, LHCII ó en las antenas de los fotosistemas). Fotosensibilización de los pigmentos accesorios. Pero solo algunas moléculas especiales situadas en el centro de reacción de los fotosistemas (P680 [FSII] y P700 [FSI], Complejos de proteínas y clorofila a pueden utilizar la energía captada para llevar un e- al estado de triplete y realizar una separación de cargas, cediendo sus e- a otras moléculas que no son pigmento, iniciándose así un transporte de electrones. Fotosensibilización de los pigmentos principales. 2.2.1. Fotosensibilización entre “pigmentos accesorios” La transferencia de energía luminosa captada por los pigmentos accesorios que forman los complejos LHC y antena sólo es posible si se cumplen los siguientes requisitos: a) Que las moléculas de pigmento estén a la distancia y en la ordenación adecuadas (< 1OOÅ) b) Proceso de Resonancia Inductiva también llamado Transferencia Foster o Transferencia de resonancia. Cuando la clorofila recibe luz, sus e- saltan a estados excitados. La energía la transmite a otra clorofila cercana. Si la clorofila no está a la distancia adecuada se pierde en forma de fluorescencia o calor. 2 Proceso de Resonancia Inductiva Mecanismo por el que no se transmiten cargas sino sólo energía que operaría de la siguiente forma: El electrón excitado de la molécula de pigmento que ha captado la energía luminosa volvería desde su orbital energético a su estado fundamental, transmitiendo la energía de excitación a través de vibraciones a una molécula vecina de pigmento, que elevaría uno de sus electrones a un orbital superior y que al descender cedería a su vez la energía a otra molécula vecina de pigmento, así sucedería hasta que la energía de excitación alcance al centro de reacción. Eficiencia del proceso es de 80-90%: alguna se pierde (calor). En este proceso de resonancia inductiva es muy importante que el espectro de transmisión de la molécula de pigmento que emite se solape con el que recibe y que el máximo de esta última sea de mayor longitud de onda. Como en el proceso de transmisión de energía siempre se pierde algo en forma de calor la energía transmitida al inicio debe de ser mayor que la del final, por eso en la periferia de las antenas se encuentran los pigmentos que captan λ más cortas, pero más energéticas (carotenoides - chl b - chl a). 2.2.2. Fotosensibilización entre “pigmentos principales” Los pigmentos principales (P680 y P700), son complejos de clorofila a y proteínas que forman el centro de reacción de los Fotosistemas y que gozan de una disposición especial en el cloroplasto que les permite captar energía transmitida por los pigmentos del LHC y de la antena. La energía luminosa transmitida por los pigmentos accesorios produce un proceso denominado: fotoionización de la molécula de chl a, es decir un estado excitado en el que el electrón alcanza el estado de triplete y no vuelve a su estado fundamental, sino que sale de la molécula de clorofila a un aceptor. Posteriormente, el pigmento oxidado estará en condiciones de aceptar un electrón de un donador. P680 y P700 actúan como un dipolo, en un extremo como reductor (cede e-) y en el otro extremo como oxidante (acepta e-, para reponerse). Estas clorofilas especiales del P680 o P700 pueden perder 1e- porque le excite la luz o por la energía que proviene de la resonancia inductiva de los pigmentos accesorios. Lo especial es que el e- pasa a estado de triplete y se cede a otra molécula (que no es un pigmento). Este paso del e- se llama fotoacto. ¡! En todo caso lo que se está transfiriendo es energía debida a la excitación de los e-. Los únicos que ceden e- son las clorofilas de P680 y de P700. 3. Transporte fotosintético de electrones * Características de la fase fotoquímica: es la 1ª Etapa de la fotosíntesis, se lleva a cabo en la membrana de los tilacoides, desprendimiento de oxigeno, acumulación de H+ en el lumen o espacio intratilacoidal, transporte de e-a través de los tilacoides, transformación de la energía luminosa en energía química (ATP, NADPH), dependiente de la luz, independiente de la Tª y etapa más rápida. 3 La actuación en serie de los dos fotosistemas se descubrió gracias al efecto Emerson: Suministrando luz de dos longitudes de onda (rojo + rojo lejano) se obtiene una tasa de fotosíntesis mucho mayor que la suma de las tasas obtenidas aplicando cada una de las longitudes de onda por separado. Si a un cloroplasto le pongo luz roja lejana, tiene una tasa fotosintética. Si incido con rojo, es otra tasa. Si incido con ambas, la tasa fotosintética es mucho mayor que la suma. Esto es debido a que estoy poniendo el máximo de absorción de ambos fotosistemas. El P680 trabaja óptimamente a 680 y el P700 a 700 aunque son capaces de trabajar también a longitudes de onda cercanas. La velocidad de fotosíntesis o eficiencia fotosintética se puede medir por desprendimiento de oxígeno o consumo de CO 2. La representación del transporte electrónico fotosintético en función de los potenciales redox de cada transportador es lo que se conoce como Esquema en Z o Esquema de Hill y Bendall. Por tanto, la cadena de transporte electrónico completa es: 2H20 → Mn4 → Tyrz → P680 → Cla → Feo → QA → Fe2+ → QB → Citb6-f → Pc → P700 → Cla → A0 (Cla) → A1 (Vit K1) → Fx → (4Fe-4S) → FA (4Fe-4S)FB (4Fe-4S) → Fd → FNR → NADP Esta cadena de transporte electrónico corresponde al denominado flujo acíclico de electrones que da lugar a la formación de poder reductor NADPH y ATP. El transporte de electrones desde el FSII al Cit b6f por la quinona se asocia con un transporte de protones hacia el lumen. Pero también puede ocurrir un flujo cíclico de electrones alrededor del FSI en el cual la energía luminosa recibida por el FSI da lugar a la acumulación de protones en el lumen y, por tanto, a la formación de ATP, pero no se genera NADPH (poder reductor). TRANSPORTE ELECTRÓNICO EN EL FSII El donador primario de electrones del centro de reacción del FSII, denominado P680, está constituido por dos clorofilas de tipo a, que son capaces de ceder un electrón y formar un catión P680+. Los electrones cedidos por el donador primario P680 siguen una cadena de transporte electrónico, que en el caso del FSII, en el lado aceptor, consta de los siguientes transportadores: