Alternatif Yöntemler 2024 PDF

İÜC-HADYEK-DETALAB-Deney Hayvanları Kullanım Kursu (Fare, Sıçan, Tavşan Sertifika Eğitim Programı) Alternatif Yöntemler Dr. Öğretim Üyesi Ataman Bilge SARI İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa Veteriner Fakültesi Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı Alternatif Yöntemler 1...

İÜC-HADYEK-DETALAB-Deney Hayvanları Kullanım Kursu (Fare, Sıçan, Tavşan Sertifika Eğitim Programı) Alternatif Yöntemler Dr. Öğretim Üyesi Ataman Bilge SARI İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa Veteriner Fakültesi Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı Alternatif Yöntemler 1. Ders içeriği 1)Deney hayvan türleri 2) 3R 3)Alternatif yöntemler nelerdir? 4)Neden alternatif yöntemler? 5)Farklı araştırma alanlarında ve eğitimde hayvan kullanımına alternatif yöntemler? 6)Alternatif yöntemleri nasıl taranır? 2 Deney hayvan türleri 3 Deney hayvan türleri 4  3 R İlkesi ve Yerine koyma 3R İlkesi: W.M.S Russell ve R.L. Burch tarafından 1959’da geliştirilen ve baş harflerinden dolayı 3R’ler olarak anılan “Replacement”: yerine koyma, “Reduction”: azaltma ve “Refinement”: arındırma (iyileştirme) ilkelerini, ifade eder. Replacement: (yerine koyma), Deneysel araştırmalarda canlı organizma yerine invitro teknikler, bilgisayar destekli modeller ile veya filogenetik olarak daha düşük bir türdeki canlılarla değiştirilmesi gibi alternatiflerin kullanılmasıdır. Tam alternatif yöntemler, araştırmada hayvan deneyi yapmadan aynı sonuçlara ulaşmayı hedeflemektedir. Kısmi alternatif yöntemler "Mümkün olduğunda filogenetik olarak üst seviyedeki hayvanlar ve alternatif yöntemler ve daha düşük seviye organizmalarla 'değiştirilmelidir’ 5 Alternatif metodlar aşağıdaki durumlarda hayvan kullanımının yerine konulabilir: Tüm bir araştırma programı Program içerisindeki bir proje Bağımsız bir deney Tek bir prosedür Alternatifler, istenen özelliklere sahip aday ilaçları seçmek için in vitro tarama gibi yapılandırılmış bir yaklaşımın parçası olarak kullanılabilir. 6  Alternatif Yöntemler Nelerdir? Kullanılacak deney hayvanı sayısını azaltan (reducement) Deney hayvanlarına eziyet ve stresi azaltan (refinement) Deney hayvanlarının yerine kullanılabilecek (replacement) deney, protokol veya teknolojilerdir. Örnek: hücre kültürü, doku organ banyosu, omurgasızlar veya filogenetik açıdan alt seviyede kabul edilen organizmalar ve bilgisayar teknolojisi , insilico elektronik çip üzerine doku ve organ sistemleridir. 7  Neden alternatif yöntemlere ihtiyaç duyuluyor? -Deneysel araştırmaların artması ve deney hayvanı ihtiyacının artması -Etik değerler ve hayvan haklarının önemi -Teknolojinin gelişmesi sonucu alternatif yöntem seçeneklerinin artması -Gözlem veya uygulamanın tekrarlanabilir olması -Deney hayvan merkezlerindeki maliyetler -Eğitim modellerinde artış Hayvan deneylerinin insanlara uyarlanmaya çalışılmasındaki Yanlış negatiflik Yanlış pozitiflik 8  Neden alternatif yöntemlere ihtiyaç duyuluyor? -Deneysel araştırmaların artması ve deney hayvanı ihtiyacının artması -Etik değerler ve hayvan haklarının önemi -Teknolojinin gelişmesi sonucu alternatif yöntem seçeneklerinin artması -Gözlem veya uygulamanın tekrarlanabilir olması -Deney hayvan merkezlerindeki maliyetler -Eğitim modellerinde artış Hayvan deneylerinin insanlara uyarlanmaya çalışılmasındaki Yanlış negatiflik Yanlış pozitiflik 9  Alternatif yöntem çeşitleri İn vitro testler Hücre külltürleri Kök hücre ile üretilmiş dokular üzerinde toksikoloji deneyleri (İnsan