P680 → Cla → Feo → QA → Fe2+ → QB → PQ - Feo es la feofitina, que tiene un grupo tetrapirrol análogo al de la clorofila, pero que carece del Mg central. - QA es una quinona fija. 4 - Fe2+ es un hierro no hemínico que actúa entre las dos quinonas. - QB es una quinona móvil que, cuando se reduce se intercambia con el "pool" de quinonas móviles que se encuentra en la membrana del tilacoide (PQ). La quinona se une con dos protones del estroma, quedando como PQH2. Todos los genes del fotosistema II se identifican como psb o lhcb. La fotólisis del agua Un fotón de luz o la energía que viene a través de las antenas excita al P680 y hace que pierda su e-, cediéndolo a la cadena transportadora de e-. La fotólisis del agua consiste en reponer estos e- mediante la rotura de dos moléculas de H20, que ocurre en el complejo oxidador del agua, interviniendo un grupo de 4 átomos de Mn. También se necesita Cl- y Ca++. El manganeso se oxida etapa a etapa: cada fotón hace que se transporte un electrón hacia el P680, y tras captarse cuatro fotones, el grupo de Mn alcanza el estado de máxima oxidación (Mn4 4+). Entonces ocurre la rotura de dos moléculas de H 20, en una reacción muy rápida y difícil de analizar que produce 4 H+, cede 4 e- al grupo de Mn que recupera su estado basal S 0, y se forma una molécula de O2 que se desprende. Los H+ pasan al lumen, ayudando al gradiente. Así, la clorofila cubre sus e- de manera secuencial gracias al cluster de manganeso y este recupera sus e- en una vez gracias a la rotura de las moléculas de agua. Los e- no van directamente del cluster al P680 sino que pasan a través de una tirosina Z. Tras la transferencia del electrón a la feofitina, el P680+ recibe un electrón de la cadena de transporte electrónico del lado donador, que en el FSII está formada por: 2 H 20 → Mn4 → Tyrz → P680 - Tyrz es un aminoácido (el 161) tirosina de la proteína D1 (donde se localiza la cadena de transportadores del FSII) - Mn4 es un grupo ("cluster") de átomos de manganeso - 2H20 representa 2 moléculas de agua, el donador primario de electrones, que darán 4 electrones. Por tanto, la cadena de transporte electrónico completa del FSII es: 2 H20 → Mn4 → Tyrz → P680 → Cla → Feo → QA → Fe2+ → QB TRANSPORTE ELECTRÓNICO EN EL COMPLEJO CITOCROMO b 6f Entre el FSII y el FSI se encuentra otro complejo multiproteico, denominado complejo Citocromo b6f, que es el que transfiere los electrones desde la plastoquinona (PQ) que se reduce en el FSII hasta la plastocianina (PC) que es la que reduce al P700 del FSI. En este complejo existen dos sitios de unión con la plastoquinona, denominados sitio Q p (z) donde se oxida, y Qn (c) donde se puede reducir. Además, este complejo contiene tres transportadores de electrones: un centro 4Fe-4S, un citocromo f y un citocromo b6+. El Ciclo Q o ciclo de las quinonas consiste en la sucesiva reducción y oxidación de la plastoquinona. Las plastoquinonas reducidas procedentes del FSII se oxidan en el sitio Q p. El proceso ocurre de la siguiente manera: - Una plastoquinona reducida (PQH2) se une al sitio Qp (z) cediendo los dos protones al lumen intratilacoidal, un electrón al centro 4Fe-4S y otro electrón al citocromo b6, quedando oxidada. 5 - El centro 4Fe-4S cede un electrón al citocromo f que, a su vez, lo cede a la plastocianina que queda reducida. - Una quinona oxidada se une al sitio Qn (c), recibiendo un electrón del citocromo b6 y un protón del estroma, quedando como PQH (semiquinona, quinona con solo 1e-). - Otra plastoquinona reducida se une al sitio z (Qp) y se repite el proceso, quedando la semiquinona que se unió al sitio n reducida, en forma de PQH2+ (coge 2H+ del estroma). Esta plastoquinona reducida vuelve a repetir el proceso. A la quinona móvil se le designa QB cuando está dentro del PSII y PQ es cuando está en el entorno del citocromo b6f. CICLO DE LAS QUINONAS: En el sitio Qp se oxida la PQH2 procedente del FSII, y la PQ oxidada se puede reducir de nuevo en el FSII o también se puede reducir en el sitio Qn del citocromo b6- f. La plastoquinona que está reducida y se ancla al sitio Qp puede venir del PSII o del sitio Qb. Es decir, se pueden utilizar plastoquinonas provenientes de cualquier sitio. TRANSPORTE ELECTRÓNICO EN EL FSI En el FSI el donador primario de electrones del centro de reacción es el P700 (dímero de clorofilas a). La cadena de transporte electrónico completa del FSI es: Pc → P700→Cla→ A0 (Cla) → A1 (Vit K1) → Fx (4Fe-4S) → FA (4Fe-4S)FB (4Fe-4S) → Fd → FNR - A0 es una clorofila a y, posiblemente, recibe los electrones del P700 a través de otra clorofila a (Cla) - A1 es una vitamina K1 - Fx, FA y FB son centros sulfoférricos tipo Rieske, con 4 átomos de Fe y 4 átomos de S - Fd es una ferredoxina - FNR: Ferredoxina-NADP+ reductasa Es el P700 el que realiza el fotoacto (desprende un electrón al recibir la energía de un fotón quedándose cargado positivamente y cediendo dicho electrón a la cadena transportadora de electrones). Recordemos: alrededor del FSI se puede producir el flujo cíclico de electrones si la ferredoxina reducida cede sus electrones al Cit b6f en lugar de hacerlo al FNR. En este caso no se reduce NADP, pero sí se acumulan protones en el lumen para formar ATP. El resultado final es la formación de poder reductor y fotofosforilación. En la etapa fotoquímica la energía de la luz se aprovecha en: - Reducir la ferredoxina y el NADP a NADPH, que se utilizará en la etapa de asimilación del C0 2. El poder reductor se almacena en forma de ferredoxina y NADPH. - Formar ATP a partir de ADP y Pi, molécula implicada en todas las reacciones metabólicas que requieren energía. 6 Fotofosforilación: Formación de ATP a partir de ADP y Pi mediante la energía luminosa. Donador primario del PSII: P680 Donador primario al PSII: agua Donador primario del PSI: P700 Donador primario al PSI: plastocianina 4. Estructura de los componentes del transporte electrónico fotosintético 4.1. El fotosistema II. Fotolisis del agua El fotosistema II fue aislado y cristalizado por Mitchell y colaboradores. Desde el punto de vista estructural es un complejo de proteínas y pigmentos incluido en la membrana tilacoidal que, por su función, se puede denominar agua-plastoquinona óxido-reductasa. Core: proteínas D1 (TyrZ) y D2. Antenas: - Intrínsecas: CP43 y CP47 (dentro del core, atraviesan la mb). - Extrínsecas: LHCII móviles: LHCB1 y 2. Se mueven en respuesta a cambios de factores ambientales: intensidad luminosa. Forman trímeros sin mezclarse. LHCII fijas (LHCB3-6). Complejo fotolisador del agua: cluster de Mn asociado a las proteínas O, P y Q. Están mirando hacia el lumen. Está constituido por numerosos polipéptidos, se conocen más de cuarenta (a parte de los complejos de antena o antenas extrínsecas, LHCII). Muchos de ellos son proteínas intrínsecas de membrana. Por el lado del lumen hay tres proteínas extrínsecas (proteínas O, P, y Q) que forman el complejo oxidador del agua, conteniendo el grupo de átomos de Mn. 4.2. Citocromo b6-f Es el intermediario del transporte electrónico entre el FSII y el FSI, no realiza fotoacto. Oxida a la plastoquinona reducida procedente del FSII y reduce a la plastocianina que se oxidará en el FSI. Es intrínseco a la membrana y está formado por 7 subunidades polipeptídicas, 4 mayores que contienen citocromos y un centro Fe-S, y tres menores. También hay una molécula de clorofila a de función desconocida. También puede recibir electrones de la Ferredoxina reducida en el FSI, ocurriendo en este caso el flujo cíclico de electrones. En este caso, la energía de la luz da lugar a la formación de ATP, pero no de NADPH. Por tanto, este complejo interviene tanto en el flujo acíclico como en el flujo cíclico de electrones. En cianobacterias, este complejo interviene tanto en fotosíntesis como en la respiración, realizando en este caso una función análoga a la ubiquinona- citocromo c oxidorreductasa de las mitocondrias. Formado por citcromo b, citromo 6 y citocromo f, proteína Rieske. 7  4.3. Fotosistema I Por su función enzimática se puede denominar plastocianina-ferredoxina óxido-reductasa. Se destacan dos polipéptidos grandes, PsaA y PsaB de 83 y 82 kDa respectivamente, formando un heterodímero (núcleo del FSI). Contienen el P700 (dímero de clorofila a), los cofactores que intervienen en el transporte electrónico: AO (clorofila a), A1 (vitamina K1) y FX (centro 4Fe-4S) y contiene otras moléculas de clorofila a y carotenos (transmiten la energía al P700). Por tanto, en el fotosistema 1 las funciones de centro primario de reacción (análogas a las proteínas D1 y D2 del FSII) y antenas del centro primario de reacción (análogas a CP47 y CP43 del FSII) se unen en estos dos polipéptidos. La proteína PsaC (8.9 kDa) está unida a PsaA y PsaB por el lado estromático. Contiene los cofactores redox FA y FB (dos grupos 4Fe-4S). Ceden los electrones a la ferredoxina. Las proteínas D, E, G y H son extrínsecas (al lado del estroma). La D (responsable de la unión con la ferredoxina). Las proteínas F y O son extrínsecas (lado del lumen). La F (responsable de la unión electrostática con la plastocianina). I, J, K y L son proteínas transmembrana más pequeñas. Los genes del PSI son psa. Core: PSaA y PSaB (hacen la función de las antenas intrínsecas, equivalentes a CP43 y CP47). Antenas: - Intrínsecas: PSIA y PSIB - Extrínsecas: LHCI (LHCA1-4). Son fijas. 4.4. Los complejos de antena (LHC) LHCII (asociado al FSII) Complejo proteico de origen nuclear (lhcb1- lhcb6). Lhcb1 y lhcb2 se organizan en trímeros formados por pigmentos y proteínas. Cada proteína presenta tres subunidades con un peso molecular de 24 - 29 kD. Cada subunidad presenta entre 12-15 mol de pigmento (chl a, chl b y xantofilas). Corresponden al 60% de los pigmentos presentes en el cloroplasto (mayor eficacia de captación de luz en zonas apiladas). Funciones: Adhesión a la membrana, antena recolectora y mecanismo de defensa: fotoinhibición (dentro del las LHCs encontramos xantofilas que evitan la fotoinhibición). Los PSII se asocian en forma de dímeros. LHCI (asociado al FSI) Complejo proteíco de origen nuclear (lhca1- lhca4) (17 - 25 kD). Presenta exclusivamente chl a y chl b, y carece de xantofilas (no presenta protección frente a la fotoinhibición). 15 - 20 % de pigmentos del cloroplasto 8  4.5. Otros componentes del aparato fotosintético Plastoquinona (anfipático): cabeza polar (anillo ceto-benceno), con dos grupos ceto (forma quinónica) que se reducen formando un difenilo (quinona reducida o quinol). La cola no polar le permite difundir bien por la bicapa lipídica. Proporción: 10 PQ/FSII. La plastoquinona reducida es plastoquinol. Plastocianina: es una proteína oxido-reductasa, pequeña (10 kDa), que presenta un átomo de Cu unido a cuatro aminoácidos, lo que le da color azul. Es extrínseca, soluble en agua, y se encuentra en el lumen. Ferredoxina: es también una proteína oxidoreductasa de 11 kDa, con un centro 2Fe-2S. Extrínseca por el lado del estroma, es soluble en agua, y reduce al FNR, a la nitrito reductasa, glutamato sintasa y tiorredoxina reductasa. FNR: Se denomina ferredoxina-NADP oxido-reductasa. Es una proteína de 35 kDa con un grupo prostético FAD ligado covalentemente. Interactúa con 2 ferredoxinas, pues necesita 2 e- y un H+ para reducir una molécula de NADP+. 5. Fotoinhibición y regulación del aparato fotosintético La fotoinhibición se define como una pérdida de la eficacia en la transformación de energía solar a energía química. Gran variedad de factores pueden inhibir el proceso fotosintético (se ve disminuida la producción de materia orgánica). Dos más importantes: el exceso de luz y los herbicidas. La luz en exceso que incide sobre la planta se ve disipada mediante calor y pudiendo formar especies reactivas del oxígeno debido a la interacción de los fotones excedentes con el oxígeno. Para eliminar estas especies existen carotenoides y superóxido dismutasa. El segundo mecanismo de protección es que el PSIID1 se daña y así cesa el transporte electrónico. Si el exceso electrónico es demasiado, se daña el polipéptido D1 y cuando cese el estímulo este se puede recuperar para volver a producir el transporte electrónico. Si no cesa la luz, se produce fotoinhibición definitivamente. Para prevenir este daño, las plantas adoptan estrategias de tipo anatómico y de tipo metabólico. Adaptaciones anatómicas al exceso de intensidad luminosa están: movimientos de las hojas, movimientos de los cloroplastos (en oscuridad están dispersos por la célula, cuando incide la luz están en perpendicular y cuando hay exceso de luz se posicionan en paralelo) y superficies de las hojas reflectantes, ricas en ceras o en sales. Estrategias de tipo bioquímico o metabólico incluyen: - Interrupción del flujo de electrones, por rotura y reparación del polipéptido D1. - Aumento de la fluorescencia: En respuesta a un exceso de luz o situaciones de estrés, las plantas pueden modificar la estructura de las antenas y aumentar la fluorescencia, aumentando así la disipación de energía. Se hace aumentando la distancia (>100 Armstrong) entre clorofilas. 