ve insandan elde edilen materyaller) Doku ve organ banyoları Omurgasız hayvanlar Mikroakışkan çip testleri Mikrodoz ugylamaları Doku ve organ şeritleri Mikroorganizmalar Embriyolu yumurta Bitkiler Modeller Filmler, interaktif videolar Matematiksel modellemeler İn siliko teknikler Bilgisayar modelleri ve simülasyonları 10  Alternatif Test Sistemleri 1 Omurgasızlar ve mikroorganizmalar Omurgalıların erken gelişimsel evren (embriyolu tavuk yumurtası) Hayvan hücreleri, dokular ve organlar İnsan gönüllüler ve bağışlanan insan dokuları 11  Alternatif Test Sistemleri İnsan ”çip üzerindeki organ" Bilgisayar modelleri 12  Omurgasızların kullanımı Temel biyolojik fonksiyonları veya etkileri incelemek için bir omurgalı modeller yerine omurgasız canlıların kullanımı Örnek; Drosophila (meyve sineği), Dictyostelium (küf) ve nematod solucanlar Nörobiyoloji - Alzheimer, epilepsi ve nörodejenerasyon araştırmalarında kullanılmaktadır. Bakteriler(Ames testi), maya ve Drosophila, kimyasalların ve genetik toksisitesini incelemek için kullanılır 13  EĞİTİM MODELERİ Bilgisayar programları, Anatomik yapılar, Fizyolojik sistemler, Eğitim amaçlı materyaller (animasyon vb) 14  MEDİKAL MAKET VE MODELLER VE SİMÜLASYONLAR Öğrenciler ve araştırmacılar için yeni bakış açıları sağlarlar. Yeni yöntemlerin, uygulamaların ve cihazların öğrenilmesinde büyük kolaylıklar sağlarlar. Fiziksel olarak gerçeğe çok yakın bir model, fizyoanatomik olarak da aslına yakın bir simülasyon görünümü oluşturur. Kullanım spektrumları çok geniştir. 3-d printer sayesinde üretimleri kolaylaşmaktadır. 15 16  Gönüllü İnsan Araştırmaları Tüm etik hususlar ele alındığı sürece insan gönüllüleri veya insan dokusu üzerinde birçok deney türü yapılabilir. Örneğin; Mikrodozlama Non-invasif görüntüleme Diyet araştırmaları Ağrı araştırması İnsan hücreleri veya doku kültürü 17  İÜC-HADYEK-DETALAB-Deney Hayvanları Kullanım Kursu (Fare, Sıçan, Tavşan Sertifika Eğitim Programı) Dinlediğiniz için teşekkürler Araş. Gör. Dr. Ataman Bilge SARI İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa Veteriner Fakültesi Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı [email protected]  Alternatif yöntemlerin araştırılması Alternatiflerini literatürde tarama Konu spesifik literatür: Örn: Pubmed, Toxnet, Agricola MESH "Animal Use Alternatives"[Mesh] Arama ile ilgili rehber e.g. Altweb, CCAC, NC3Rs Alternatif veritabanları: e.g. Go3R, AnimAlt-ZEBET, NORINA Notlar kısmında web sayfaları yer almaktadır. 19  Alternatif yöntemlerin araştırılması Diğer Bilgi Kaynakları Özel dergiler Alternatives to animal experimentation Altex https://www.altex.org/index.php/altex Alternatives to Laboratory Animals Atla journal https://journals.sagepub.com/home/atl Arrive rehberler (Türkçeleri de mevcut) https://arriveguidelines.org/arrive-guidelines 20 1. DERS 2. kısım 21  IN VİTRO YÖNTEMLER HÜCRE KÜLTÜRLERİ Primer hücre kültürleri Kalıcı hücre hatları (cell-line) Tümör hücre kültürleri Doku-organ kültürleri Hücre kültürü besi yerleri içerisindeki aminoasit, k.hidrat, vitamin ve iyonlarla hücre gelişimini desteklerler.  Primer hücre kültürleri Doğrudan elde edilen hücre kültürleridir Elde edildikleri dokunun özelliğini taşırlar Organlardan elde edilmiş hücreler veya periferal kan hücreleri Karışık hücre gruplarına sahiplerdir 3. pasajdan sonra stabil ve homojen Ana doku özelliğine sahip 35 pasaj yapılabilir  Kalıcı hücre hatları (cell-line) Hücre hatları; primer hücrelerin spontan mutasyonu, kimyasal madde uygulanması ile mutasyon oluşturularak elde edilen ölümsüz hücre tipleridir. 