9 - Interrupción de la transmisión de la energía fotónica (movimientos de los LHCI) - El Ciclo de las Xantofilas: consiste en una interconversión de las 3 xantofilas para disipar el exceso de energía que le llega a las clorofilas en forma de calor. Gasto en el proceso oxígeno y NADPH, así el exceso de e- no formará ROS ya que elimino el oxígeno y formo más NADP que es el aceptor de los e-. También se gasta ascorbato (antioxidante) que hay que regenerarlo - Flujos cíclicos de electrones alrededor del FSI: Otro mecanismo de disipación de energía, no se produce NADPH, pero sí se transportan protones hacia el lumen, produce ATP y disipa parte de la energía en forma de calor. Evita formación de radicales de oxígeno. Movimientos de los LCHII La distribución de FSII, FSI y LHCII varía en respuesta a la cantidad y calidad de la luz. FSII: zonas apiladas; FSI: zonas no apiladas Estado I: LHCII asociados al FSII a (activo) en zonas apiladas. La razón PQH2/PQ > 1 (es decir, cuando hay mucho transporte e- en el PSII). Intensidad luminosa alta hace que se acumule la forma reducida (plastoquinol), porque se reduce a más velocidad de la que se puede oxidar, entonces se activa una quinasa que fosforila los complejos LHCII, pasa al estado II. Una vez fosforilados pierden afinidad por el FSII y ganan afinidad por el FSI. 10 Estado II: LHCII unidos al FSI zonas no apiladas, aumenta la energía que recibe éste y se oxida el exceso de PQH2. Parte del FSII está inactivo (forma β). La razón PQH2/PQ < 1. Disminuye la actividad quinasa, LHCII se defosforilan y se desplazan hacia las zonas apiladas y se asocian de nuevo con el FSII, se pasa de nuevo al estado I. Flujo cíclico de electrones Cuando hay un exceso de e- no hay NADP suficiente para formar NADPH. La ferredoxina en vez de enviarlos a la FNR los envía a la ferredoxina-plastoquinona oxidoreductasa (Fox-PQ oxidoreductasa), que envía los e- al citocromo b6f. Así se introducen protones en el lumen pero no se produce NADPH. No se produce NADPH pero se transportan protones hacia el lumen, produce ATP y disipa parte de la energía en forma de calor. Evita formación de radicales de oxigeno. HERBICIDAS La fotoinhibición produce que las plantas mueran ya que no se puede producir la fotosíntesis; en esto se basan los herbicidas. Se detiene la fotosíntesis impidiendo la producción de ATP y NADPH. Estructura química de diclorofenildimetilurea (DCMU) y metil viológeno (paraquat), dos herbicidas que bloquean el flujo fotosintético de electrones. DCMU también se conoce como diuron. Detiene el flujo de e- desde el P700 hasta el NADP+. Sitios de acción de los dos herbicidas: DCMU bloquea el flujo de electrones a los aceptares quinonas del fotosistema II, compitiendo con QB. El paraquat actúa por aceptar electrones de los aceptores iniciales del fotosistema I. 11  T5 – Fotofosforilación 1. Introducción En la etapa fotoquímica la energía de la luz se aprovecha en reducir la ferredoxina y el NADP a NADPH y formar ATP a partir de ADP y Pi. La fosforilación fotosintética o fotofosforilación consiste en la síntesis de ATP a partir de ADP, Pi y energía libre recibida inicialmente en forma de luz: Historia de la Fotofosforilación: Ruben (1943) y Ochoa y cols indican la existencia de un compuesto fosforilado rico en energía de origen fotoquímico, independiente de las oxidaciones respiratorias, que intervendría en la asimilación fotosintética del C0 2. 2. Tipos de fotofosforilación Arnon en 1961 indicó dos tipos posibles de fotofosforilación: Fotofosforilación cíclica y fotofosforilación acíclica. 2.1. Fotofosforilación cíclica (FFC) Arnon (1954): Se acopla la vía de transferencia de electrones alrededor del FSI y no conduce a la formación de poder reductor ni a desprendimiento de oxígeno. FFC: solo produce ATP. 2.2. Fotofosforilación acíclica (FFA) Arnon (1958): Tiene lugar en el curso de la oxidorreducciones que van desde el H20 hasta la Ferredoxina pasando por lo tanto por el FSII y FSI. En la formación de ATP siempre se produce acumulación de poder reductor (NADPH) y desprendimiento de O 2, actuando el H20 como reductor inicial. 2.3. El papel de los diversos tipos de fotofosforilación en la fotosíntesis Otras vías de Formación del ATP Fosforilación oxidativa: acoplada al transporte electrónico mitocondrial. Fosforilación a nivel de sustrato: - Glucólisis: fosfoglicerato quinasa y piruvato quinasa - Ciclo de Krebs: succinil-CoA sintetasa. La fosforilación oxidativa y la fotofosforilación están acopladas a una cadena de transporte electrónico, pero entre ellas existen tres diferencias importantes: Fosforilación oxidativa (mitocondria) Fotofosforilación (cloroplasto) Crestas mitocondriales Membranas tilacoidales: zona no apilada Flujo de electrones va del NADH al H2O Flujo de electrones va del H2O al NADPH El proceso en la mitocondria no depende de luz Cloroplasto depende de luz 1 3. Mecanismo de la fotofosforilación 3.1. Teoría quimiosmótica de Mitchell Postula que la acumulación de H+ en el lumen, llevada a cabo durante el transporte fotoquímico de e-, representa un almacenamiento de energía libre. Dicha energía podría ser recuperada permitiendo el flujo inverso de los H+ a través de la membrana por un "espacio adecuado" (Complejo CFO-CFl ATP sintetasa). El paso de H+ por esta proteína produciría la fosforilación del ADP formando ATP. La acumulación de H+ en el lumen provoca un gradiente que tiene dos componentes cuya suma contribuye a lo que se conoce como: Fuerza Motora de los H+. La acumulación de H+ en el lumen (y el exceso de OH- en el estroma) provoca un gradiente de dos componentes: - diferencia de concentración o de pH a ambos lados