70-80 kere pasajlanmış, kromozom analizleri ve diğer hücresel özellikleri iyi tanımlanmış homojen hücre popülasyonlarıdır. -Tek bir hücreden üretilmiş klonal hücre hatları da vardır. -Uygun kültür ortamlarında neredeyse limitsiz yaşayabilirler. -Organa özgü fonksiyonlarını kaybetmişlerdir, yalnız hücre özellikleri vardır. -Ticari olarak satın alınabilirler. Hücre kültürü nasıl ortaya çıktı?  Kanser hücre hatlar -Ölümsüzdür ? -Özgül organlardan alınan tümör hücreleri organa özgü fonksiyonlarını kaybetmişlerdir. -Tek tabakalı (Monolayer) hücre tümör kültürleri -Üç boyutlu solid tümörleri için multisellüler tümör sferoidleri geliştirilmiştir -Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) ve Avrupa Hücre Kültür Koleksiyonu (EACC) hücreler için ana kaynaklardır ve 80 farklı türe ait 4000’den fazla hücre kültürünü bünyesinde barındırmaktadır.  Hücre Doku kültürünün kullanım alanları -Aşı üretimi ve aşı etkinlik testleri -Monoklonal antikor üretimi -Doku mühendisliği çalışmaları -Toksisite testleri -Pirojenite testeri -Kozmetik testler -Hücre fizyolojisi deneyleri -Kök hücre çalışmaları -Üreme teknikleriyle ilgili çalışmalar (tüp bebek – in vitro fertilizasyon çalışmaları gibi) -Embriyonik araştırmalar -Sitogenetik araştırmalar -Hücresel yaşlanma çalışmaları -Tümör hücreleri ve ilgili ilaç çalışmaları  Doku - organ kültürleri -Mezbahalar ve ameliyathaneler -Histolojik özelliklerini korurlar -İzole doku ve izole organ çalışmaları, sistemik etkiler olmaksızın biyolojik modeller üretme imkanı sağlar. -Veri toplamak daha kolaydır. -Kontrollü değişiklikler daha kolay yapılır -Transgenik hayvanla, patolojik ya da genetik özellikleri tanımlamada kullanılır. O Organ veya doku şeritleri İzole organ banyosu ve kayıt sistemi: -Deney hayvanlarından, mezbahalardaki organ atıklarından, hatta insanlardan (örneğin sezaryen sırasında uterus parçası, plasenta alınması) elde edilen dokular kullanılır. -Organizmadaki ekstraselüler ortamın iyi bir kopyasıdır (pH, elektrolitler, sıcaklık, gaz içeriği vb.) -Düz kas dokusu bulunan hemen bütün organların işlevleriyle ilgili uygulama yapmaya imkan verir. -Doku şeritleri (strip), genellikle in vivo ortamdakine benzer davranış sergilerler. -Çoklu gruplu denemeler için oldukça fazla materyal sağlarlar ve tekrar tekrar kullanılabilirler. -Kolay ve hızlı sonuç verirler. -Personel, zaman ve kimyasal madde tasarrufu sağlarlar. İzole organ banyosu  Alternatif Organizmalar ZEBRAFISH Danio rerio Keith Chang ve Leonard Zon  EMBRİYOLU YUMURTA -Erken embriyonik gelişme -Toksikoloji -Serolojik deneyler için antijen hazırlanması -Hücre içi mikroorganizmaların üretimi  Embriyolu tavuk yumurtasına ekim -Sarı keseye 6-8 günlükken -Amniyotik keseye 7-14 günlükken -Allantoik keseye 9-10 günlükken -Korioallantoik membrana 9-12 günlükken ekim yapılır.  OMURGASIZLAR -Süngerler -Solenterler (mercan, hidra, denizanası) -Solucanlar (yassı, yuvarlak, halkalı) -Yumuşakçalar (istiridye, midye, ahtapot, salyangoz, mürekkep balığı) -Eklem bacaklılar (kelebek, örümcek, böcek) -Derisidikenliler (deniz yıldızı, deniz kestanesi) Tercih edilme nedeni basit bir sinir sistemine sahip olmaları ve ağrı hissetmemeleridir.  Sık kullanılan omurgasızlar Drosophila melanogaster – meyve sineği (İnsanla %50 gen ortaklığı var) – kas hücreleri çok geniş olduğundan voltaj klamp ve nöromusküler bağlantıdaki elektrofizyolojik çalışmalarda sinaptik fizyoloji modeli olarak kullanılmakta. Caenorhabditis elegans – nematod (İnsanla %42 gen ortaklığı var) – kanser araştırmalarında kullanılmakta. Drosophila melanogaster D. melanogaster uygulama alanları Caenorhabditis elegans. "Caenorhabditis bir nematoddur. İPLİK KURDU 1 mm uzunluğundadır ve çok kısa bir yaşam döngüsüne sahiptir. 