de la membrana. - diferencia de potencial eléctrico entre el estroma y el lumen. Son aditivos, contribuyendo a lo que se conoce como fuerza motora de los protones: pmf = ΔpH + ΔE pmf= fuerza motora de los protones ΔpH= diferencia de pH ΔE= diferencia de potencial eléctrico Esta hace posible que un H+ que ha entrado en el lumen experimenta esta pmf que tiende a sacarlo de nuevo. El movimiento del protón hacia el estroma puede utilizarse para efectuar un trabajo, como, por ejemplo, la formación de ATP. Parece que cada 3H+ que salen hacia el estroma a través del Complejo CFO-CFl, se forma una molécula de ATP. 3.2. Lugares de conservación de la energía Se denominan sitios de acoplamiento o lugares de conservación de la energía a los puntos de la cadena de transporte electrónico en los que se produce transporte de protones hacia el lumen intratilacoidal en contra de gradiente. Ocurre en la fotolisis del agua, en la oxidación de las guinonas en el citocromo b6f (y en el citocromo b559 en FSII?). Lugares de conservación de energía: Sitios donde se produce la entrada o formación de H+ en el espacio intratilacoidal que van a ser los responsables de la formación de ATP - Fotofosforilación acíclica (FFA) (200 μmol ATP/mg chl/h): A nivel de la fotolísis del agua y a nivel del "pool" de plastoquinona (PQ). - Fotofosforilación cíclica (250 μmol ATP/mg chl/h): A nivel del "pool" de la platoquinona (PQ). 3.3. Complejo CF0-CF1 ATP sintetasa: composición, estructura y función Cuerpos globulares que sobresalen en las zonas no apiladas de los tilacoides hacia el estroma. Complejo CFO-CFl funciona como un enzima transportador de H+ y utiliza transporte de H+ para generar ATP. - Dominio CFO (100 kDa): componente intrínseco de la membrana. Canal pasivo conductor de H+. - Dominio CFl (400 kDa): componente extrínseco de la membrana. Lugar catalítico responsable de la síntesis de ATP. 2 CFO consta de 3 polipéptidos: - I y II actuarian ayudando a mantener la organización estructural y la cohesión entre CFO y CFl - III forma un canal hexagonal conductor de H+ a través de la membrana de los tilacoides. Además, funciona como rotor que permite girar a la subunidad CFI. CFI consta de 5 subunidades: alfa (55 kDa), beta (54 kDa) es el lugar catalítico de la síntesis de ATP, gamma (36 kDa) papel en la rotación de CFI, delta (20 kDa) actúa de interconexión con CFO y epsilon (lS kDa) inhibidora de la ATPasa. 3.3.1. Mecanismo de Boyer para la síntesis de ATP Hipótesis del cambio conformacional de los tres sitios catalíticos (Boyer, 1977) Las ideas actuales recogen la hipótesis conformacional de Boyer, sin desechar las ideas de Mitchell. Actualmente sabemos que el flujo de protones a través del dominio intrínseco de la ATP sintasa provoca un movimiento de rotación del eje formado por las subunidades c y la subunidad γ, pudiendo transmitir un cambio de conformación a la parte extrínseca que permite la formación del enlace entre el ADP y el Pi. En la parte extrínseca del complejo ATPasa, en cada subunidad β hay un sitio catalítico. Estos tres sitios catalíticos cambian de configuración, pasando cada uno sucesivamente por: - Estado de unión débil (L de "loose"): une el ADP +Pi - Unión fuerte (T de "tight"): forma el ATP - Apertura (O de "open"): libera el ATP. En cada subunidad C se transporta un protón y produce que la subunidad gamma rote. El giro de la subunidad gamma produce cambios de conformación de las subunidades beta. En una rotación completa se forman tres ATP Datos actuales parecen indicar que contiene 14 copias de la subunidad c. Cada subunidad c puede trasladar un protón a través de la membrana cada vez que gira el complejo. Esto indica que la estequiometría de protones transportados para formar ATP es 14/3, o 4,67. Los valores reales medidos de este parámetro son por lo general algo inferiores al teórico. El profesor Boyer dedujo la rotación, pero con la investigación bioquímica convencional no pudo demostrarlo. En 1997 el Prof. Yoshida y col. consiguieron la observación directa y filmarlo. Los resultados fueron publicados en la revista Nature en marzo de 1997. Experimento: usaron CF1 y unieron a la subunidad γ un filamento de actina fluorescente, para observarlo con el microscopio. Añadieron ATP y las condiciones para su hidrólisis. La rotación es al contrario de las agujas del reloj. 3 T6 – Fijación fotosintética del CO2: Ciclo de Calvin-Benson. Fotorrespiración 1. Introducción Características de la etapa de asimilación del CO 2: Más lenta que la fotoquímica, dependiente de la temperatura, no dependiente directamente de la energía de la luz, sí depende de la luz para la activación de las enzimas y ocurre durante el día (igual que la etapa fotoquímica) En la asimilación fotosintética de CO2 se aprovecha el poder energético (ATP) y el poder reductor (NADPH) formados en la etapa fotoquímica o luminosa, para la fijación y reducción del CO 2 con el resultado de la síntesis de hidratos de carbono: CO2 + 2 NADPH + 3 ATP → (CH2O) +2NADP+ + 3ADP+Pi +H2O. Calvin, Bassham y Benson describieron el ciclo de Calvin o ciclo C3. Se llama ciclo C3 porque en el primer compuesto que se sintetiza como consecuencia del Ciclo de Calvin es el ácido 3-P-glicérico (3PG). Se llaman plantas C3 porque la primera molécula que proviene de la fijación del CO2 atmosférico es el 3PG. Cromatografía sobre papel que separa los productos de la fijación del CO 2 después de la exposición de cultivos de Chlorella a 14CO2. Se exponen dos intervalos de tiempo de exposición (5 y 15 segundos), en los que se observa como el PGA (ácido fosfoglicérico) es el primer intermediario estable del ciclo de Calvin. 2. Fijación y reducción fotosíntetica del CO2 en las especies C3. Ciclo de Calvin El ciclo de Calvin se desarrolla en tres etapas: 1. Carboxilación, durante la cual el CO2 es unido por enlace covalente a un esqueleto carbonado gracias a la Ribulosa 1,5- Bifosfato (rubisco). 2. Reducción, en la que se forman precursores de los carbohidratos (gliceraldehido-fosfato) a partir de ácidos orgánicos (ácido 3- fosfoglicérico) y con la contribución del ATP y del NADPH. 3. Regeneración, en la que se vuelve a formar el aceptor de CO2 (Ru 1,5- BP) con gasto de ATP. Unas triosas fosfato sirven para regenerar el ciclo y otras para formar sacarosa (transporte de C) y almidón (reserva). Donde más se gasta el ATP es en la reducción. 2.1. La ribulosa bisfosfato carboxilasa-oxigenasa. Regulación de la rubisco Estructura de la rubisco: Consiste en 8 subunidades grandes idénticas (formando un octámero, L de 50-58 kDa) y 8 subunidades pequeñas (S de 12-18 kDa, formando 2 tetrámeros). Ensamblaje de la rubisco: Las subunidades S son codificadas por el núcleo, se sintetizan en el citoplasma y se importan al cloroplasto. Una vez en el interior del cloroplasto, el péptido de tránsito se separa de la subunidad S que queda lista para su unión con las demás subunidades (TIC/TOC). 1 Las subunidades L se sintetizan en el cloroplasto, y para su ensamblaje se tienen que activar mediante la unión a una proteína BP (binding protein). L + BP → L1BP12 → L*→ L8S8 ¡! Un proceso de regulación de la fotosíntesis es el ensamblaje de la rubisco. Características de la Rubisco: 550 Kda, actividad carboxilasa y oxigenasa, fijando oxígeno en vez de dióxido de carbono y produciendo una molécula de 3PGA y una de 2PG (fosfoglicolato). Tiene una Km= 10-15 μM para el CO2 no acepta CO3H-. Km = 250 μM para el O2. Presenta discriminación isotópica (prefiere el 12C al 14C). A concentraciones de CO2 atmosféricas prevalece la actividad carboxilasa. Actividad carboxilasa: RubP + CO2 → 2 3PGA Actividad oxigenasa: RubP + O2 → 3PGA + 2PG (2 fosfoglicolato, tóxico para la planta) Cataliza la carboxilación de la ribulosa bisfosfato con una molécula de CO2 para formar dos moléculas de una triosa, el ácido 3 fosfoglicérico. Regulación de la Rubisco: La rubisco debe activarse previamente, para lo que necesita: pH alcalino, una molécula de CO2 (distinta de la que se usará para la carboxilación), iones Mg++ y luz. Se forma el complejo ECM que es la enzima activa o enzima carbamilada. La reacción de activación es muy lenta y reversible. El grupo -NH3+ de la lisina 201 (en espinaca) del centro activo se une al CO2 (es decir, la rubisco se carbamila en el grupo lisina del centro activo) y éste al Mg formando carbamato de Mg. E + CO2 + Mg++ → [E- CO2- Mg++] (forma activa). A continuación, la enzima así activada, se une a ribulosa bisfosfato y a otra molécula de CO 2 y produce la catálisis: [E- CO2-Mg++] + RuBP + CO2 → 2 (3PGA) La rubisco se inactiva por unión con azúcares- fosfato (la propia ribulosa 1-5-biP o un análogo estructural) que se unan antes de su activación. Esto puede ocurrir antes de la carbamilación o después de la carbamilación. Para que vuelva a ser activa tiene que actuar la enzima rubisco activasa. Reactivación por la rubisco activasa La rubisco activasa es una enzima estromática, depende de la luz, es quinasa (por lo que requiere ATP, une un grupo P) y favorece la reactivación liberando el azúcar-P. La rubisco activasa está regulada por: la luz, cambios en la proporción ATP/ADP y un factor asociado al FSI, no se conoce. La rubisco se puede unir a azúcares-P antes o después de la carbamilación (activación). Si se le unen antes, actúan como inhibidores, aunque la rubisco activasa los elimina y activa la rubisco. También se puede unir después de la activación un azúcar-P análogo que actúa como inhibidor al no ser el sustrato. Vuelve a actuar la rubisco activasa. 2 *Factores que intervienen en la regulación de la rubisco 1. Proporción de gases (CO2 / O2). A mayor CO2, mayor actividad de la actividad carboxilasa y mayor fijación de este, y a mayor concentración de O2 más actividad oxigenasa, siendo la fotosíntesis menos efectiva. 2. RubP (no suele ser limitante, ya que suele haber suficiente cantidad) 3. La intensidad luminosa: activa transcripción de subunidad S (proviene del núcleo), regula ensamblaje de la Rubisco, produce pH alcalino, activa rubisco activasa, activa a la fosfatasa del CA1P (carboxiarabinitol 1- fosfato) que tiene un ciclo luz/oscuridad y aumenta [Mg++]. Durante el día la rubisco está libre de inhibidor ya que la rubisco activasa elimina los inhibidores, como el CA1P, al haber luz (rubisco activasa es dependiente de luz). La luz activa una fosfatasa que le quita el P al CA1P, formando CA1 que no puede unirse a la rubisco. Al llegar la noche la actividad fosfatasa no está y el CA1 pasa a CAP1, uniéndose al centro activo de la rubisco e inactivándola. 2.2. Ciclo de Calvin Balance del ciclo de Calvin: Por cada molécula de CO 2 fijado se gastan: 3 moléculas de ATP y 2 moléculas de NADPH. 3 CO2 + 5 H2O + 6 NADPH + 9 ATP → glyceraldehyde 3-phosphate + 6 NADP+ +3 H+ + 9 ADP + 8 Pi 2.3. Regulación del Ciclo de Calvin La regulación va encaminada a que el ciclo funcione sólo de día (cuando se produce ATP y NADPH en la etapa fotoquímica.): 1) Mecanismos de regulación de la Rubisco (ya visto) 2) La carga energética (razón ATP/ADP) regula la primera reacción de la etapa de reducción. 3) Sistemas reductores dependientes de la luz: las tiorredoxinas (son enzimas que regulan otras enzimas) que regulan a: Gliceraldehido 3P deshidrogenasa, fructosa 1,6-bisfosfatasa, sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa (Tdx f) y la fosforribuloquinasa (Tdx m). 3 Cuando están activas poseen grupos -SH de la cisteína que pueden oxidarse a puentes disulfuros S-S inactivándose (ocurre bajo condiciones de oscuridad cuando las concentraciones de algunos compuestos oxidados son elevadas (dehidroascorbato, GSSG). Activación en la luz gracias al funcionamiento de la cadena de transporte de e- a nivel de la Ferrodx. y la presencia de la enzima FTR (Ferrodoxina-tiorredoxina reductasa). Son proteínas ácidas de bajo peso molecular con un grupo -S-S- en continuo proceso redox. Están ampliamente distribuidas en muchas especies y en distintos orgánulos (cloroplastos y citosol...) y son codificadas por genes nucleares. La ferredoxina reducida activa a las tioferredoxinas trasfiriendo los e- desde ellas hasta las tiorredoxinas, formándose los grupos -SH. La tiorredoxina activará a las diferentes enzimas oxidándose y formando grupos -SH en la enzima diana. Este proceso está mediado por la luz para que las ferredoxinas estén en forma reducida. 