2-3 haftadır. Embriyogenez 12 saat, 2.5 gün içinde yetişkin bir form gelişir. Şeffaf, genetik olarak uygun ve basit hücresel karmaşıklığa sahiptir. Bir model olarak C. elegans, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalıkları gibi çeşitli nörolojik bozuklukları incelemek için kullanılmıştır; çeşitli bağışıklık bozukluklarının yanı sıra kanser, diyabet. TRANSGENİK BİTKİLER  MİKROORGANİZMALAR Salmonella Typhimurium -Ames testi (mutajenite/karsinojenite testi)  Saccaromyces cerevisiae Bira mayası Hızlı büyür, genetiği bilinir, mutantlar izole edilebilir. Çekirdek, mitokondri gibi organeller ile memeli hücrelerinin işlevlerini taklit eder Hücre ölümü kanser çalışmaları Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalıkları gibi nörodejeneratif hastalıklarda hücresel biyolojinin temel yönlerini anlamaya yardımcı olur  Bilgisayar destekli alternatif yöntemler İn-silico Bilgisayar Destekli İlaç Tasarımı (Computer Aided Drug Design) (CADD) İlaç molekülü- reseptör bağlanma bölgesi Docking Yapı Etkinlik İlişkisi (SAR) (QSAR)  Alternatif Yöntemler Göz İritasyonu: 1944 yılında John F. Draize adlı bilim insanı, kimyasalların göz iritasyonunu değerlendirmek için Draize testini geliştirmiştir. Bu yönteme göre tavşanların iki gözünden birisi kimyasala maruz bırakılır. Diğer göz kontrol olarak kullanılır ve tavşan 14 güne kadar gözlemlenir. Alternatif mukoz membran (göz) iritasyon/korozyon testleri: A- Yeniden Yapılandırılmış İnsan Kornea Benzeri Epiteli, test edilen kimyasalın sitotoksisite oluşturma kabiliyetinin değerlendirildiği bir yöntemdir  Alternatif Yöntemler Akut Toksisite: Akut toksisite testlerinde, hayvanlar kimyasal maddelere ağız, cilt ve solunum yolu ile maruz bırakılırlar. Bu testlerde genellikle LD50 (hayvanların yarısını öldürmeye yetecek doz) miktarı belirlenir. Bu LD50 dozu bulmak artık çok sık kullanılmamakla birlikte hala hayvanların ölümüne yol açan metotlar kullanılmaya devam edilmektedir NHK (normal human keratinocyte) bazal sitotoksisite yöntemi, in vivo akut oral toksisite testleri için başlangıç dozlarını tahmin etmek için insan hücrelerini kullanır ve her test için kullanılan hayvan sayısını azaltır. 3T3 (hücre hatları) bazal sitotoksisite testi: her prosedürde kullanılan hayvan sayısını en aza indiren bir azaltma yöntemidir.  Cilt Tahribatı ve İritasyonu Cilt tahribat testleri bir bileşenin cilt üzerinde yaptığı geri dönüşümsüz tahribatı saptamak için kullanılır. Cilt tahribat testleri, bileşenin cilt üzerinde neden nolduğu kaşınma, şişme ve enflamasyonu belirlemek için kullanılır. Her iki test de tipik olarak tavşanlar üzerinde uygulanır. Cilt tahribat ve iritasyon testleri için onaylanmış aşağıdaki metotlar kullanılabilmektedir: A- EpiSkin TM B- Değiştirilmiş Epiderm TM Deri İritasyon Testi (SIT) C- SkinEthicTM Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi D- EST-1000 E- EpiDermTM  Cilt Duyarlılığı Cilt duyarlılığı testleri, bir kimyasalın alerjik reaksiyona yol açıp açmayacağının belirlenmesi için kullanılır. Genellikle guinea pig’lerin traşlanmış ciltleri üzerinde uygulanırlar. Doğrudan Peptid Reaktivite Ölçümü: Bu yöntemle, cilt duyarlılığının tetiklenmesinde belirleyici bir basamak olan kimyasalların proteinlerle tepkime verme kabiliyeti ölçülür. Keratinositlerin aktivasyonu ölçülerek bir Nrf2 regülatörü olan Keap1’e ait sistein kalıntılarıyla duyarlılaştırıcı maddenin direkt reaktivitesi belirlenir. İnsan Hücre Dizisi Aktivasyon Testi: THP-1 hücrelerinde CD86 ve/veya CD54 ekspresyonunun artırılmasına dayalı bir yöntemdir.  Farmakokinetik/Toksokinetik ve Metabolizma Farmakokinetik/toksokinetik testler bileşenlerin emilim, dağılım, metabolizma ve uzaklaştırılma hızlarını/oranlarını ölçer. Bazı kimyasallar metabolizma tarafından inaktive edilirken bazıları metabolize olduktan sonra toksik hale gelir. Hayvanlar, genellikle fareler ve sıçanlar, tekli veya çoklu dozlarda test bileşenini yemeye, inhale etmeye zorlanarak veya damardan ya da ciltten bileşene maruz bırakılır. Fototoksisite (fotoiritasyon) ve fotoduyarlılık: 3T3 nötral kırmızı alım fototoksisite testi, test edilen bir kimyasalın UV/görülebilir ışığın sitotoksik olmayan dozuna maruziyet söz konusuyken veya değilken sitotoksisitesinin karşılaştırmasına dayalı valide edilmiş bir in vitro test metodudur  Dermal Penetrasyon (nüfuz etme) Cilt penetrasyonu ya da deri emilim testleri, bir kimyasalın ciltten içeri girişi ve kan dolaşımına katılmasını analiz eder. Test edilen kimyasal verildikten sonra sıçanlar öldürülür ve emilen kimyasalın miktarı belirlenir. Insanlar ve sıçanların farklı cilt yapıları vardır ve bu farklılıklar emilimlerin de farklı olmasına yol açar. Dolayısıyla hayvanlar üzerinde yapılan dermal penetrasyon testleri insanlarda güvenilir değildir. Alternatif mevcuttur  Mutajenisite Bir mutajen, bir organizmanın genetik bilgisini değiştiren ve böylece mutasyonların sıklığını artıran fiziksel veya kimyasal bir ajandır. Birçok mutasyon kansere neden olduğundan, mutajenler tipik olarak aynı zamanda kanserojendir. A. Bakteriyel ters mutasyon testi (Ames testi) B. B- Invitro memeli hücresi gen mutasyon testi Kanserojenlik Kanserojenler, kansere neden olan veya kanser vakalarını artıran bir madde veya maddeler karışımıdır. Sıçanlar ve fareler tipik olarak karsinojenliği test etmek için kullanılır. Test kimyasalları oral yolla verilir, cilt üzerine yerleştirilir veya iki yıllık bir süre içinde solutulunur. Çalışma boyunca hayvan sağlığı izlenir ancak çoğu bilgiler hayvanlar öldürüldükten sonra elde edilir. Bileşik kronik toksisite/karsinojenite testi: Genotoksik olan ve olmayan karsinojenler tespit edilir. Hücre Transformasyon Testi (CTA: Cell Transformation Assay): Çok aşamalı kanser sürecinde bir aşama olan hücre morfolojisindeki değişiklik ölçülür  Üreme ve Gelişme Toksisitesi Üreme toksisitesi, bir maddenin bir organizmanın üreme kabiliyeti ve yavruların gelişimi üzerine olan toksik etkileri içerir. Gelişimsel toksisite testi, hamile hayvanlara, genellikle fareler ve tavşanlara, oral yoldan verilen kimyasalları vermeyi içerir. Tam embriyo kültürü (WEC) testi MicroMass (MM) testi, Embriyotoksik kök hücre testi (EST). MicroMass ve Embriyonik kök hücre testi, ESAC (european scientific advisory comitee- Avrupa bilimsel öneri komitesi) tarafından bilimsel olarak geçerli kabul edilmiştir.  Endokrin bozucu aktivite Endokrin bozucusu, endokrin sistemin fonksiyonlarını değiştirerek sağlıklı organizmada ya da onun neslinde veya (alt) populasyonlarında istenmeyen sağlık etkilerine sebep olan harici bir madde ya da karışımdır. OECD tarafından hazırlanan ilgili kılavuzda iki adet yöntem bulunmaktadır. Bunlar: A- Östrojenik Agonist (ve Antagonist) Aktivite B- LUMI-CELL östrojen reseptör transkripsiyonel aktivite çalışması