2.4. Las vías de salida del ciclo de Calvin Cada vuelta del ciclo C3 da lugar a la síntesis de una molécula de triosa-P, por reducción de tres moléculas de CO2 fijado, que serán convertidas en glúcidos, lípidos, aminoácidos o proteínas. En condiciones normales, las rutas mayoritarias llevan a la formación de sacarosa y almidón. Las estructuras verdes de las plantas superiores orientan la mayor parte de su producción fotosintética a formar sacarosa, que es la forma exportable de hidratos de carbono (vía floema) a otros órganos no verdes. Otra vía importante puede ser la de acumular almidón en los amiloplastos o en los propios cloroplastos (gránulo de almidón), el cual en parte será degradado en la oscuridad para suministrar carbono y energía a las estructuras fotosintéticas cuando falta la luz. La sacarosa será la molécula que se exporta fuera de cloroplasto, mediante un transporte anti-porte de Pi. Cuando la triosa sale del cloroplasto entra Pi y si entra triosa sale Pi. 2.4.1. Síntesis de almidón Necesito 2 GAP para la síntesis de almidón, uno en forma de GAP y otro isomerizado a DHAP. Ambos se unen formando la FR1,6-BiP. Una bifosfatasa elimina 1 P pasando a FR 6P. Una isomerasa pasa la fructosa6P a glucosa6P (este ya no es intermediario del ciclo de Calvin). Una mutasa pasa a Glucosa1P, la cual se activa con ATP, pasando a ADP-glucosa y liberando un pirofosfato. A una cadena de glucosas se le van uniendo ADPGlu con Pi, formando el almidón. Este proceso ocurre gracias a la almidón sintasa. El almidón está compuesto por amilosa y amilopectina. La amilosa son moléculas de glucosa sin ramificar (30%) y la amilopectina, glucosas ramificadas (70%). La almidón sintasa que sintetiza las cadenas de amilopectina es soluble en el estroma pero la almidón sintasa que sintetiza la amilosa está anclada al gránulo de almidón. Las almidón sintasa unen glucosa con enlace alfa (1->4). La enzima ramificadora sintetiza las ramas formando los enlaces alfa (1->6). 4 2.4.2. Síntesis de sacarosa (Esquema arriba) Síntesis de otros azúcares: Stevia rebaudiana Planta arbustiva originaria del noreste de Paraguay. Acumula en sus hojas glicósidos diterpénicos de sabor dulce y un poder edulcorante 300 veces superior a la glucosa. A su vez, las hojas contienen un alto valor nutritivo y una alta actividad antioxidante, produciendo una serie de efectos beneficiosos para la salud a través de su consumo. Beneficios Stevia: En personas diabéticas, disminuye los niveles de glucosa en la sangre, en el tratamiento de la obesidad, reduce la ansiedad por la comida y el deseo de ingerir dulces o grasas, diurético suave (ayuda a bajar los niveles de ácido úrico), beneficioso para personas con hipertensión, combate la fatiga y la depresión y edulcorante no calórico y sustitutivo de azúcares en productos alimentarios. 3. Transferencia de energía y poder reductor entre cloroplasto y citosol 1. Translocador de triosas-P/Pi: Exporta ATP y equivalentes de reducción al citosol, y las triosas-P también son precursores de varias rutas metabólicas. Transporta las triosasP dentro y fuera del cloroplasto acoplándolo a transporte de Pi. Al sacar GAP del cloroplasto y oxidar los en el citoplasma, producimos ATP y NADPH para otras rutas de la planta. 2. Translocador de dicarboxilatos: exporta solamente equivalentes de reducción. En el estroma del cloroplasto hay oxalacetato que se puede reducir a malato con gasto de NADPH. Al sacar el malato y oxidarlo, volvemos a producir NADPH. Es un transportador anti-porte; al sacar malato, entra oxalacetato y viceversa. 4. Fotorrespiración La fotorrespiración es un proceso de consumo O 2, producción CO2, en presencia de luz y simultáneo y de signo contrario a la fotosíntesis. La magnitud de este intercambio gaseoso varía con el tipo de planta y la especie. Ej: en plantas C3 (fijan CO2 atmósfera) supone del 25-50% de la fotosíntesis bruta. La Rubisco es bifuncional: cataliza la carboxilación y también la oxigenación de la Ribulosa difosfato en presencia de O2. El proceso de oxigenación produce P-glicerico (3C, que ingresa en el Ciclo de Calvin) y P-glicolato (2C, tóxico) que se regenera a P-glicerico desprendiendo CO2 (Ciclo C2). La planta quiere minimizar la fotorrespiración. El coeficiente de carboxilación/oxigenación en 5 plantas C3 en condiciones normales es 3/1. El proceso de la Fotorrespiración tiene lugar en cloroplastos, en peroxisomas y en mitocondrias. Bioquímica de la fotorrespiración (Ciclo C2: se llama así porque el compuesto que se forma como consecuencia de la actividad oxigenasa es de 2C, el fosfoglicolato). Este ciclo consigue en retirar este compuesto tóxico y recuperar C. 1. Síntesis del fosfoglicolato (en el cloroplasto) por la actividad oxigenasa de la rubisco. Este PGA pasa rápidamente a ácido glicólico, perdiendo el Pi. 2. El glicolato sale del cloroplasto y va al peroxisoma donde reacciona con el oxígeno para dar peróxido de hidrógeno (eliminado por la catalasa) y ácido glioxílico. 3. El ácido glioxílico se transforma en glicina, la cual pasa a la mitocondria para transformarse en serina con una descabroxilación y desaminación, es decir, liberando CO2 y NH3. Está reacción la lleva a cabo la GDC (glicina descarboxilasa). Tras esta reacción queda un grupo metil que se une a una molécula llamada THF y forma metil-THF. Una enzima SHMT (serín-hidroximetil-transferasa) se encarga de coger otra molécula de glicina y transferirle el metil del tetrahidrofolato, formando la serina. 4. Reducción de la serina a glicerato (en el peroxisoma), gracias a la enzima GGT (glutamato-glioxilato aminotransferasa). 5. Reincorporación del glicerato al Ciclo de Calvin como 3PGA (en el cloroplasto). El CO2 producido se libera a la atmósfera y el amoniaco retorna al cloroplasto para incorporarse a aa. *El complejo glicina descarboxilasa (GDC) consta de cuatro subunidades: ·P: Interviene en la descarboxilación ·H: Se relaciona con la transferencia del CH2 ·T: Libera un NH3 ·L: Participa en la transferencia de electrones Reasimilación del amoniaco La producción de amoniaco en la mitocondria durante la fotorrespiración requiere de un ciclo auxiliar para su reasimilación, ya que éste es tóxico y supone una pérdida de nitrógeno por volatilización. Esta reasimilación tiene lugar en el cloroplasto, a través de la acción secuencial de dos enzimas: GS y GOGAT. El NH3 se reasimila en el ciclo GS/GOGAT: glutamato + NH3 + ATP → Glutamina + ADP + Pi glutamina + α-cetoglutarato + 2 fdred → 2 glutamato + 2fdox 4.1. Importancia biológica de la fotorrespiración Consecuencia inevitable de la actividad rubisco: el ciclo C2 funciona para evitar la acumulación del P-glicolato (subproducto inevitable que se forma en mayor o menor proporción dependiendo de la relación CO2 / O2, a mayor concentración de oxígeno, más actividad oxigenasa, y, por tanto, más fotorrespiración) y reciclar la mayor parte del carbono que se perdería por este proceso. Es un proceso que ha perdurado con la evolución, si bien algunas plantas, como las C4, lo han paliado. 6 Mecanismo para reciclar carbono reducido: Las plantas C3 podrían perder carbono en forma de P-glicolato, y el ciclo C2 permite recuperar el 75% del carbono que se perdería de esta forma. Mecanismo de protección contra la fotoinhibición: Con alta intensidad luminosa y alta [O 2] y/o estrés hídrico no se asimila CO2 porque los estomas se cierran para evitar la pérdida de agua, entra menos CO2 a la planta y aumenta la posibilidad de que aumente la actividad oxigenasa de la rubisco. Al consumir O2 en la fotorrespiración se evita formación de especies de oxigeno activadas (EOAs). Por tanto, la fotorrespiración evita el peligro de foto-oxidación del cloroplasto y ayuda a regenerar el sistema de antioxidantes. ➔ Evita el peligro de la foto-oxidación: Existen vías de Generación de EOAs (especies reactivas del oxígeno activadas) cuando hay un exceso de intensidad lumínica, debido a que la cadena electrónica se satura y se ceden e- al O2. 1. Salida de e- del Fotosistema II 2. Inhibición Enzimática: Ferrodoxina NADP oxidoreductasa y Rubisco y resto de enzimas regulables (R) del Ciclo de Calvin (disminuye la formación NADP, aceptor de los electrones). La generación de especies reactivas del O2 (anión superóxido, hidroxilo, peróxido de hidrógeno…) se puede deber a causas como patógenos, senescencia celular, ozono, alta intensidad lumínica… y pueden producir fenómenos de foto-oxidación del cloroplasto, peroxidación de lípidos, oxidación de proteínas, daño y rotura en ácidos nucleicos, inactivación de pigmentos... Por tanto, la fotorrespiración es beneficiosa para disipar el exceso de energía lumínica (gastando ATP y NADPH) y reducir el oxígeno disponible en el medio para la formación de especies reactivas. ➔ Regenera el sistema de antioxidantes Ciclo del ascorbato-glutation: regenera el ascorbato. La fotorrespiración, además del consumo de O 2 en condiciones de estrés, es un proceso determinante en la regeneración del principal compuesto antioxidante de las plantas que es el ASCORBATO en su forma reducida. El glutation tiene forma reducida GSH y forma oxidada formando puentes disulfuro GSSG y ayuda a regenerar el ascorbato. ¿Cómo contribuye la fotorrespiración?: Suministrando sustratos para la aparición y mantenimiento del Ciclo Ascorbato-Glutation. Esta función la realiza gracias a la producción de Glutation (GSH) mediante dos factores: 1. Suministrar sustratos específicos necesarios para la síntesis del GSH, como la glicina. 7 2. Estimulación de la asimilación del SO4 2-, a través de la serina para formar cisteína, el cual es sustrato del GSH. ¿Cómo podemos evitar la fotorrespiración? Aumentar la concentración de C02, usar inhibidores de la glicólico oxidasa, manipular la rubisco por medio de la ingeniería genética para incrementar su actividad carboxilasa y disminuir la oxidasa o añadir nuevas rutas metabólicas por transformación genética. Aún no se ha conseguido ninguna aplicación práctica. La fotorrespiración es muy importante para las plantas C3, que Diferencias Respiración mitocondrial Fotorrespiración incorporan un Intermediarios Son muy distintos CO2 atmosférico Sustrato Piruvato (de reservas) Fosfoglicerato (de fotosíntesis) formando una Descarboxilaciones 2 1 molécula de 3 Consumo de O2 Una reación de consumo 2 reacciones de consumo átomos de C. Orgánulos Mitocondria Mitocondria, cloroplasto y peroxisoma Desprendimiento de NH3 No Sí, uno por ciclo, es refijado Efecto de CO2/O2 No influye Muy influida Balance neto de ATP Genera ATP Consume ATP Efecto de la T Menor influencia Mayor influencia Periodo de actuación Día y noche Día 8  T7 – Fijación fotosintética del CO2: Ciclo C4 y plantas CAM 1. Introducción Si las plantas llevan a cabo la fotosíntesis fijan dióxido de carbono y aumenta su biomasa. Si llevan a cabo la fotorrespiración, se invierte energía en la fijación de oxígeno y posterior detoxificación. En las plantas C4 o plantas CAM han conseguido que la fotorrespiración sea prácticamente nula, generando un entorno alrededor de la Rubisco saturado en CO2. Desde el punto de vista de producción de biomasa, las plantas CAM son más eficientes. Los mecanismos fotosintéticos C4 y CAM se han desarrollado con el fin de cubrir las necesidades de absorción de CO 2 en determinados ambientes, fundamentalmente secos y calurosos. Un problema importante para las plantas es la absorción de suficiente cantidad de CO 2 para la realización de la fotosíntesis. Los estomas (por donde entra el CO2) están localizados en la cara abaxial de la hoja. Para que el CO2 llegue a los cloroplastos, este debe de romper varias resistencias: la capa límite (capa de aire que rodea la hoja), resistencia de la cavidad estomática y resistencia de los espacios aéreos. Por último, encontramos las resistencias de la fase líquida, que es la resistencia que ofrecen las células del mesófilo. Todas estas barreras las debe de superar el CO2 para llegar al cloroplasto. 2. Ciclo C4 2.1. Características morfológicas, tipos y hábitats de los vegetales C4 Características morfológicas Las células del mesófilo (células internas) de las plantas C3 están dispuestas en empalizada. En plantas tipo C4 tienen las células del mesófilo en distribución radial alrededor de las células perivasculares (de la vaina) 1 División de funciones, trayectoria corta de difusión de metabolitos y numerosos plasmodesmos. Células del mesófilo: más pequeñas y con pared celular delgada. Disposición radial y en contacto con los espacios intercelulares del aire. - Cloroplastos: más pequeños, con abundantes tilacoides formando granum. No acumulan almidón. - Enzimas: no ti